A partir de um ponto 2DE-Gel para a função da proteína: lição aprendida com HS1 em leucemia linfocítica crônica

Resumo

Aqui nós descrevemos um protocolo que os casais duas técnicas proteômicas, ou seja, 2-dimensional Eletroforese (2DE) e Espectrometria de Massa (MS), para identificar diferencialmente expressos / proteínas pós-traducionais modificados entre dois ou mais grupos de amostras primárias. Esta abordagem, em conjunto com ensaios funcionais, permite a identificação e caracterização de marcadores / alvos terapêuticos prognósticos.

Resumo

A identificação de moléculas envolvidas na iniciação e progressão tumoral é fundamental para a biologia da doença compreensão e, como conseqüência, para o manejo clínico dos pacientes. No presente trabalho, vamos descrever uma abordagem proteómica optimizado para a identificação de moléculas envolvidas na progressão da leucemia linfocítica crónica (CLL). Em detalhe, os lisados ​​de células leucémicas são resolvidos por 2-dimensional Electrophoresis (2DE) e visualizada como "manchas" nos géis 2DE. A análise comparativa de mapas de proteómica permite a identificação de proteínas diferencialmente expressas (em termos de abundância e modificações pós-tradução), que são escolhidos, isolados e identificados por espectrometria de massa (MS). A função biológica dos candidatos identificados podem ser testados por ensaios diferentes (isto é, migração, adesão e polimerização de F-actina), que optimizaram para células leucémicas primárias.

Introdução

Leucemia Linfocítica Crônica (LLC), a leucemia em adultos mais comum nos países ocidentais, deriva do acúmulo de linfócitos CD5 ⁺ B neoplásicas monoclonais e é clinicamente muito heterogêneo. Pode estar presente como uma forma de pré-leucémicas, definido como linfoma de células B monoclonais (MBL) ^1,2,3. Em outros casos, a doença pode aparecer com um curso clínico indolente, que pode permanecer estável durante anos antes de precisar de tratamento, ou como uma doença chemorefractory progressiva com prognóstico sombrio, apesar da terapêutica. Finalmente, pode evoluir para um linfoma de alto grau freqüentemente letal (Síndrome de Richter-RS) ^2,3,4. Os pacientes são geralmente classificados em dois subgrupos principais: bom e mau prognóstico, com base em um conjunto de fatores prognósticos que fornece informações complementares sobre preditores de prognóstico da doença e sobrevivência. A heterogeneidade clínica provavelmente reflete a heterogeneidade biológica. Um número de genética, microambiental e cellular factores têm sido mostrados para concorrer para a patogênese da doença, embora não há mecanismos unificadores foram encontrados ^5. Em detalhe, vários estudos têm demonstrado que as diferenças no curso clínico da doença pode ser parcialmente explicado pela presença (ou ausência) de alguns marcadores biológicos que têm um valor ^6,7,8 prognóstico. Estes dados demonstram que uma melhor compreensão da biologia da doença poderia fornecer dicas adicionais para o manejo clínico da patologia, através da identificação de ambos os marcadores prognósticos e alvos terapêuticos.

O objetivo do presente trabalho é mostrar como a combinação de diferentes técnicas proteômicas pode ser utilizado para a identificação de proteínas envolvidas no aparecimento e progressão CLL. Nossa abordagem demonstra que é possível juntar proteômica juntos básica e dados clínicos ^5.

No presente do fluxo de trabalho, as células leucêmicas primários de pacientes selecionados(Bom contra o mau prognóstico) são isoladas e lisados ​​celulares são usados ​​para obter mapas de proteômica. 2DE permite caracterizar o perfil de proteómica de uma população de células, incluindo modificações pós-tradução, assim dando informações indirectas sobre a actividade biológica de cada proteína. Os lisados ​​celulares totais são resolvidos por uma primeira dimensão de execução com base no ponto isoeléctrico, seguido por uma segunda dimensão corridos num gel de poliacrilamida que resolve as proteínas com base no seu peso molecular. A análise comparativa de mapas de proteómica permite a identificação de proteínas diferencialmente expressas (tanto em termos de abundância e modificações pós-tradução), como pontos do gel que podem ser cortados e analisados ​​por Espectrometria de Massa. O papel de cada candidato pode ser explorado em seguida, por diferentes ensaios.

Esta abordagem, restrito a CLL no manuscrito atual, pode ser facilmente expandido para outras doenças / amostras, fornecendo assim informações sobre o proteomic / diferenças biológicas entre dois grupos (ie patológicas vs normais, estimuladas vs não estimulada, do tipo selvagem vs knockdown).

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Protocolo

NOTA: Todas as amostras de tecido foram obtidos com a aprovação do conselho de revisão institucional do Hospital San Raffaele (Milão, Itália).

1. amostras de tecidos humanos e purificação celular (Figura 1)

NOTA: linfócitos leucêmicas foram obtidas a partir do sangue periférico (PB) de pacientes com LLC, diagnosticados de acordo com Mulligan et ^{al, 9.}

1.1) A separação de células leucêmicas da PB

1. Colete PB em vacutainer tubos de coleta de sangue com heparina sódica.
2. Transferir o sangue para um tubo de 15 ml e adicionar enriquecimento cocktail de células B humanas em 50 ul / ml de sangue total. Misturar bem e incubar 20 min a temperatura ambiente.
3. Diluir a amostra com um volume igual de PBS + 2% FBS, misturar sangue suavemente e cuidadosamente através da sobreposição de Ficoll, tomando cuidado para não romper a interface. Utilizar pelo menos 1 parte de Ficoll a 2 partes da amostra diluída (ou seja, 4 mL de Ficoll + 10 ml de sangue em 15 ml de tube).
4. Centrifugar a 400 xg, à temperatura ambiente (20 ° C) durante 20 minutos sem travão. As células mononucleares será na interface.
5. Aspirar cuidadosamente a interface para recuperar as células e colocar em um novo tubo. Lave as células uma vez com PBS e centrifugar a 300 xg, a 4 ° C no escuro durante 5 min. O sedimento será na parte inferior.
6. Descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento no sobrenadante restante sacudindo o tubo e para trás com os dedos. Diluir o sedimento com 10 ml de meio RPMI completo (RPMI 1640 suplementado com 10% de Soro Fetal de Vitela e 15 mg / ml de gentamicina), e contar as células utilizando o método de exclusão de azul de tripano.

1.2) Avaliação Pureza

NOTA: A pureza de todas as preparações deve ser sempre superior a 99%.

1. Incubar 100 ul de suspensão de células purificadas com os seguintes anticorpos (disponível comercialmente, ver Tabela de Materiais): CD3 _FITC (5 ul / test), CD14 _PE (5 ul / teste), CD19 _ECD (6 mL / teste), CD16-CD56 _PC5 (2 ^ l / teste), CD5 _PC7 (4 ul / ensaio), durante 20 min a 4 ° C numa tubo de FACS.
2. Lava-se a amostra com 4 ml de PBS (centrifuga-se durante 5 minutos a 300 xg) e verificar a pureza por fluxo cytometry.Check na trama a% de células CLL (> 99%) que co-expresso CD19 e CD5, enquanto na sua superfície mostrado na Figura 1 (6). Certifique-se de que os preparativos são praticamente desprovidos de NK, linfócitos T e monócitos, verificando o% de CD3, CD14 e CD16-56 na trama, que deve ser perto de zero.

1.3) As amostras de armazenamento

1. Para os estudos de proteómica, recolher 25 x 10 ⁶ células em um tubo de 1,5 ml, as células de centrifugação a 300 xg durante 10 minutos, rejeitar o sobrenadante e de peletes de liofilizar durante 4 horas. Manter a -80 ° C até à sua utilização.
2. Para os ensaios de validação, ressuspender as células em meio RPMI completo (quantidade depende do ensaio que é maisescolhido) e prossiga com a Etapa 4.

2. electroforese bidimensional (2-DE) (Figura 2)

2.1) Isoelectrofocusing (IEF)

1. Solubiliza-se as células CLL pelotas com um volume final de 380 ul de tampão de 2-DE (344 ul de uma solução RBthio (9 M ureia, 10 mM Tris, 4% CHAPS), 30 ul de 65 mM de DTT, 6 ul de 2% de tampão de IPG anfolina pH 4-7).
2. Aplicar amostras de proteína (1 mg) a 18 tiras de IPG (pH 4-7) e realizar IEF seguindo o protocolo padrão descrito por Conti et al. ¹⁰
3. Equilibrar as tiras em 2 ml de Tampão de Equilíbrio (EB: 50 mM de tampão pH 8,8 de Tris-HCl, contendo 6 M de ureia, 30% glicerol, 2% SDS), suplementado com 2% de fresco de DTT, durante 15 minutos à RT. Descartar EB + DTT e adicionar 2 ml de EB suplementado com 2,5% Iodoacetamida. Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente numa plataforma oscilante.

2.2) de SDS-PAGE

1. Secam-se as tiras em um papel, sem tocar no gel para removero excesso de EB. Carregar cada tira na parte superior de um gradiente de gel de SDS-PAGE a 9-16%. Adicionar uma pequena quantidade de SDS-electroforese tampão (Tris 25 mM, Glicina 192 mM, SDS a 0,1% w / v) na parte superior do gel para facilitar a carga da fita.
2. Fecha-se o gel por adição de ~ 5 ml de solução de ágar (0,8%) para evitar que a tira de flutuação, em seguida, montar a unidade de electroforese e encher com tampão SDS-electroforese. Realizar a corrida no 60 mA / gel durante 4 horas a 4 ° C.
3. Remover o gel a partir da unidade de electroforese e colocá-lo na caixa de coloração adequada.

2.3) coloração de prata para preparativa Gel

FIXER	50% de metanol de 12% de Ácido Acético 0,05% de formalina	2 horas (ou durante a noite) *
TAMPÃO DE LAVAGEM	35% Ehanol	20 min (repita o passo três vezes)
SENSIBILIZAÇÃO	0,02% de tiossulfato de sódio	2 min
WASH	H2O	5 min (repita o passo três vezes)
NITRATO DE PRATA	0,2% de nitrato de prata 0,076% de formalina	20 min
WASH	H2O	1 min (repita o passo duas vezes)
COLABORADOR	6% Carbonato de sódio 0,0004% de tiossulfato de sódio 0,05% de formalina	Até a coloração é suficiente
Pare	50% Metanol	30 min
	* 2 horas é o tempo mínimo necessário para a fixação de proteínas

Tabela 1.

NOTA: spots de proteínas podem ser visualizados através da coloração géis com MS mancha prata compatível ^11. Todas as soluções necessáriaspara a coloração de prata estão listadas na Tabela 1.

1. Prepare a cerca de 200 ml de cada solução / gel e proceder como indicado na Tabela 1. Adiciona-se cuidadosamente cada solução para a caixa de coloração contendo o gel. Realize todas as incubações em uma plataforma de balanço.
2. Após a coloração, remover a solução de paragem e deixar o gel numa solução de 1% de ácido acético até a aquisição.

2.4) Gel Aquisição e Análise

1. Aquisição de imagens com elevada resolução utilizando um densitómetro no prazo de 3 dias a partir da coloração.
2. Analisar padrões de proteínas 2-D, utilizando software para géis 2-DE.
   NOTA: O software permite uma comparação rápida e confiável de imagem.
   1. Criar um projeto escolhendo "criar um novo projeto" a partir do menu contextual. Crie uma pasta e importar os géis escolhendo "imagens de gel de importação" com tif, png. ou .gel extensão.
   2. Uma vez que os geles são importadas e adicionou-se o Espaço de Trabalhoás, realizar uma detecção de ponto automatizado, selecionando os géis para detecção de ponto e escolher "Editar> local> detectar" no menu.
   3. Em seguida, executar uma subtração de fundo, selecionando no menu "fundo de subtração". Nota: Depois disso, é possível comparar vários géis e para detectar diferenças ou semelhanças de análise quantitativa e / ou qualitativa.

3 Identificação de proteínas por MALDI-TOF MS de análise (Figura 3)

3.1) A digestão de proteínas

1. Lavar o gel com água e impostos especiais de consumo pontos de interesse de géis ou pelo manual (corte com um bisturi limpo) ou por excisão automatizado.
2. Lave partículas de gel com água (100-150 mL), spin down (30 segundos a 400 xg) e remover o líquido.
3. Adicionar um volume igual (dependendo do volume de gel) de CH ₃ CN para os pedaços de gel e esperar por 10-15 min, até os pedaços de gel de encolher. Secam-se as partículas de gel ina centrífuga de vácuo.
4. Adicionar 75-100 ul de 10 mM Ditioeritritol diluído em 50 mM NH ₄ HCO ₃ e incubar durante 30 min a 56 ° C (Redução Passo). Diminuir novamente os pedaços de gel com CH ₃ CN como se descreveu na etapa 3.1.3.
5. Continuar com a alquilação por adição de 75-100 ul de uma solução 55 mM de iodoacetamida diluído em 50 mM NH ₄ HCO ₃ e incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro.
6. Diminuir os pedaços do gel, uma vez mais com CH ₃ CN utilizando um volume suficiente para cobrir os pedaços do gel, tal como descrito no passo 3.1.3. Seco numa centrífuga de vácuo.
7. Re-hidratar as partículas em um tampão contendo 25 mM de NH ₄ HCO _3, 5 mM de _{CaCl2, e 12,5 ng /} mL de tripsina a 4 ° C durante 20 min. Use um volume suficiente de tampão para cobrir os pedaços de gel. Retirar o sobrenadante absorvido-un dos pedaços de gel e adicionar 25 mM NH ₄ HCO _3, 5 mM de _CaCl2, sem tripsina para cover o gel.
8. Deixar as amostras a 37 ° C, pelo menos, 3 horas (o tempo mínimo necessário para a digestão de péptidos) a durante a noite.

3.2) Análise Espectrometria de Massa (técnica de gota seco)

1. Ponto 1 ul alíquota de cada amostra para uma placa de aço inoxidável de MALDI e misturar com 1 ml de ácido como matriz α-ciano-4-hidroxicinâmico, preparadas em 50% _CH3CN e 0,1% TFA.
2. Obter espectros de massa em um espectrômetro de massa MALDI-TOF. Acumulam-se cerca de 200 espectros por local, o ajuste da intensidade do laser para evitar a saturação do sinal ou para aumentar o sinal. Espectros do processo através de software Data Explorer, conforme descrito abaixo:
   1. Importe o arquivo dat e realizar a correção de linha de base, escolhendo "processo> correção de linha de base". Calibrar massas que utilizam os produtos tripsina autólise e picos de matriz escolhendo "processo> calibração massa> calibragem manual; selecionar picos perto de m / z 855,1 e 2.163,1 by esquerda arrastando e selecionar as massas de referência correspondente, em seguida, clique em "conspiração" e "aplicará a calibragem" na janela de calibração manual.
   2. Ajuste o limiar para detecção de pico ("peak> pico de detecção"), duplicar o rastreamento ativo ("display> duplicar rastreamento ativo"), selecione o novo rastreamento e realizar o deisotoping ("pico> deisotoping"). Usando a macro "getpeaklist", gerar uma lista de massas para ser utilizado para a identificação. Se necessário, remover manualmente os sinais de ruído escolhida como picos de limpar a lista e obter uma melhor identificação.
3. Identificar as proteínas por pesquisar um banco de dados abrangente de proteínas não redundante usando profunda e mascote como motores de busca ^12.
   1. Utilize os seguintes parâmetros em todas as pesquisas: um perdeu a clivagem por peptídeo, oxidação da metionina como modificação variável, carbamidomethylation cisteína como modificação fixa e uma inititolerância massa al de 50 ppm.

4. Citoesqueletal Actividade ensaios (Figura 4)

NOTA: Suspenda as células purificadas no Passo 1 em meio RPMI completo (10 ⁶ células / 200 uL).

4.1) Ensaio de migração. Este ensaio permite a quantificação da capacidade migratória das células analisadas (linfócitos). Use uma câmara transwell de 6,5 mm de diâmetro e 5,0 uM de tamanho de poro e realizar o ensaio em triplicado. Optimizar tamanho de poro e do tempo de migração (Passo 4.1.3) no caso de diferentes tipos de células.

1. Prepare a câmara inferior através da adição de 600 ul de meio RPMI completo, com ou sem os estímulos específicos (isto é, SDF-1) para medir a ea migração espontânea induzida respectivamente.
2. Coloque a câmara superior sobre ele e deixe o sistema equilibrar durante 30 minutos a 37 ° C na incubadora.
3. Semente 10 ⁶ células / 200 mL no cenáculo (número total de células) e incubara placa durante 4 horas a 37 ° C na incubadora.
4. Retire a câmara superior, recolher os media na câmara baixa e lavar a câmara baixa uma vez com 1 ml de PBS. Recolhe-se o PBS no tubo.
5. Centrifugar 5 minutos a 300 xg, descartar o sobrenadante e ressuspender em 500 ul de PBS.
6. Por citometria de fluxo, contar o número de células migradas após 1 min de aquisição. No caso de uma população de células isoladas, não é necessário adicionar qualquer anticorpo superfície. Verificar o número de células em um gráfico de pontos bidimensional considerando as dispersa laterais das células e o número de eventos visualizadas em 1 min, que é o número a ser usado para o cálculo.
7. Calcular o Índice de Migrações (MI) como:
   

4.2) Ensaio de Adesão. Este ensaio permite medir a capacidade de adesão das células. Realize o ensaio em triplicado.

1. Pré-coat de 96 wells placa (de fundo plano) com 50 uL / ​​poço tanto de 2% BSA-PBS (como base) ou 1 ug de ICAM-1 diluída em PBS, durante a noite a 4 ° C.
2. Lavar a placa duas vezes com PBS e bloquear os sítios não específicos por adição de 2% de BSA-PBS (100 ul / poço) durante 1 hora a 37 ° C.
3. No entretanto, as células ressuspender em 5 x 10 ⁶ / ml em meio RPMI completo, identificá-los com um rastreador célula mM CMFDA-verde e incubar 30 min a 37 ° C.
4. Adicionar 1 x 10 ⁶ células / poço aos poços pré-revestidos depois de descartar a solução de bloqueio (passo 4.2.2) e incubar 1 h a 37 ° C.
5. Quantificar a aderência usando um leitor de ELISA (filtro de excitação: 485 nm, filtro de emissão: 535 nm). Realizar uma primeira medição do total de entrada (INPUT).
6. Lava-se a placa suavemente com 2% de BSA-PBS (200 ul / poço) 4 vezes (x). Efectuar a leitura da placa, após cada etapa de lavagem (Adesão _x).
7. Depois de subtração de fundo para cada medição, calcule Adhes específicosião (adesão):
   

4.3) Ensaio de polimerização. Este é um ensaio colorimétrico que quantifica a polimerização de F-actina. Realize o ensaio em triplicado.

1. Ressuspender 1x10 ^ 6 células em 100 ml de pré-aquecido RPMI completo e adicionar o estímulo específico (ou seja, α-IgM 20 ng / ml) por 10 min.
2. Parar a reacção com 400 uL de paraformaldeído a 4% e as células fixar durante 10 min à temperatura ambiente.
3. Lavar 3 vezes com PBS (centrifugar a 300 xg durante 5 min, 4 ° C).
4. Descartar o sobrenadante e as células permeabilizar com PBS-saponina 0,2% (200 ul) em gelo durante 2 min.
5. Lavar 3 vezes com PBS-saponina 0,1% (centrifugar a 100 xg durante 5 min, 4 ° C), descartar o sobrenadante e ressuspender em 100 ul de PBS-saponina 0,1%.
6. Mancha com faloidina-AlexaFluor 488 (3 ug / ml) durante 30 min a sala temperatura no escuro.
7. Lavar 3 vezes com PBS-saponina 0,1%. Descartar o sobrenadante e ressuspender em 300 ul de PBS.
8. Quantificar a quantidade de actina F por citometria de fluxo, o cálculo da intensidade média de Florescence (IMF) da faloidina. Analisar os dados gerados em um único gráfico de dimensão, de modo a produzir um histograma com base na intensidade de fluorescência, o valor MFI é mostrado no gráfico de relatório.
9. Medir a polimerização de actina F (Δ F-actina) como:
   

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Resultados

Nós isolado células B leucêmicos primários formam PB de pacientes com LLC e analisamos mapas proteômica. As amostras (n = 104) foram agrupados em dois subconjuntos principais com base nas características clínicas de cada paciente (mau prognóstico vs bom prognóstico) e análise comparativa dos géis 2DE foi realizada.

A análise permitiu a identificação de pontos diferencialmente expressos entre os dois subconjuntos (em termos de presença / ausência ou mudança no gel, o...

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Discussão

O objectivo deste artigo é descrever um protocolo optimizado para a identificação de moléculas envolvidas na patogénese de CLL, mesmo que esta abordagem possa ser estendida a outras doenças e / ou outros tipos de amostras ^16-18. Ao comparar os perfis de proteómica dois grupos de pacientes com LLC, boas vs mau prognóstico ^19, demonstrou-se que eles diferem no estado de fosforilação de HS1 que a sua activação e afecta a capacidade de adesão e migração de células leucém...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitril	MERCK	61830025001730
Ammonium Bicarbonate	SIGMA	A6141-500G
1,4-Dithioerythritol	SIGMA	D9680-5G
Iodoacetamide	SIGMA	I6125-25G
Calcium chloride dihydrate	SIGMA	223506-25G
Trypsin, Sequencing Grade	ROCHE	11418475001
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	SIGMA	C2020-10G
Trifluoroacetic acid	SIGMA	T6580
ZipTipµ-C18	MILLIPORE	ZTC18M096
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL	15064
PBS	EUROCLONE	ECB4004L
FBS	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
Lymphoprep	SENTINEL DIAGNOSTICS	1114547
Trypan Blue	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	BECKMAN COULTER	082A07767	PC5
CD56	BECKMAN COULTER	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE-Healthcare	11-0033-64
Urea	SIGMA	U6504
Tris-Hcl Buffer	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPGstrips	GE-Healthcare	17-1233-01	Linear pH 4-7 18cm
IPGbuffer	GE-Healthcare	17-6000-86	pH 4-7
Glycerol	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL Cell	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
Acrilamide	BIO-RAD	161-0156
Agarosio	INVITROGEN	16500
Methanol	SIGMA	32213
Acetic Acid	VWR	631000
Formalin	BIO-OPTICAL	05-K01009
Ethanol	VWR	9832500
Sodium Thiosulfate	FLUKA	72049
Silver Nitrate	FLUKA	85228
Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
Sodium Carbonate	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	Applied Biosystems
Data Explorer software (version 3.2)	Applied Biosystems
transwell chambre 6.6 mm diameter	CORNING	3421
RPMI	EUROCLONE	ECB2000L	WITH L-GLUTAMINE
Gentamicin	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
Flat-bottom 96-well plate	BECTON DICKINSON	353072
BSA	SANTA CRUZ	9048-46-8
ICAM-1	R&D Systems	720-IC
CMFDA	Life Thechnology	C7025	Green
IgM	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
Paraformaldehyde	SIGMA	P6148
Saponine	SIGMA	S-7900
Phalloidin	Life Thechnology	A12379	Alexa fluor 488