Von einem 2DE-Gel-Spot die Proteinfunktion: Lektion gelernt von HS1 in chronischer lymphatischer Leukämie

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das zwei Paare Proteom-Techniken, nämlich 2-dimensionale Elektrophorese (2DE) und Massenspektrometrie (MS), differentiell zwischen zwei oder mehr Gruppen von Primärproben ausgedrückt identifizieren / post-translationale modifizierten Proteinen. Dieser Ansatz, der zusammen mit funktionellen Experimenten ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von Prognosemarkern / therapeutische Ziele.

Zusammenfassung

Die Identifizierung von Molekülen in der Tumorprogression beteiligt Initiierung und ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Biologie und Erkrankung als Folge, für die klinische Behandlung von Patienten. In der vorliegenden Arbeit werden wir eine optimierte proteomischen Ansatz für die Identifizierung von Molekülen in der Progression der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) beteiligt zu beschreiben. Im Einzelnen werden leukämischen Zell-Lysaten durch 2-dimensionale Elektrophorese (2DE) gelöst und als "Flecken" auf der 2DE Gelen visualisiert. Vergleichende Analyse von Proteom-Karten ermöglicht die Identifizierung von differentiell exprimierten Proteine ​​(in Bezug auf die Fülle und post-translationale Modifikationen), die abgeholt werden, isoliert und identifiziert durch Massenspektrometrie (MS). Die biologische Funktion der identifizierten Kandidaten kann durch verschiedene Assays (dh Migration, Adhäsion und F-Aktin-Polymerisation) getestet werden, dass man für die primäre Leukämiezellen optimiert wurden.

Einleitung

Chronische lymphatische Leukämie (CLL), der häufigsten Leukämie bei Erwachsenen in den westlichen Ländern, ergibt sich aus der Akkumulation von monoklonalen Tumor CD5 ⁺ B-Lymphozyten und ist klinisch sehr heterogen. Es kann als ein Pre-Leukämieform, die als monoklonale B-Zell-Lymphozytose (MBL) ^1,2,3 vorliegen. In anderen Fällen kann die Krankheit erscheinen entweder mit einem indolenten klinischen Verlauf, dass über Jahre stabil bleiben, bevor eine Behandlung benötigen kann, oder als progressive Erkrankung mit chemorefractory düstere Prognose trotz Therapie. Schließlich kann es in eine tödliche häufig hochgradige Lymphom (Richter-Syndrom-RS) ^2,3,4 Fortschritt. Gute und schlechte Prognose, basierend auf einer Reihe von prognostischen Faktoren, die ergänzende Informationen zu Prädiktoren der Krankheitsverlauf und die Überlebens bietet: Die Patienten werden in der Regel in zwei Hauptuntergruppen klassifiziert. Klinische Heterogenität spiegelt wahrscheinlich biologische Heterogenität. Eine Reihe von genetischen, Mikroumgebung und CEllular Faktoren wurde gezeigt, dass auf Pathogenese stimmen aber keine einheitliche Mechanismen wurden ^5. Im Einzelnen haben mehrere Studien gezeigt, dass Unterschiede in den klinischen Verlauf der Krankheit kann teilweise durch das Vorhandensein (oder die Abwesenheit) von einigen biologischen Markern, die einen prognostischen Wert haben ^6,7,8 erläutert. Diese Daten zeigten, dass ein besseres Verständnis der Krankheit Biologie könnte zusätzliche Hinweise für die klinische Behandlung der Pathologie liefern, durch die Identifizierung von sowohl prognostische Marker und therapeutischer Targets.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu zeigen, wie eine Kombination von verschiedenen proteomischen Techniken für die Identifizierung von Proteinen in CLL Entstehung und Progression beteiligt sind, verwendet werden. Unser Ansatz zeigt, dass es möglich ist, gemeinsam Grund Proteom-und klinischen Daten ⁵ verbinden.

In der vorliegenden Workflow, primäre Leukämiezellen von Patienten ausgewählt(Gut vs schlechte Prognose) werden isoliert und Zelllysaten werden dann verwendet, um Proteom-Karten zu erhalten. 2DE erlaubt die Charakterisierung der proteomischen Profil einer Zellpopulation, einschließlich post-translationale Modifikationen, wodurch indirekt Informationen über die biologische Aktivität des jeweiligen Proteins. Ganzzell-Lysate werden durch eine erste Dimension laufen, bezogen auf den isoelektrischen Punkt gelöst, gefolgt von einer zweiten Dimension auf einem Polyacrylamid-Gel, das Proteine ​​löst auf der Grundlage ihres Molekulargewichts führen. Vergleichende Analyse der Proteom-Karten ermöglicht die Identifizierung der differenziell exprimierten Proteine ​​(sowohl in Bezug auf Menge und posttranslationale Modifikationen) als Punkte auf dem Gel ausgeschnitten und durch Massenspektrometrie analysiert werden können. Die Rolle der einzelnen Kandidaten kann dann durch verschiedene Tests genutzt werden.

Dieser Ansatz, der CLL in der aktuellen Manuskript beschränkt, kann leicht auf andere Krankheiten / Proben erweitert werden, damit die Bereitstellung von Informationen über die proteomic / biologischen Unterschiede zwischen beiden Gruppen (dh pathologische vs normal, nicht stimulierten vs Wildtyp vs Zuschlags stimuliert).

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Protokoll

HINWEIS: Alle Gewebeproben wurden mit Zustimmung der Ethikkommission des Krankenhauses San Raffaele (Mailand, Italien) erhalten.

1. Menschengewebeproben und Zellreinigung (Abbildung 1)

HINWEIS: Leukämie-Lymphozyten wurden aus peripherem Blut (PB) von CLL-Patienten nach Mulligan et al, ⁹ diagnostiziert.

1.1) von Leukämiezellen Trennung von PB

1. Sammeln PB in Vacutainer Blutentnahmeröhrchen mit Heparin-Natrium.
2. Übertragen Blut in ein 15-ml-Tube und füge menschlichen B-Zell-Anreicherung Cocktail bei 50 ul / ml Vollblut. Gut mischen und Inkubation 20 min bei Raumtemperatur.
3. Verdünnen Probe mit dem gleichen Volumen PBS + 2% FBS, vorsichtig mischen und vorsichtig Overlay Blut über Ficoll, was sicher nicht, um die Schnittstelle zu brechen. Verwenden Sie mindestens 1 Teil Ficoll zu 2 Teilen der verdünnten Probe (dh 4 ml Ficoll + 10 ml Blut in einem 15 ml tube).
4. Zentrifuge bei 400 × g bei Raumtemperatur (20 ° C) für 20 min ohne Bremse. Mononukleäre Zellen an der Grenzfläche ist.
5. Sorgfältig absaugen Schnittstelle, um die Zellen zu gewinnen und in einen neuen Schlauch. Waschen Zellen einmal mit PBS und Zentrifugation bei 300 × g, 4 ° C im Dunkeln für 5 min. Das Pellet wird am unteren Rand sein.
6. Überstand verwerfen. Das Pellet in dem verbleibenden Überstand Dazu den Schlauch hin und her mit den Fingern. Verdünne das Pellet mit 10 ml vollständigem RPMI-Medium (RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum und 15 mg / ml Gentamicin) und zähle die Zellen unter Verwendung von Trypan-Blau-Ausschlussverfahren.

1.2) Reinheit Bewertung

HINWEIS: Die Reinheit aller Zubereitungen muss immer oberhalb von 99% liegen.

1. Inkubieren 100 ul gereinigte Zellsuspension mit den folgenden Antikörpern (im Handel erhältlich, siehe Tabelle der Materialien): CD3 _FITC (5 ul / test), CD14 _PE (5 ul / Prüfung), _CD19-ECD (6 ul / Test), CD16-CD56 _PC5 (2 ul / Test), CD5 _PC7 (4 ul / Test), für 20 min bei 4 ° C in eine FACS-Röhrchen.
2. Die Probe mit 4 ml PBS (Zentrifuge für 5 min bei 300 g) waschen und überprüfen Sie die Reinheit durch Strömungs cytometry.Check in der Handlung den% der CLL-Zellen (> 99%), die CD19 und CD5 auf ihrer Oberfläche als Co-express (6) in 1 gezeigt. Stellen Sie sicher, dass die Vorbereitungen sind praktisch frei von NK, T-Lymphozyten und Monozyten durch die Überprüfung der% der CD3, CD14 und CD16-56 in der Handlung, die in der Nähe von Null sein sollte.

1.3) Die Proben Lagerung

1. Für proteomische Studien, erheben 25 x 10 ⁶ Zellen in einem 1,5-ml-Röhrchen, Zentrifuge Zellen bei 300 g für 10 min, Überstand verwerfen und lyophilisiere Pellets 4 Stunden. Halten bei -80 ° C bis zur Verwendung.
2. Zur Validierung Assays Zellen in komplettem RPMI (Menge hängt von der weiteren Test, der istgewählt) und fahren Sie mit Schritt 4.

2. Zweidimensionale Elektrophorese (2-DE) (Abbildung 2)

2.1) Isoelektrofokussierung (IEF)

1. Solubilisierung CLL-Zellen-Pellets mit einem Endvolumen von 380 ul 2-DE-Puffer (344 ul einer Lösung RBthio (9 M Harnstoff, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 30 ul 65 mm DTT, 6 ul 2% IPG-Puffer Ampholin pH-Wert 4-7).
2. Gelten Proteinproben (1 mg) zu 18 IPG-Streifen (pH 4-7) und führen Sie folgende IEF Standard-Protokoll wie von Conti et al. ¹⁰
3. Äquilibrieren Streifen in 2 ml Äquilibrierungspuffer (EB: 50 mM pH 8,8 Tris-HCl-Puffer, der 6 M Harnstoff, 30% Glycerin, 2% SDS), ergänzt mit 2% der frischen DTT für 15 Minuten bei RT. Verwerfen EB + DTT und 2 ml EB ergänzt mit 2,5% Iodacetamid. Inkubieren für 15 min bei RT auf einem Schaukelplattform.

2.2) SDS-PAGE

1. Trocknen Sie die Streifen auf einem Papier ohne Berührung des Gels zu entfernenDer Überschuss der EB. Laden jeden Streifen auf einem 9-16% Gradienten-SDS-PAGE-Gel. Hinzufügen eines kleinen Volumens von SDS-Elektrophorese-Puffer (Tris 25 mM, Glycin 192 mM, SDS 0,1% w / v) auf der Oberseite des Gels, um das Laden des Bandes zu erleichtern.
2. Dichten Sie das Gel durch Zugabe von ~ 5 ml Agar-Lösung (0,8%) schwimm des Streifens zu verhindern, dann die elektrophoretische Einheit montieren und füllen mit SDS-Elektrophorese-Puffer. Führen der Lauf bei 60 mA / Gel 4 Stunden bei 4 ° C ist.
3. Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophorese-Einheit und legen Sie sie in der richtigen Färbung-Box.

2.3) Silberfärbung für die präparative Gel

FIXER	50% Methanol 12% Essigsäure 0,05% Formalin	2 Stunden (oder über Nacht) *
WASH BUFFER	35% Ehanol	20 min (dreimal wiederholen Sie den Schritt)
Sensibilisierung	0,02% Natriumthiosulfat	2 min
WASH	H 2 O	5 min (dreimal wiederholen Sie den Schritt)
SILVER NITRAT	0,2% Silbernitrat 0,076% Formalin	20 min
WASH	H 2 O	1 min (zweimal wiederholen Sie den Schritt)
DEVELOPER	6% Sodium Carbonate 0,0004% Natriumthiosulfat 0,05% Formalin	Bis die Färbung ausreichend ist,
Aufhören	50% Methanol	30 min
	* 2 Stunden ist die minimale Zeit für die Protein Fixierung erforderlich

Tabelle 1.

HINWEIS: Protein-Spots kann durch Färbung Gele mit MS-kompatiblen Silberfärbung ¹¹ visualisiert werden. Alle Lösungen erforderlichfür die Silberfärbung sind in Tabelle 1 aufgeführt.

1. Bereiten Sie etwa 200 ml jeder Lösung / Gel und gehen Sie wie in Tabelle 1 angegeben. Jede Lösung der Färbung Feld mit dem Gel vorsichtig hinzuzufügen. Führen Sie alle Inkubationen auf einem Schaukel Plattform.
2. Nach der Färbung, entfernen Sie die Stopp-Lösung und lassen Sie das Gel in einer Lösung von 1% Essigsäure, bis die Erfassung.

2.4) Gel-Akquisition und Analyse

1. Erwerben Sie Bilder mit einer hohen Auflösung mit einem Densitometer innerhalb von 3 Tagen von der Färbung.
2. Analyse 2-D-Proteinmustern unter Verwendung von Software für die 2-DE Gelen.
   Hinweis: Die Software ermöglicht eine schnelle und zuverlässige Bildvergleich.
   1. Erstellen Sie ein Projekt, indem Sie "ein neues Projekt erstellen" aus dem Kontextmenü. Erstellen Sie einen Ordner und die Gele importieren, indem Sie "Import-Gel-Bilder" mit TIF, PNG. oder .gel Erweiterung.
   2. Nachdem die Gele werden importiert und auf den worksp hinzugefügtAss, führen Sie eine automatisierte Spot Detection, indem Sie die Gele für Spot-Erkennung und Auswahl von "Bearbeiten> Ort> erkennen" im Menü.
   3. Als nächstes führen Sie eine Hintergrundabzug, indem Sie aus dem Menü "subtrahieren Hintergrund". Hinweis: Danach ist es möglich, mehrere Gelen zu vergleichen und Unterschiede oder Ähnlichkeiten durch quantitative und / oder qualitative Analyse zu erfassen.

3. Proteinidentifizierung mittels MALDI-TOF MS-Analyse (Figur 3)

3.1) Proteinverdauung

1. Spülen Sie das Gel mit Wasser und Verbrauch Flecken von Interesse aus Gelen entweder durch manuelle (Schneiden mit einem sauberen Skalpell) oder durch automatische Exzision.
2. Waschen Gel-Teilchen mit Wasser (100-150 ul), Spin-down (30 s bei 400 × g) und entfernen Sie die Flüssigkeit.
3. Das gleiche Volumen (je nach Gelvolumen) von CH ₃ CN zu den Gelstückchen und warten 10-15 Minuten, bis die Gelstücke schrumpfen. Trocknen Sie die Gel-Teilchen ina Vakuumzentrifuge.
4. Fügen 75-100 ul 10 mM Dithioerythritol in 50 mM NH ₄ HCO ₃ verdünnt und Inkubation für 30 min bei 56 ° C (Reduktionsschritt). Schrumpfen wieder die Gel-Stücke mit CH ₃ CN, wie in Schritt 3.1.3 beschrieben.
5. Weiter mit Alkylierung durch Zugabe von 75-100 ul einer Lösung, 55 mM Iodacetamid, verdünnt in 50 mM NH ₄ HCO ₃ und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
6. Schrumpfen die Gel-Stücke noch einmal mit CH ₃ CN mit genügend Volumen, um das Gel Stücke abdecken, wie in Schritt 3.1.3 beschrieben. Trocken in einer Vakuumzentrifuge.
7. Rehydrieren der Teilchen in einem Puffer mit 25 mM NH ₄ HCO _3, 5 mM CaCl _{2 und 12,5 ng /} ul Trypsin bei 4 ° C für 20 min. Verwenden Sie ausreichend Puffervolumen, um die Gel-Stücke zu decken. Entfernen Sie die un-absorbiert Stand von den Gel-Stücke und fügen Sie 25 mM NH ₄ HCO _3, 5 mM CaCl ₂ ohne Trypsin zu cover das Gel.
8. Lassen Proben bei 37 ° C mindestens 3 Stunden (die minimale Zeit für die Peptidverdauung erforderlich) über Nacht.

3.2)-Massenspektrometrie-Analyse (Getrocknete Tröpfchentechnik)

1. Spot 1 ul-Aliquot jeder Probe auf eine Edelstahlplatte MALDI und mischen mit 1 ul α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure als Matrix, in 50% CH ₃ CN und 0,1% TFA hergestellt.
2. Massenspektren zu erhalten, auf einem MALDI-TOF-Massenspektrometer. Akkumulieren etwa 200 Spektren pro Spot, die Anpassung der Laserintensität an Signalsättigung zu verhindern oder um das Signal zu erhöhen. Prozess-Spektren über Daten-Explorer-Software wie unten beschrieben:
   1. Importieren Sie die DAT-Datei und führen Sie die Basislinienkorrektur, indem Sie "Prozess> Basislinienkorrektur". Kalibrieren Massen mit den Trypsin Autolyse Produkte und Matrix Spitzen, indem Sie "Prozess> Massenkalibrierung> manuelle Kalibrierung; Wählen Gipfel in der Nähe von m / z 855,1 und 2163,1 by links verschieben, und wählen Sie die entsprechenden Bezugsmassen, klicken Sie dann auf "Handlung" und "Kalibrierung anwenden" im Handbuch Kalibrierungsfenster.
   2. Stellen Sie die Schwelle für Spitzenerkennung ("peak> Spitzenerkennung"), duplizieren Sie die aktive trace ("Anzeige> Duplizieren aktive Trace"), wählen Sie die neue Spur und führen Sie die deisotoping ("peak> deisotoping"). Mit dem Makro "getpeaklist", erzeugen eine Liste der Massen für die Identifizierung verwendet werden. Falls erforderlich, manuell Rauschsignale als Peaks, um die Liste zu reinigen und eine bessere Identifikation abgeholt entfernen.
3. Identifizieren Proteine, die von der Suche nach einem umfassenden nicht-redundanten Proteindatenbank mit tiefen und Maskottchen als ¹² Suchmaschinen.
   1. Verwenden Sie die folgenden Parameter in allen Suchanfragen: eine verpasste Spaltung pro Peptid, Methionin-Oxidation als variable Modifikation, Cystein Carbamidomethylierung als feste Modifikation und einer Initial Massentoleranz von 50 ppm.

4. Cytoskeletal Aktivitätstests (Abbildung 4)

HINWEIS: Die Zellen in Schritt 1 in komplettem RPMI (10 ⁶ Zellen / 200 ul) gereinigt.

4.1) Migration Assay. Dieser Test ermöglicht die Quantifizierung der Migrationsfähigkeit der untersuchten Zellen (Lymphozyten). Verwenden Sie ein Transwell-Kammer von 6,5 mm Durchmesser und 5,0 um Porengröße und führen den Test in dreifacher Ausfertigung. Optimierung der Porengröße und der Wanderungszeit (Schritt 4.1.3) im Fall von verschiedenen Zelltypen.

1. Bereiten Sie die untere Kammer durch Zugabe von 600 ul vollständigem RPMI mit oder ohne bestimmte Reize (dh SDF-1), um die induzierte und spontane Migration bzw. messen.
2. Legen Sie die obere Kammer auf sie und lassen Sie das System ins Gleichgewicht für 30 Minuten bei 37 ° C in den Brutschrank.
3. Samen 10 ⁶ Zellen / 200 ul in die obere Kammer (Gesamtzellzahl) und inkubierendie Platte für 4 Stunden bei 37 ° C im Brutschrank.
4. Entfernen Sie die obere Kammer, sammeln Sie die Medien in der unteren Kammer und die untere Kammer waschen einmal mit 1 ml PBS. Sammeln Sie die PBS in die Röhre.
5. Zentrifuge 5 Minuten bei 300 g, den Überstand verwerfen und resuspendieren in 500 ul PBS.
6. Durch Durchflusszytometrie, zählen die Anzahl der migrierten Zellen nach 1 min des Erwerbs. Im Fall einer isolierten Zellpopulation ist es nicht notwendig, irgendeine Oberflächen-Antikörper hinzuzufügen. Überprüfen Sie die Anzahl von Zellen in einem zweidimensionalen Punktediagramm unter Berücksichtigung der Streuungen der Seite der Zellen und die Anzahl der Ereignisse in 1 min, was die Anzahl für die Berechnung zu verwenden ist, visualisiert.
7. Berechnen Sie die Migration Index (MI) als:
   

4.2) Die Haftung Assay. Dieser Assay ermöglicht die Messung der Haftfähigkeit der Zellen. Führen Sie den Test in dreifacher Ausfertigung.

1. Pre-Mantel 96-WELls Platte (Flachboden) mit 50 ul / von entweder 2% BSA-PBS (als Hintergrund) oder 1 ug ICAM-1 in PBS verdünnt, über Nacht bei 4 ° C.
2. Zweimal waschen der Platte mit PBS und Blockieren nicht-spezifischen Stellen durch Zugabe von 2% BSA-PBS (100 ul / Vertiefung) für 1 h bei 37 ° C aufweist.
3. In der Zwischenzeit Die Zellen bei 5 x 10 ⁶ / ml in komplettem RPMI, beschriften Sie sie mit 1 mM CMFDA-grüne Zelle Tracker und Inkubation 30 min bei 37 ° C.
4. 1 x 10 ⁶ Zellen / Vertiefung zu den vorbeschichteten Vertiefungen nach Verwerfen der Blockierungslösung (Schritt 4.2.2), Inkubation 1 h bei 37 ° C aufweist.
5. Quantifizieren Haftung durch Verwendung eines ELISA-Lesegerät (Anregungsfilter: 485 nm, Emissionsfilter: 535 nm). Führen Sie eine erste Messung auf die Gesamt Eingang (INPUT).
6. Vorsichtig waschen Sie die Platte mit 2% BSA-PBS (200 ul / Vertiefung) 4-mal (x). Durchführen einer Lese der Platte nach jedem Waschschritt (Adhäsion _x).
7. Nach Abzug des Hinter für jede Messung, Berechnung spezifischen ADHESIon (Adhäsion):
   

4.3) Polymerisation Assay. Dies ist ein kolorimetrischer Test, der F-Aktin-Polymerisation quantifiziert. Führen Sie den Test in dreifacher Ausfertigung.

1. Resuspendieren 1x10 ^ 6 Zellen in 100 ul vorgewärmtes komplettem RPMI und fügen den spezifischen Stimulus (dh α-IgM 20 ug / ml) für 10 min.
2. Stoppen Sie die Reaktion mit 400 ul 4% Paraformaldehyd und fixieren Zellen für 10 min bei RT.
3. 3 x waschen mit PBS (Zentrifuge bei 300 × g für 5 min, 4 ° C).
4. Überstand verwerfen und die Zellen mit PBS permeabilisiert-Saponin 0,2% (200 ul) auf Eis für 2 min.
5. 3-mal mit PBS-0,1% Saponin waschen (Zentrifuge bei 100 × g für 5 min, 4 ° C), der Überstand verworfen und Resuspendieren in 100 ul PBS-Saponin 0,1%.
6. Fleck mit Phalloidin-AlexaFluor 488 (3 ug / ml) für 30 min bei Raum temperatur in der Dunkelheit.
7. Mit PBS-Saponin 0,1% 3 x waschen. Überstand verwerfen und resuspendieren in 300 ul PBS.
8. Quantifizierung der Menge an F-Aktin durch Durchflusszytometrie, Berechnen des Mittel Fluorescence Intensität (MFI) der Phalloidin. Analysieren Sie die erzeugten Daten in einer einzigen Dimension Grundstück, um ein Histogramm auf der Basis der Fluoreszenzintensität zu erzeugen, wird die MFI-Wert in der Grafik Berichts.
9. Messen F-Aktin-Polymerisation (Δ F-Aktin) als:
   

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Ergebnisse

Wir isolierten primären leukämischen B-Zellen bilden PB von CLL-Patienten, und wir Proteom-Karten analysiert. Proben (n = 104) wurden in zwei Hauptuntergruppen eingeteilt, basierend auf den klinischen Merkmale der einzelnen Patienten (schlechte Prognose vs gute Prognose) und die vergleichende Analyse der 2DE Gelen durchgeführt wurde.

Die Analyse ermöglichte die Identifizierung von Flecken differentiell zwischen den beiden Teilmengen ausgedrückt (in der Bezeichnung der Gegenwart...

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Diskussion

Das Ziel dieses Manuskript ist, um ein optimiertes Protokoll für die Identifizierung von Molekülen in der Pathogenese der CLL beteiligt zu beschreiben, auch wenn dieser Ansatz auf andere Krankheiten und / oder anderen Probentypen ^16-18 verlängert werden. Durch Vergleich der proteomischen Profile 2 Untergruppen von CLL-Patienten gut gegen schlechte Prognose ¹⁹ zeigten wir, dass sie sich in der Phosphorylierung von HS1 und dessen Aktivierung das Wandern und Haftfähigkeit von Leukä...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitril	MERCK	61830025001730
Ammonium Bicarbonate	SIGMA	A6141-500G
1,4-Dithioerythritol	SIGMA	D9680-5G
Iodoacetamide	SIGMA	I6125-25G
Calcium chloride dihydrate	SIGMA	223506-25G
Trypsin, Sequencing Grade	ROCHE	11418475001
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	SIGMA	C2020-10G
Trifluoroacetic acid	SIGMA	T6580
ZipTipµ-C18	MILLIPORE	ZTC18M096
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL	15064
PBS	EUROCLONE	ECB4004L
FBS	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
Lymphoprep	SENTINEL DIAGNOSTICS	1114547
Trypan Blue	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	BECKMAN COULTER	082A07767	PC5
CD56	BECKMAN COULTER	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE-Healthcare	11-0033-64
Urea	SIGMA	U6504
Tris-Hcl Buffer	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPGstrips	GE-Healthcare	17-1233-01	Linear pH 4-7 18cm
IPGbuffer	GE-Healthcare	17-6000-86	pH 4-7
Glycerol	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL Cell	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
Acrilamide	BIO-RAD	161-0156
Agarosio	INVITROGEN	16500
Methanol	SIGMA	32213
Acetic Acid	VWR	631000
Formalin	BIO-OPTICAL	05-K01009
Ethanol	VWR	9832500
Sodium Thiosulfate	FLUKA	72049
Silver Nitrate	FLUKA	85228
Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
Sodium Carbonate	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	Applied Biosystems
Data Explorer software (version 3.2)	Applied Biosystems
transwell chambre 6.6 mm diameter	CORNING	3421
RPMI	EUROCLONE	ECB2000L	WITH L-GLUTAMINE
Gentamicin	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
Flat-bottom 96-well plate	BECTON DICKINSON	353072
BSA	SANTA CRUZ	9048-46-8
ICAM-1	R&D Systems	720-IC
CMFDA	Life Thechnology	C7025	Green
IgM	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
Paraformaldehyde	SIGMA	P6148
Saponine	SIGMA	S-7900
Phalloidin	Life Thechnology	A12379	Alexa fluor 488