С 2DE-гель пятна с белком Функция: Урок, извлеченный из HS1 в хронический лимфолейкоз

Резюме

Здесь мы опишем протокол, что пары две протеомные методы, а именно 2-мерный электрофорез (2DE) и масс-спектрометрия (MS), чтобы идентифицировать дифференциально экспрессируются / посттрансляционные модифицированные белки между двумя или более группами первичных проб. Этот подход, вместе с функциональными экспериментов, позволяет идентифицировать и охарактеризовать прогностических маркеров / терапевтических мишеней.

Аннотация

Идентификация молекул, участвующих в инициации и прогрессировании опухоли имеет основополагающее значение для биологии О развитии заболеваний и, как следствие, для клинического ведения пациентов. В настоящей работе мы опишем оптимизированную протеомный подход для идентификации молекул, участвующих в прогрессировании хронического лимфолейкоза (ХЛЛ). В деталях, лейкозных клеточные лизаты решаются 2-мерном электрофореза (2DE) и визуализируется в виде "пятен" на гелях 2DE. Сравнительный анализ протеомическим карт позволяет идентифицировать разному экспрессируются белки (в плане численности и пост-трансляционных модификаций), которые подобрали, выделены и идентифицированы по масс-спектрометрии (MS). Биологическая функция выявленных кандидатов могут быть проверены различными анализов (то есть миграция, адгезии и F-актин полимеризации), что мы оптимизировали для первичных лейкозных клеток.

Введение

Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), наиболее распространенным взрослых лейкоз в западных странах, происходит от накопления моноклональных опухолевых CD5 ⁺ В-лимфоцитов и клинически очень неоднородна. Это может присутствовать в виде предварительно лейкозных форме, определяемой как моноклональное В-клеток лимфоцитоз (MBL) ^1,2,3. В других случаях болезнь может появиться либо безболезненную клинического течения, которые могут оставаться стабильными в течение многих лет, прежде чем, нуждающихся в лечении, или как прогрессирующее заболевание chemorefractory с плохим прогнозом, несмотря на лечение. Наконец, это может прогрессировать в часто смертельной высококачественной лимфомы (Рихтера синдром-RS) ^2,3,4. Пациенты обычно классифицируются по двум основным подмножества: хорошего и плохого прогноза, на основе набора прогностических факторов, который обеспечивает дополнительную информацию о предикторы исхода заболевания и выживаемость. Клиническая гетерогенность, вероятно, отражает биологическую гетерогенность. Ряд генетических, микросреды и сеllular факторы, как было показано согласны с патогенезе заболевания хотя никаких объединительные механизмы не были найдены ^5. В деталях, некоторые исследования показали, что различия в клиническом течении заболевания может быть частично объяснено наличием (или отсутствием) некоторых биологических маркеров, которые имеют прогностическое значение ^6,7,8. Эти данные показали, что лучшее понимание биологии заболевания может обеспечить дополнительные подсказки для клинического ведения патологии, путем идентификации обоих прогностических маркеров и терапевтических мишеней.

Целью настоящей работы является показать, как сочетание различных протеомных методов может быть использован для идентификации белков, участвующих в ХЛЛ возникновения и прогрессирования. Наш подход показывает, что можно объединить вместе основную протеомические и клинических данных ^5.

В настоящем рабочем процессе, первичные лейкозных клеток из отобранных пациентов(Хорошо против плохим прогнозом) изолированы и клеточные лизаты затем используются для получения протеомные карты. 2DE позволяет характеризовать протеомного профайл клеточной популяции, в том числе пост-трансляционных модификаций, тем самым давая косвенную информацию о биологической активности каждого белка. Цельные клеточные лизаты решаются с помощью первого размерности перспективе на основе изоэлектрической точки, за которым следует второй измерении работать на полиакриламидном геле, который разрешает белков в зависимости от их молекулярной массы. Сравнительный анализ протеомическим карт позволяет идентифицировать разному экспрессируются белки (как с точки зрения численности и пост-трансляционных модификаций) в качестве мест на гель, который можно вырезать и анализировали с помощью масс-спектрометрии. Роль каждого кандидата можно затем эксплуатируются различными анализов.

Этот подход, ограничивается ХЛЛ в текущем рукописи, может быть легко расширена для других заболеваний / образцов, таким образом, обеспечивая информацию о proteomiC / биологические различия между двумя группами (т.е. патологические против нормальной, стимулированные против нестимулированной, дикого типа против нокдаун).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы ткани были получены с одобрения этическим комитетом Сан больницы Раффаэле (Милан, Италия).

1 Образцы тканей человека и сотовый Очистка (Рисунок 1)

Примечание: Лейкемические лимфоциты были получены из периферической крови (РВ) пациентов с ХЛЛ, диагноз в соответствии с Mulligan соавт ^9.

1.1) лейкозных клеток Отделение от PB

1. Соберите PB в вакуумные контейнеры для сбора крови труб с натрия гепарин.
2. Передача крови в 15 мл пробирку и добавить коктейль обогащению B-клеток человека при 50 мкл / мл цельной крови. Тщательно перемешать и инкубировать 20 мин при комнатной температуре.
3. Развести пробы с равным объемом PBS + 2% FBS, аккуратно перемешать и осторожно наложения кровь на фиколла, следя, чтобы не нарушить интерфейс. Использование по меньшей мере, 1 часть Ficoll 2 частей разведенного образца (т.е. 4 мл Ficoll + 10 мл крови в 15 мл третУбе).
4. Центрифуга при 400 х г при комнатной температуре (20 ° C) в течение 20 мин, без тормоза. Мононуклеарные клетки будут на границе раздела.
5. Тщательно аспирата интерфейс для восстановления клеток и поместить в новую пробирку. Промыть клетки один раз PBS и центрифугировать при 300 х г, 4 ° С в темноте в течение 5 мин. Осадок будет в нижней части.
6. Удалите супернатант. Ресуспендируют гранул в оставшейся надосадочной, щелкая трубки назад и вперед с пальцами. Развести гранул с 10 мл RPMI полной среды (RPMI 1640, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки и 15 мг / мл гентамицина) и подсчитать клетки, используя метод трипанового синего.

1.2) Чистота Оценка

Примечание: чистота всех препаратов должен быть всегда выше 99%.

1. Инкубировать 100 мкл очищенной суспензии клеток со следующими антителами (коммерчески доступных, см таблицу материалов): CD3 _FITC (5 мкл / TESт), CD14 _РЕ (5 мкл / испытание), CD19 _ECD (6 мкл / испытание), CD16-CD56 _PC5 (2 мкл / испытание), CD5 _PC7 (4 мкл / тест), в течение 20 мин при 4 ° С в FACS трубы.
2. Вымойте образца с 4 мл PBS (центрифуги в течение 5 минут при 300 мкг в) и проверьте чистоту потоком cytometry.Check в заговоре с% от ХЛЛ клеток (> 99%), которые взаимодействуют экспресс CD19 и CD5 на их поверхности, как показано на рисунке 1 (6). Убедитесь, что препараты практически лишены NK, Т-лимфоцитов и моноцитов, проверяя% от CD3, CD14 и CD16-56 в заговоре, который должен быть около нуля.

1.3) Образцы хранения

1. Для протеомическим исследований, сбора 25 х 10 ⁶ клеток в 1,5 мл пробирку, центрифуг клетки при 300 мкг в течение 10 мин, отбросить супернатант и лиофилизировать гранул в течение 4 часов. Хранить при температуре -80 ° С до использования.
2. Для анализов проверки, ресуспендируют клеток в полной среде RPMI (количество зависит от дальнейшего анализа, которыйвыбран) и перейдите к шагу 4.

2 двумерного электрофореза (2-DE) (Рисунок 2)

2.1) Изоэлектрофокусирование (МЭФ)

1. Солюбилизации клеток ХЛЛ гранул с получением конечного объема 380 мкл 2-DE-буфера (344 мкл раствора RBthio (9 М мочевины, 10 мМ Трис, 4% CHAPS), 30 мкл 65 мм DTT, 6 мкл 2% IPG буфера Ampholine рН 4-7).
2. Применение белковых образцов (1 мг) до 18 полос IPG (рН 4-7) и выполнить следующие IEF стандартному протоколу, как описано Conti и соавт. ¹⁰
3. Равновесие полосы в 2 мл уравновешивающего буфера (EB: 50 мМ рН 8,8 Трис-HCl буфере, содержащем 6 М мочевины, 30% глицерина, 2% SDS) с добавлением 2% от свежего DTT, в течение 15 минут при комнатной температуре. Отменить EB + DTT и добавить 2 мл EB дополнена 2,5% иодацетамидом. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре на ротационном платформы.

2,2) SDS-PAGE

1. Высушите полоски на бумаге, не касаясь гель для удаленияИзбыток EB. Загрузка каждую полоску на верхней части 9-16% градиентном геле SDS-PAGE. Добавление небольшого объема SDS-электрофореза буфер (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 0,1% SDS вес / объем) в верхней части геля, чтобы облегчить нагрузку на полосу.
2. Уплотнение гель путем добавления ~ 5 мл раствора агара (0,8%), чтобы предотвратить плавающей полосы, а затем собрать электрофоретического устройства и заполнить в ДСН-электрофореза буфер. Выполните прогон при 60 мА / гель в течение 4 ч при 4 ° С.
3. Снимите гель с электрофоретической блока и поместите его в клеточку окрашивания.

2.3) Silver Stain для препаративного гель

FIXER	50% метанол 12% уксусной кислоты 0,05% формалине	2 часа (или на ночь) *
WASH БУФЕР	35% Ehanol	20 мин (Повторите шаги три раза)
Сенсибилизирующее	0,02% натрия тиосульфат	2 мин
WASH	H 2 O	5 мин (Повторите шаги три раза)
Нитрата серебра	0,2% нитрата серебра 0076% формалине	20 мин
WASH	H 2 O	1 мин (повторить шаг в два раза)
РАЗРАБОТЧИК	6% карбоната натрия 0,0004% натрия тиосульфат 0,05% формалина	До тех пор пока окрашивание не является достаточным
СТОП	50% метанол	30 мин
	* 2 ч требуется минимальное время для фиксации белка

Таблица 1.

ПРИМЕЧАНИЕ: Белковые пятна могут быть визуализированы с помощью окрашивания гелей с MS совместимой серебра пятно ^11. Все решения необходимодля окрашивания серебром, перечислены в таблице 1.

1. Подготовьте около 200 мл каждого раствора / геля и приступить, как указано в таблице 1. Осторожно добавьте каждый раствор в коробке окрашивания содержащего гель. Выполните все инкубации на качающейся платформе.
2. После окрашивания, удалить стоп-раствора и оставить гель в растворе 1% уксусной кислотой до приобретения.

2.4) Гель для сбора и анализа

1. Получение изображений с высоким разрешением, используя денситометр в течение 3 дней с окрашиванием.
2. Анализ 2-D модели белка с помощью программного обеспечения для 2-DE гелей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение позволяет быструю и надежную параллельного просмотра.
   1. Создайте проект, выбрав "создать новый проект" из контекстного меню. Создайте папку и импортировать гели, выбрав "гель изображения импорт" с .tif, .png. или .gel расширение.
   2. После того, как гели импортированы и добавлены к workspтуз, выполнить автоматическое обнаружение пятна выбрав гели для обнаружения пятна и выбрав "Правка> пятно> обнаружить" в меню.
   3. Далее выполните вычитание фона, выбрав из меню "вычитание фона". Примечание: После этого можно сравнивать несколько гели и для определения различий или сходства с помощью количественной и / или качественного анализа.

3 Белки Идентификация по MALDI-TOF MS анализа (Рисунок 3)

3.1) Белок Пищеварение

1. Промойте гель с водными и акцизных пятен, представляющих интерес с гелями либо руководство (резка с чистого скальпеля) или автоматизированным удаления.
2. Вымойте частиц геля водой (100-150 мкл), спин вниз (30 сек при 400 мкг в) и удалить жидкость.
3. Добавить равный объем (в зависимости от объема гель) в CH ₃ CN в кусочки геля и ждать в течение 10-15 мин до тех пор, пока кусочки геля усадки. Высушите частиц геля япа вакуумной центрифуге.
4. Добавить 75-100 мкл 10 мМ дитиоэритритола разбавленный в 50 мМ NH ₄ HCO ₃ и инкубировать в течение 30 мин при 56 ° C (снижение Step). Термоусадочная снова куски геля с CH ₃ CN, как описано в шаге 3.1.3.
5. Продолжайте алкилирования, добавив 75-100 мкл раствора 55 мМ йодацетамид разбавленного в 50 мМ NH ₄ HCO ₃ и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре в темноте.
6. Уменьшить кусочки геля еще раз с CH ₃ CN, используя достаточный объем, чтобы покрыть кусочки геля, как описано в шаге 3.1.3. Сушат в вакуумной центрифуге.
7. Увлажняет частиц в буфере, содержащем 25 мМ NH ₄ HCO _3, 5 мМ CaCl _{2, и 12,5 нг /} мкл трипсина при 4 ° С в течение 20 мин. Использование достаточный объем буфера для покрытия кусочки геля. Снимите не-всасывается супернатант с гелевых кусочки и добавить 25 мМ NH ₄ HCO _3, 5 мМ CaCl ₂ без трипсина к соуэ гель.
8. Оставьте образцов при 37 ° С, по меньшей мере 3 ч (минимальное время, необходимое для переваривания пептида) в течение ночи.

3.2) масс-спектрометрического анализа (сушеные техника капель)

1. Пятно 1 мкл аликвоты каждого образца на нержавеющей стали MALDI пластины и смешать с 1 мкл α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в качестве матрицы, составленной в 50% CH ₃ CN и 0,1% TFA.
2. Получение масс-спектров на масс-спектрометра MALDI-TOF. Накопить около 200 спектров в месте, регулируя интенсивность лазера, чтобы предотвратить насыщение сигнала или увеличить сигнал. Спектры процесса через Проводник программного обеспечения данных, как описано ниже:
   1. Импорт файл .dat и выполнить базовую коррекцию, выбрав "процесс> коррекция базовой линии". Калибровка массы, используя трипсин аутолиза продукты и матричные пики, выбрав "процесса> калибровки масса> ручной калибровки; выберите пики, близкие к т / г 855,1 и 2163,1 бу левый перетаскивания и выберите соответствующие справочные массы, затем нажмите «заговор» и «применить калибровку" в ручном окна калибровки.
   2. Отрегулируйте порог пиковой обнаружения ("пик> пик обнаружения"), дублировать Активный график ("дисплей> дублировать активный след"), выберите новую трассировку и выполнять deisotoping ("пиковый> deisotoping"). Используя макрос "getpeaklist", сформировать список масс, который будет использоваться для идентификации. При необходимости, вручную удалить шумовых сигналов определена в виде пиков для очистки списка и получить лучшую идентификацию.
3. Определить белки путем поиска всеобъемлющей базы данных без резервирования белка, используя глубокие и талисман, как поисковые системы ^12.
   1. Используйте следующие параметры во всех поисков: один пропущенный расщепление за пептида, окисление метионина в качестве переменной модификации, цистеин carbamidomethylation как фиксированной модификации и INITIаль масса допуск 50 частей на миллион.

4 цитоскелета активности Анализы (Рисунок 4)

ПРИМЕЧАНИЕ: Ресуспендируют клеток очищают на шаге 1 в полной RPMI (10 ⁶ клеток / 200 мкл).

4.1) Анализ миграции. Этот тест позволяет количественно определить миграционного потенциала анализируемых клеток (лимфоцитов). Используйте Transwell камеру 6,5 мм в диаметре и размером пор 5,0 мкм и проведение анализов в трех экземплярах. Оптимизация размер пор и время миграции (Step 4.1.3) в случае различных типов клеток.

1. Подготовьте нижнюю камеру добавлением 600 мкл полной среды RPMI с добавлением или без конкретных стимулов (т.е. SDF-1) для измерения индуцированного и спонтанного перехода соответственно.
2. Поместите верхнюю камеру на него и позволить системе равновесия в течение 30 минут при 37 ° С в инкубаторе.
3. Семенной 10 ⁶ клеток / 200 мкл в верхней палате (общее количество клеток) и инкубироватьПластина в течение 4 ч при 37 ° С в инкубаторе.
4. Снимите верхнюю палату, собирать средства массовой информации в нижней палате и мыть нижнюю палату один раз 1 мл PBS. Сбор PBS в трубке.
5. Центрифуга 5 минут при 300 мкг в, отбросить супернатант и ресуспендируют в 500 мкл PBS.
6. С помощью проточной цитометрии, подсчитать количество мигрировавших клеток через 1 мин после сбора. В случае изолированной популяции клеток не нужно добавить любой поверхности антитела. Проверьте количество клеток в би-мерное точка участка с учетом побочных расточает ячеек и количество событий визуализированных в 1 мин, что количество использовать для расчета.
7. Рассчитайте индекс миграции (ИМ), как:
   

4.2) Адгезия анализ. Этот анализ позволяет измерять емкость адгезии клеток. Выполните анализ в трех экземплярах.

1. Предварительно пальто 96-вэйLs пластина (с плоским дном) с 50 мкл / лунку либо 2% БСА-PBS (как фон) или 1 мкг ICAM-1, разводили в PBS в течение ночи при 4 ° С.
2. Промыть пластины дважды PBS и блокировать неспецифические сайты добавлением 2% БСА-PBS (100 мкл / лунку) в течение 1 часа при 37 ° С.
3. В то же время ресуспендирования клеток в 5 х 10 ⁶ / мл в полной среде RPMI, маркировать их с 1 мМ CMFDA-зеленой трекера клеток и инкубировать 30 мин при 37 ° С.
4. Добавить 1 х 10 ⁶ клеток / лунку в предварительно покрытых скважин после отбрасывания блокирующий раствор (Step 4.2.2) и инкубировать 1 час при 37 ° C.
5. Количественная адгезию с помощью ридера ELISA (Возбуждение фильтр: 485 нМ, фильтр эмиссии: 535 нМ). Выполните первое измерение на общего ввода (INPUT).
6. Промыть пластины аккуратно с 2% BSA-PBS (200 мкл / лунку) в 4 раза (х). Выполнение чтение пластины после каждого этапа промывки (адгезия _х).
7. После вычитание фона для каждого измерения, вычисления конкретных adhesион (адгезия):
   

4.3) полимеризация анализ. Это колориметрический анализ, что количественно F-актин полимеризации. Выполните анализ в трех экземплярах.

1. Ресуспендируют 1x10 ^ 6 клеток в 100 мкл подогретого полной среде RPMI и добавить определенный стимул (то есть α-IgM 20 мкг / мл) в течение 10 мин.
2. Остановка реакции с 400 мкл 4% параформальдегидом и зафиксировать клетки в течение 10 мин при комнатной температуре.
3. Промыть 3 раза ЗФР (центрифуге при 300 х г в течение 5 мин, 4 ° С).
4. Жидкость над осадком сливают и клетки проницаемыми ЗФР-сапонина 0,2% (200 мкл) на льду в течение 2 мин.
5. Промыть 3 раза PBS-сапонина 0,1% (центрифуги при 100 мкг в течение 5 мин, 4 ° С), отбросить супернатант и ресуспендируют в 100 мкл PBS-сапонина 0,1%.
6. Пятно с фаллоидином-AlexaFluor 488 (3 мкг / мл) в течение 30 мин при комнатной темпера тура в темноте.
7. Промыть 3 раза с PBS-0,1% сапонина. Удалите супернатант и ресуспендируют в 300 мкл PBS.
8. Определения количества F-актина с помощью проточной цитометрии, вычисления средней интенсивности флуоресценции (MFI) в фаллоидином. Анализ сгенерированные данные в одном измерении участка для получения гистограммы на основе интенсивности флуоресценции, значение MFI, как показано в докладе графа.
9. Измерьте F-полимеризацию актина (Δ F-актин) как:
   

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы выделили основные лейкозных В-клетки образуют PB больных ХЛЛ и мы проанализировали протеомные карты. Образцы (п = 104) были сгруппированы в две основные подмножеств основывается на клинических особенностей каждого пациента (плохо Погоды против хорошим прогнозом) и проводили срав?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Цель этой рукописи является описание оптимизированный протокол для идентификации молекул, вовлеченных в патогенез ХЛЛ, даже если этот подход может быть распространен на другие заболевания и / или других типов образцов ^16-18. Сравнивая протеомные профили 2 подмножеств ХЛЛ, хорош...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitril	MERCK	61830025001730
Ammonium Bicarbonate	SIGMA	A6141-500G
1,4-Dithioerythritol	SIGMA	D9680-5G
Iodoacetamide	SIGMA	I6125-25G
Calcium chloride dihydrate	SIGMA	223506-25G
Trypsin, Sequencing Grade	ROCHE	11418475001
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	SIGMA	C2020-10G
Trifluoroacetic acid	SIGMA	T6580
ZipTipµ-C18	MILLIPORE	ZTC18M096
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail	STEMCELL	15064
PBS	EUROCLONE	ECB4004L
FBS	DOMINIQUE DUTSCHER	S1810
Lymphoprep	SENTINEL DIAGNOSTICS	1114547
Trypan Blue	SIGMA	T8154
CD19	BECKMAN COULTER	082A07770	ECD
CD5	BECKMAN COULTER	082A07754	PC5
CD3	BECKMAN COULTER	082A07746	FITC
CD14	BD	345785	PE
CD16	BECKMAN COULTER	082A07767	PC5
CD56	BECKMAN COULTER	082A07789	PC5
Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit	GE-Healthcare	11-0033-64
Urea	SIGMA	U6504
Tris-Hcl Buffer	BIO-RAD	161-0799
CHAPS	SIGMA	C2020-10G
DTT	SIGMA	D9163-5G
IPGstrips	GE-Healthcare	17-1233-01	Linear pH 4-7 18cm
IPGbuffer	GE-Healthcare	17-6000-86	pH 4-7
Glycerol	SIGMA	G6279
PROTEAN II XL Cell	BIO-RAD	165-3188
SDS	INVITROGEN	NP0001
Acrilamide	BIO-RAD	161-0156
Agarosio	INVITROGEN	16500
Methanol	SIGMA	32213
Acetic Acid	VWR	631000
Formalin	BIO-OPTICAL	05-K01009
Ethanol	VWR	9832500
Sodium Thiosulfate	FLUKA	72049
Silver Nitrate	FLUKA	85228
Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer	Amersham Biosciences
ImageMaster 2D Platinum 5.0	Amersham Biosciences
Sodium Carbonate	MERCK	A0250292
MALDI-TOF Voyager-DE STR	Applied Biosystems
Data Explorer software (version 3.2)	Applied Biosystems
transwell chambre 6.6 mm diameter	CORNING	3421
RPMI	EUROCLONE	ECB2000L	WITH L-GLUTAMINE
Gentamicin	SIGMA	G1397
SDF-1	PREPROTECH	300-28A
Flat-bottom 96-well plate	BECTON DICKINSON	353072
BSA	SANTA CRUZ	9048-46-8
ICAM-1	R&D Systems	720-IC
CMFDA	Life Thechnology	C7025	Green
IgM	SOUTHERNBIOTECH	2020-02
Paraformaldehyde	SIGMA	P6148
Saponine	SIGMA	S-7900
Phalloidin	Life Thechnology	A12379	Alexa fluor 488