タンパク質機能に2DE - ゲルスポットから：慢性リンパ性白血病で、HS1から学んだレッスン

要約

ここでは、カップル2プロテオミクス技術、すなわち2次元電気泳動（2DE）および質量分析（MS）は、一次サンプルの2つ以上のグループ間で差次的に発現/翻訳後修飾タンパク質を同定するためのプロトコールを記載する。このアプローチは、一緒に機能的な実験と、予後マーカー/治療標的の同定および特徴を可能にします。

要約

腫瘍の開始と進行に関与する分子の同定は、患者の臨床管理のために、結果として、理解病の生物学のための基本であり。本研究では、慢性リンパ性白血病（CLL）の進行に関与する分子の同定のために最適化されたプロテオミクスアプローチを説明する。詳細には、白血病細胞溶解物を、2次元電気泳動（2DE）によって解決され、2DEゲル上の「スポット」として可視化した。プロテオームマップの比較分析は、採取、単離および質量分析（MS）により同定される（存在量および翻訳後修飾の点で）示差的に発現するタンパク質の同定を可能にする。同定された候補の生物学的機能は、私たちが一次白血病細胞のために最適化されていること、異なるアッセイ（ すなわち遊走、接着およびF-アクチン重合）によって試験することができる。

概要

慢性リンパ性白血病（CLL）、西洋諸国の中で最も一般的な成人の白血病は、モノクローナル腫瘍性CD5 ⁺ Bリンパ球の蓄積から派生し、臨床的に非常に不均一である。それは、モノクローナルB細胞リンパ球増加症^{（MBL）1,2,3}として定義前白血病の形として存在することができる。病気はどちら無痛臨床経過と表示されることが他のケースでは、それは、治療を必要とする前に、何年も安定した状態を保つことができ、あるいは予後不良を伴う進行化学療法抵抗性疾患などの治療にもかかわらず。最後に、頻繁に致命的な高悪性度リンパ腫（リヒター症候群^-RS）2,3,4に進むことができる。疾患の転帰および生存の予測因子に関する補足情報を提供して予後因子のセットに基づいて、良い面と悪い予後：患者は通常、2つの主要なサブセットに分類される。臨床異質性が可能性が高い生物学的な不均一性を反映している。遺伝、微小環境およびCEの数全く統一メカニズムは⁵見出されていないにもかかわらずllular因子は、疾患の病因に同意することが示されている。詳細には、いくつかの研究は、疾患の臨床経過の差が部分的に予後値^6,7,8を持ついくつかの生物学的マーカーの存在（または不在）によって説明することができることを実証した。これらのデータは、疾患の生物学のより良い理解の両方の予後マーカーおよび治療標的の同定により、病状の臨床管理のための追加のヒントを提供することができることを実証した。

本研究の目的は、異なるプロテオーム技術の組み合わせは、CLLの発症および進行に関与するタンパク質の同定のために使用することができる方法を示すことである。われわれのアプローチは、共に基本的なプロテオミクスおよび臨床データ^5を結合することが可能であることを示している。

選択された患者から現在のワークフローでは、一次白血病細胞（予後不良対良好な）単離され、そして細胞溶解物をプロテオームマップを得るために使用される。 2DEは、このように、各タンパク質の生物学的活性に間接的に情報を与えて、翻訳後修飾を含む細胞集団のプロテオミクスプロファイルの特徴付けを可能にする。全細胞溶解物は、それらの分子量に基づいてタンパク質を解決するポリアクリルアミドゲル上で泳動二次元続いて、等電点に基づく第一次元の実行によって解決される。プロテオームマップの比較分析は、示差的に発現するタンパク質の同定を可能にする（両方の存在量および翻訳後修飾の点で）を切断し、質量分析によって分析することができるゲル上のスポットとして。各候補の役割は、異なるアッセイによって悪用される可能性があります。

現在の原稿にCLLに限定このアプローチは、簡単に、したがってproteomiについての情報を提供する、他の疾患/サンプルに拡張することができ両群間のC /生物学的な違いは、（通常の対すなわち病的な、ノックダウン対非刺激、野生型対刺激さ）。

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プロトコル

注：すべての組織サンプルはサンラッファエッレ病院（ミラノ、イタリア）の治験審査委員会の承認が得られた。

1ヒト組織サンプルおよび細胞精製（図1）

注：白血病リンパ球はマリガンらによると、CLL患者の末梢血（PB）から入手したと診断された^9。

PBから1.1）白血病細胞分離

1. ヘパリンナトリウムとバキュテナー採血管でPBを収集します。
2. 15mlチューブに血液を移し、全血の50μL/ mLでヒトB細胞濃縮カクテルを追加します。よく混合し、室温で20分間インキュベートする。
3. 、PBS + 2％FBSを等容量の試料を希釈してくださいインターフェイスを壊さないこと、フィコールの上に優しく、慎重にオーバーレイ血を混ぜる。希釈した試料15ミリリットルtの（ すなわち 4ミリリットルをFicoll + 10ミリリットルの血液を2部にフィコールの少なくとも1部を使用してくださいUBE）。
4. ブレーキなしで20分間、室温（20℃）で400×gで遠心する。単核細胞を界面になります。
5. 慎重に細胞を回収し、新しいチューブにするインターフェイスを吸引。 5分間、暗所で、300×gでPBSおよび遠心分離機で一回、4℃で細胞を洗浄する。ペレットを一番下になります。
6. 上清を捨てる。指で前後にチューブをフリックで、残りの上清中にペレットを再懸濁。 （10％ウシ胎児血清および15 mg / mlのゲンタマイシンを補充したRPMI 1640）を10mlの完全RPMI培地でペレットを希釈し、トリパンブルー排除法を用いて細胞数を計測する。

1.2）純度評価

注：すべての調製物の純度は常に99％以上であることが必要である。

1. CD3 _FITC（5μL/ TES：;以下の抗体（材料の表を参照の市販品）で精製された細胞懸濁液100μlをインキュベートt）は、CD14 _PE（5μL/テスト）、CD19 _ECD（6μL/テスト）、CD16-CD56 _PC5（2μL/テスト）、CD5 _PC7において、4℃で20分間（4μL/テスト）、 FACSチューブ。
2. （300×gで5分間遠心）4mlのPBSでサンプルを洗浄し、プロットにようにその表面にCD19およびCD5を共発現するCLL細胞（> 99％）の％を流れcytometry.Checkによる純度を確認する図1に示されている（6）。準備がゼロに近いあるべきプロットで、CD3、CD14およびCD16-56の％をチェックすることにより、NK、Tリンパ球および単球の事実上欠いていることを確認してください。

1.3）サンプルストレージ

1. プロテオミクス研究のために、1.5mlチューブ中で25×10 ^6個の細胞、10分間300×gで遠心分離細胞は、4時間上清と凍結乾燥ペレットを捨てる集める。 -80℃で使用するまで保管してください。
2. 検証アッセイ、完全RPMI中に再懸濁細胞（の場合は量である、さらに、アッセイに依存選択された）、ステップ4に進みます。

2。二次元電気泳動（2-DE）（図2）

2.1）等電点電気泳動（IEF）

1. 380μlの2-DEバッファー（RBthio液の344μlの（9 M尿素、10 mMトリス、4％CHAPS）、65ミリメートル、DTT、2％IPGバッファーアンフォラインの6μlと30μlの最終容量でCLL細胞ペレットを可溶化pHは4-7）。
2. 18 IPGストリップ（pHは4-7）に、タンパク質サンプル（1 mg）を適用し、コンティらによって説明されている標準的なプロトコルに従って、IEFを実行します^。10
3. RTで15分間、新鮮なDTTを2％を補充した、（6 M尿素、30％グリセロール、2％SDSを含有する50mM pH8.8のトリス-HCl緩衝液EB）平衡化バッファー2mlにストリップを平衡化する。破棄EB + DTTおよびEBの2ミリリットルを追加し、2.5％ヨードアセトアミドを補充した。ロッキングプラットフォーム上で室温で15分間インキュベートする。

2.2）のSDS-PAGE

1. 削除したゲルに触れることなく、紙の上のストリップを乾燥さEBの過剰。 9から16%勾配​​SDS-PAGEゲルの上に各ストリップをロードします。ストリップの装着を容易にするために、ゲルの上に（w / vのトリス、25mMのグリシン192 mMの、SDS 0.1％）をSDS-電気泳動バッファーを少量を追加します。
2. 電気泳動ユニットを組み立て、SDS-電気泳動緩衝液で埋めるその後、ストリップの浮き上がりを防止するために、寒天溶液（0.8％）の〜5ミリリットルを添加することによりゲルをシールする。 4℃で4時間、60ミリアンペア/ゲルで実行を行います。
3. 電気泳動装置からゲルを外し、適切な染色ボックスに入れてください。

調製用ゲル2.3）銀染色

FIXER	50％メタノール、12％酢酸 0,05％ホルマリン	2時間（または一晩）*
洗浄バッファー	35％Ehanol	20分（ステップを3回繰り返す）
増感	0,02％チオ硫酸ナトリウム	2分
WASH	H 2 O	5分（ステップを3回繰り返す）
硝酸銀	0.2％硝酸銀0076パーセントホルマリン	20分
WASH	H 2 O	1分（2回ステップを繰り返す）
DEVELOPER	6％炭酸ナトリウム0.0004％チオ硫酸ナトリウム 0,05％ホルマリン	染色は、十分になるまで
STOP	50％メタノール	30分
	* 2時間は、タンパク質固定化に必要な最小時間である

表1。

NOTE：タンパク質スポットはMS互換銀染色¹¹でゲルを染色することによって可視化することができる。必要なすべてのソリューション銀染色のために、表1に記載されています。

1. 各溶液/ゲルの約200mlを準備し、 表1に示したように進んでください。慎重にゲルを含む染色ボックスに各ソリューションを追加します。ロッキングプラットフォーム上のすべてのインキュベーションを行います。
2. 染色後、停止液を除去し、買収されるまで1％酢酸の溶液中でゲルを残す。

2.4）ゲルの取得と解析

1. 染色から3日以内に、濃度計を用いて、高解像度で画像を取得します。
2. 2-DEゲルのソフトウェアを使用して2-Dのタンパク質パターンを分析する。
   メモ：ソフ​​トウェアが高速かつ信頼性の高い画像比較が可能になります。
   1. コンテキストメニューから「新規プロジェクトを作成」を選択して、プロジェクトを作成します。フォルダを作成し、tifファイルで「輸入ゲル画像」を選択することで、ゲルをインポートし、.PNG。または.gel拡張子。
   2. ゲルはworkspにインポートされ、追加されるとエースは、スポット検出用のゲルを選択し、メニューの「編集>スポット>検出する」を選択することで自動化されたスポット検出を行う。
   3. 次に、メニューの「減算バックグラウンド」から選択することで、背景差分を行う。注：複数のゲルを比較し、定量的および/または定性的分析による差異または類似性を検出することが可能であることを後

MALDI-TOF MS分析により3タンパク質同定（図3）

3.1）タンパク質消化

1. （清潔なメスで切断する）マニュアルによって、あるいは自動化された切除のいずれかによってゲルからの関心の水と物品税のスポットを有するゲルを洗い流す。
2. 水で洗ってゲル粒子（100-150μL）、（400×gで30秒）をスピンダウンし、液体を除去する。
3. ゲル片に、CH ₃ CNの（ゲル体積に応じて）、等量を追加し、ゲル片が縮小するまで、10〜15分間待ちます。ゲル粒子を乾燥させるiのナの真空遠心。
4. 50 mMのNH ₄ HCO ₃で希釈した10 mMのジチオエリスリトールの75〜100μLを加え、56℃（還元工程）で30分間インキュベートする。ステップ3.1.3で説明したように、再びCH ₃ CNとゲル片を縮小。
5. 55mMのヨードアセトアミドを50mM NH ₄ HCO ₃中で希釈し、暗所で室温で20分間インキュベートし、溶液の75-100を添加することによりアルキル化を進める。
6. ステップ3.1.3で説明したようにゲル断片をカバーするのに十分な量を使用して、CH ₃ CNでもう一度ゲル片を縮小。真空遠心分離機中で乾燥。
7. 25mMのNH ₄ HCO _3を含有する緩衝液中の粒子_、5mMのCaCl _2を、4℃にてトリプシンの_{12,5 ngの/μl}を20分間再水和する。ゲル片をカバーするためにバッファーの十分な量を使用してください。ゲル片から吸収されない上清を除去し、25 mMのNH ₄ HCO _3、5 mMのCaCl _2をトリプシンなしでCOVを追加ERゲル。
8. 一晩37℃で少なくとも3時間（ペプチド消化に必要な最小時間）でサンプルにしておきます。

3.2）質量分析（乾燥液滴法）

1. ステンレス鋼のMALDIプレート上の各サンプルスポット1μlのアリコートおよび50％のCH ₃ CNおよび0.1％TFAで調製し、マトリックスとしてα-シアノ-4 -ヒドロキシ桂皮酸、1μlを混ぜる。
2. MALDI-TOF質量分析計で質量スペクトルを取得する。信号の飽和を防止するか、シグナルを増大させるために、レーザ強度​​を調整する、スポット当たり約200スペクトルを蓄積する。データエクスプローラのソフトウェアを介してプロセスのスペクトルは、下記のように：
   1. .datファイルをインポートし、「プロセス>ベースライン補正」を選択することで、ベースライン補正を行う。 "プロセス>質量キャリブレーション>手動校正を選択することで、トリプシン自己分解生成物およびマトリックスピークを用いて質量を校正します。のm / z 855.1および2163.1 Bに近いピークを選択するyを左ドラッグし、「プロット」をクリックして、手動校正ウィンドウに「キャリブレーションを適用する」、その後、対応する基準質量を選択します。
   2. 、ピーク検出（「ピーク>ピーク検出」）のためのしきい値を調整するアクティブ·トレースを複製（「表示>アクティブなトレースを複製」）、新しいトレースを選択して、deisotoping（「ピーク> deisotoping」）を実行します。マクロ「getpeaklist」を使用して、識別のために使用される質量のリストを生成する。必要に応じて、手動でノイズ信号を除去するピークリストをきれいにし、より良い識別を取得するように選んだ。
3. 検索エンジン¹²として深いとマスコットを使用した総合的な非冗長タンパク質データベースを検索することにより、タンパク質を同定する。
   1. すべての検索で、次のパラメータを使用します。1は、固定の修正とのinitiなどのペプチドあたりの切断、変数の変更などのメチオニンの酸化、システインカルバミドメチル化を逃した50ppmのAlの質量公差。

4。細胞骨格活性アッセイ（図4）

注：再懸濁細胞を、完全RPMI（10 ⁶細胞/200μl）をステップ1で精製した。

4.1）遊走アッセイ。このテストでは、分析した細胞（リンパ球）の移動能力の定量化を可能にする。 6.5ミリメートル径と5.0μmの孔サイズのトランスウェルチャンバーを使用し、三連でアッセイを行う。異なる細胞型の場合には細孔サイズおよび移動時間（ステップ4.1.3）を最適化する。

1. それぞれ誘起さを測定し、自発的な移行のために特定の刺激（ すなわち 、SDF-1）の有無にかかわらず完全RPMI600μlのを追加して下室を準備します。
2. その上に上部チャンバーを入れて、システムがインキュベーター内で37℃で30分間平衡しましょう​​。
3. シード10 ⁶細胞/上部チャンバー内に200μl（総細胞数）とインキュベートインキュベーター内で37℃で4時間プレート。
4. 、上部チャンバーを取り外し下部チャンバー内のメディアを収集し、1mlのPBSで一回下室を洗う。チューブにPBSを収集します。
5. 5分300×gで遠心分離し、500μlのPBS中の上清と再懸濁を捨てる。
6. フローサイトメトリーによって、取得の1分後に遊走した細胞の数を数える。単離された細胞集団の場合には、任意の表面抗体を添加する必要はない。細胞の側が散乱し、計算に使用する番号である1分、で可視化されるイベントの数を考慮し、二次元ドットプロット中の細胞数を確認してください。
7. として移行インデックス（MI）を計算します。
   

4.2）接着アッセイ。このアッセイは、細胞の接着能を測定することを可能にする。三連でアッセイを実行します。

1. プレコート96-WELlsコマンドの50μlを有するプレート（平底）/ウェルのいずれか一晩4℃で、PBSで希釈し、2％BSA-PBS（背景として）または1μgICAM-1。
2. PBSで2回プレートを洗浄し、37℃で1時間、2％BSA-PBS（100μl/ウェル）を添加することによって非特異的部位をブロックする。
3. 完全RPMI中5×10 ⁶ / mlでその間の再懸濁細胞では、1 mMのCMFDA緑色の細胞トラッカーでそれらにラベルを付け、37℃で30分間インキュベートする。
4. ブロッキング溶液（ステップ4.2.2）を廃棄した後、1×10 ⁶細胞/ウェルで予めコーティングしたウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートする。
5. ELISAリーダー（：485 nm、発光フィルター：535 nMの励起フィルター）を使用して接着性を定量化する。総入力（INPUT）の最初の測定を行います。
6. 2％BSA-PBSで穏やかにプレートを洗浄し（200μl/ウェル）4回（x）である。各洗浄工程（接着_x）の後に、プレートの読み取りを行います。
7. 各測定のためのバックグラウンドを差し引いた後に、特定のadhesを計算イオン（接着）：
   

4.3）重合アッセイ。これは、F-アクチンの重合を定量比色アッセイである。三連でアッセイを実行します。

1. 再懸 ​​濁1×10 ^予め温め完全RPMI100μl中6個の細胞、10分間、特定の刺激（ すなわち 、α-IgM抗体を20μg/ ml）を追加します。
2. 4％パラホルムアルデヒド400μlので反応を停止し、室温で10分間、細胞を固定。
3. （5分、4℃、300×gで遠心分離）をPBSで3回洗浄する。
4. 上清を破棄し、2分間氷上でPBS-サポニン0.2％（200μl）を用いて細胞を透過性。
5. PBS-サポニン0.1％（5分間100×gで遠心、4℃）で3回洗浄し、100μlのPBS-サポニン0.1％上清と再懸濁を捨てる。
6. 室温tでの30分間のファロイジン-アレクサ488（3μg/ ml）を用いて染色暗闇の中でemperature。
7. PBS-0.1％サポニンで3回洗浄する。 300μlのPBS中の上清と再懸濁を捨てる。
8. ファロイジンの平均蛍光強度（MFI）を計算する、フローサイトメトリーによってF-アクチンの量を定量する。蛍光強度に基づいてヒストグラムを生成するために、一次元プロットで生成されたデータを分析し、MFI値はグラフレポートに示されている。
9. F-アクチンの重合（ΔF-アクチン）などを測定します。
   

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結果

私たちは、一次白血病B細胞はCLL患者のPBを形成する単離され、私たちはプロテオームマップを分析した。サンプルた（n = 104）は、各患者の臨床的特徴に基づいて、2つの主要なサブセット（良好な予後対悪い予後）にグループ分けし、2DEゲルの比較分析を行った。

分析許容差次つのサブセット間で発現スポットの同定（翻訳後修飾の変化を暗示存在/不在又はゲル?...

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ディスカッション

本稿の目的は、このアプローチは他の疾患および/ ​​または他のサンプルタイプ^16-18に拡張することができる場合であっても、CLLの病因に関与する分子の同定のための最適化されたプロトコルを記述することである。悪い予後¹⁹ 対 ​​良好CLL患者の2サブセットのプロテオミクスプロファイルを比較することによって、私たちは、彼らがHS1のリン酸化状態が異なり...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitril	MERCK	61830025001730
Ammonium Bicarbonate	SIGMA	A6141-500G
1,4-Dithioerythritol	SIGMA	D9680-5G
Iodoacetamide	SIGMA	I6125-25G
Calcium chloride dihydrate	SIGMA	223506-25G
Trypsin, Sequencing Grade	ROCHE	11418475001
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	SIGMA	C2020-10G
Trifluoroacetic acid	SIGMA	T6580
ZipTipµ-C18	MILLIPORE	ZTC18M096
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL	15064
PBS	EUROCLONE	ECB4004L
FBS	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
Lymphoprep	SENTINEL DIAGNOSTICS	1114547
Trypan Blue	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	BECKMAN COULTER	082A07767	PC5
CD56	BECKMAN COULTER	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE-Healthcare	11-0033-64
Urea	SIGMA	U6504
Tris-Hcl Buffer	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPGstrips	GE-Healthcare	17-1233-01	Linear pH 4-7 18cm
IPGbuffer	GE-Healthcare	17-6000-86	pH 4-7
Glycerol	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL Cell	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
Acrilamide	BIO-RAD	161-0156
Agarosio	INVITROGEN	16500
Methanol	SIGMA	32213
Acetic Acid	VWR	631000
Formalin	BIO-OPTICAL	05-K01009
Ethanol	VWR	9832500
Sodium Thiosulfate	FLUKA	72049
Silver Nitrate	FLUKA	85228
Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
Sodium Carbonate	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	Applied Biosystems
Data Explorer software (version 3.2)	Applied Biosystems
transwell chambre 6.6 mm diameter	CORNING	3421
RPMI	EUROCLONE	ECB2000L	WITH L-GLUTAMINE
Gentamicin	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
Flat-bottom 96-well plate	BECTON DICKINSON	353072
BSA	SANTA CRUZ	9048-46-8
ICAM-1	R&D Systems	720-IC
CMFDA	Life Thechnology	C7025	Green
IgM	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
Paraformaldehyde	SIGMA	P6148
Saponine	SIGMA	S-7900
Phalloidin	Life Thechnology	A12379	Alexa fluor 488