Ozmotik implantasyonu Pompalar ve Sistem izleyicilerin teslim fizyopatolojik Koşullarında Beyin Reorganizasyon Çalışması için

Özet

In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.

Özet

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.

Giriş

The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments ^1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain ^3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain ⁴. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug⁵. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen^2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor ^6,7.

Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections^8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity ^6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.

Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.

Protokol

Hayvan deneyleri hükümet onayı ile yapıldı (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 ve G1362 / 13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım NIH Rehberi dayalı.

1. Hazırlık, mini-ozmotik pompalar ve

1. Steril bir ortamda (yani., Hücre kültürü davlumbaz), pompa, kateter elde moderatör, beyin infüzyon kanülü ve aralayıcı diskler kullanılabilir (Şekil 1) akar.
2. Kanül iğnenin sadece ucu ventrikül ile temas halindedir ve böylece doğrudan ventriküller içine ilaçların verilmesi için tek bir boşluk disk kullanın. Baş aşağı forseps ile kanül tutun. Siyanoakrilat yapıştırıcı (CA) iki damla ekleyin ve bir boşluk diski tanıtmak.
3. Yukarı bakacak şekilde düz bir yüzeye kanül bırakın, böylece boşluk disk ve kanül kurudukça arasındaki tutkal.
4. Yaklaşık 2.5 cm bölümlerinde kateter kesilir.
5. Ea içinBu kateter içinde kabarcıkların oluşumunu önlemek için bunun içinde tamamen ve böylece tüm havayı ekstrüzyon pompa doldurmak için gerekli olacak kadar kanal pompası, ilgi konusu çözeltinin 300-350 ul az hazırlar. Kabarcıklar akışını engelleyecektir beyin içine çözeltisi.
6. Dikkatle akış moderatörlüğe kateter bağlayın.
7. Çözeltinin az miktarda, böylece bunun içindeki hava kabarcıklarını önlemek, pompa çıkana kadar beyin infüzyon kiti tarafından sağlanan iğnesine bağlanır 2 ml'lik bir şırınga kullanarak, pompa doldurun.
8. Dikkatle akış moderatör doldurup dikkat kateter kateter içinde kalan kabarcıklarını engellemek için.
9. Pompa içindeki akış moderatör tanıtın.
10. Doldurulduktan sonra, dikkatli bir şekilde kateterin ucuna kanül bağlayın. Bir kabarcık kanül çıkarın ve dikkatli bir şekilde taşıyıcı veya ilaç solüsyonu ile kateter dolum ve daha sonra kanül yeniden gündeme oluşturulduğu görülmektedir edin.
11. Pu yerleştirinSteril tuzlu su çözeltisi ile bir kapta mp ve 37 ° CO / N de bırakın.
12. Implantasyon öncesi kabarcık oluşumu için tekrar kontrol edin. Gerekli (yani., Kabarcıklar izlenir) Eğer kanül kaldırmak ve tüp dolum. Kanül takın. Bu çözeltinin bir kaç mikrolitre almalıdır.

Ozmotik 2. implantasyonu Pompalar

Not: Bu deneyler hayvanların% 1 izofluran (% 30 _O 2,% 70 _N 2 O) ile anestezi yapıldı için. Bu mevcut değildir ancak eğer anestezi intraperitoneal kullanımı da ¹¹ mümkündür.

1. Anestezi altında stereotaktik cihazda hayvan bulun ve anestezi altında iken kuruluğu önlemek için koruyucu bir merhem ile gözleri kapsamaktadır. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin.
2. O aşkın kürk Cutmakas veya tıraş makinesi ile ya reklam. Cilde zarar vermeden mümkün olduğunca kesin.
3. Antibakteriyel ve fungisit özelliklere sahip% 70 etanol ve dezenfektan ile cildi temizleyin.
4. Bir neşter ile orta hatta biraz sağında 1 cm'lik kesi açıp kafatası maruz.
5. Bir pamuklu çubuk ile kafatası temizleyin. % 70 etanol ile ıslatın ve kafatası üzerinde geçmek. Bu kafatası kurumaya neden olacaktır.
6. Kafatası ışığı kanaması varsa, herhangi bir kanama noktaları ortadan kaldırmak için bir cauterizer kullanın. Kan kanül yerleştirilir kez kemik üzerinde düzgün kurumasını CA önler.
7. Kanül implante edilecek kafatası noktasında bir işareti yapmak için stereotaktik aygıtı kullanın. Sol hemisfer koordinatlarına ventriküler infüzyon için -0.2 mm kaudal, bregmaya 0.9 yanal mm (Şekil 2A) bulunmaktadır.
8. Yavaşça 45 ° açı yaparak kafatası üzerinde matkap; Bu kazayla Brai girmesini engeller matkapn. Tekrar tekrar birkaç saniye matkap ve sonra delik ne kadar derin olduğunu kontrol edin. Kafatası inceltilmiş ama hala tam olarak nüfuz değil edildikten sonra sondaj durdurun.
9. Beyin tamamına erişim elde edilene kadar steril bir iğne ucu ile meninks kırın. Beyin zarar vermeyecek şekilde yavaşça çekin.
10. Bir pamuklu çubuk kullanarak% 70 etanol ile kafatası temizleyin.
11. Bir ön-kaudal yönde hayvanın derisinin altına düz bir forseps tanıtın. Pompa implante edilecek hayvanın sırtına deri altına alan açmak için forseps kullanabilir. Dış kateter ve kanül (Şekil 2B) ayrılan hayvanın sırtına Pompayı tanıtılması. Kaldırılır ve tespitin her türlü ihtiyacı yoktur kadar pompa bu konumda kalacaktır.
12. Dikkatle sonraki kanül iğne tutkal dört küçük damla koyun.
13. Dikkatle yanlara doğru hareket ettirmeden kafatası yoluyla iğne tanıtmak. 15-30 saniye konumda tutun uKanül, tamamen bağlı ntil (Şekil 2C.1). Bir ara disk kullanılmış ise bir kez yerinde, kanül dorso ventral yönde 2.5 mm ulaşacak. Düzgün takılı ise, kanül deneyin sonuna kadar kemiğe bağlı kalacaktır.
14. Çıkarılabilir sekmesinin üzerine bir parmağınızı yerleştirin ve sonra makas bir dizi (Şekil 2C.2) ile boynundan kesti diğer elinizi kullanın.
15. 5-0 sütür ile cilt üzerinde yara kapatın ve (Şekil 2D) enfeksiyonunu önlemek için yara üzerine povidon-iyot çözeltisi (PVP-I) ve bir kaç damla ekleyin.
16. Yeni kafes içine hayvan taşıyın. Hala ameliyat edilmemiş hayvanlara ameliyat hayvanları koymayın. İlaç uygulamaları sırasında kafeslerine yalnız pompalarla implante edilmiş hayvanları tutun.
17. Onlar uyanık ve sternum yatma kazanmış kadar sahipsiz fareler bırakmayın.

3. Pompa Removablel

Not: Genellikle deney pompası tarafından izin verilen teslimat süresi sonunda sona erecek, ancak bir uyuşturucu teslim takip olarak ikincil deneyler yapmak için pompayı kaldırmak mümkündür. Yolu izli enjeksiyonları yapmak için bu pompayı kaldırmak ve böylece gereklidir.

1. Anestezi altında seterotactic cihazda hayvan koyun ve anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için koruyucu merhem gözleri kapsamaktadır. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin.
2. Dikkatle pompa implantasyon gününde yapılan kesiden keserek cilt açın.
3. Cerrahi kelepçe ile kanül tutun ve çekin. Kolayca kafatası çıkarılmalıdır. Nazik kanama beklendiği gibi, bir pamuklu çubuk yerleştirerek onu durdurmak ve 1-2 dakika bekleyin.
4. Kateter pompayı dışarı çekin. Kendisio iterek cilt üzerinde baskı oluşturarak çıkıp lp.
5. 5-0 sütür ile tekrar yara kapatın ve PVP-I birkaç damla ekleyin.
6. Yeni kafes içine hayvan taşıyın. Do hala ameliyat edilmemiş hayvanlara ameliyat hayvanları koymak değil. Ameliyat geçiren hayvanlar bir araya getirilebilir.
7. Onlar uyanık ve sternum yatma kazanmış kadar sahipsiz fareler bırakmayın.
8. Hayvan yolu tracer enjeksiyonundan geçmeden önce 10 gün boyunca kurtarmak için izin verin.

Sağ Motor cortex 45 ° Açılar at 4. Basınç Yolu Tracer Enjeksiyon

1. Anestezi altında stereotaktik cihaz üzerinde hayvan koyun ve anestezi altında iken kuruluğu önlemek için koruyucu bir merhem ile gözleri kapsamaktadır. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin.
2. Baş yara açın.
3. C% 70 Etanol bir pamuklu bir bez kullanarak kafatası yalın.
4. Cihazın dikey tutucu bir 5 ul cam şırınga (26S ga) tanıtın. Cam tutucu alt uç tutucu parçasına tam olduğundan emin olun. O zaman dikey konumdan 45 ° yerleştirin ve enjeksiyon yapmak imkansız olacak gibi şırınga çok altında olmamalıdır.
5. Bregma üzerinden doğrudan şırınga yönlendirmek ve ardından istediğiniz koordinatları bulun. Point # 1: 0,5 mm rostral ve 2,5 mm bregma göre yanal motor korteks koordinatları bir enjeksiyon içindir. Point # 2: 1,34 mm rostral, bregma göre 2,5 mm yanal.
6. Koordinatları bulunduktan sonra, ince bir ucu ile bir işaretleyici ile kafatası üzerinde konumlarını gösterir. Doğru koordinat gizlemek olabilir aşırı mürekkep sürümü olarak kafatasında tek bir nokta yapın.
7. Dikkatle 45 ° matkap tutan kafatası matkap. Tam perf değildir, böylece adım 2.8 olduğu gibi, sık kafatası kontrolmatkap yol açtığı beyin hasarı önlemek için orated. Tüm kemik kaldırıldı emin olmak için bir şırınganın ucu kullanın.
8. Şırıngaya yolu izleyici seyreltme 600 nl yükleyin.
9. Hayvanın sağ tarafına doğru 45 ° dikey konumunu ayarlar. Mikroskop altında, sağ deliğin önünde şırınga en iğne ucu yerleştirin.
10. 1,5 mm dikey yönde hareket ettirin. Basınç enjeksiyonları yapmadan önce 30 saniye ile 1 dakika boyunca bu pozisyonda iğne istikrarlı edelim.
11. 30 saniye süre ile birbirinden ayrılmış 100 nl üç adımda izleyici seyreltme 300 nl enjekte edilir. Son enjeksiyondan sonra beyin akmaya izleyici önlemek için 30 saniye ile 1 dakika için sürekli şırınga bırakın.
12. Yavaşça, şırıngayı çekin ikinci deliğin üzerine taşınmaya ve şırınga içinde olan, kalan 300 nl aynı işlemi tekrarlayın.
13. İkinci enjeksiyondan sonra, şırınga kaldırmak ve Wou kapatmak için devamnd ve 5-0 sütür ile PVP-I birkaç damla ekleyin.
14. Yeni kafes içine hayvan taşıyın. Do hala ameliyat edilmemiş hayvanlara ameliyat hayvanları koymak değil. Ameliyat geçiren hayvanlar bir araya getirilebilir. Onlar uyanık ve sternum yatma kazanmış kadar sahipsiz fareler bırakmayın.
15. Hayvan kurban önce 10 gün boyunca kurtarmak için izin verin.

5. Yolu Tracer Gözlem

1. Kurumsal kurallarına göre tamamen hayvan anestezisi. Parmaklarla ya da bir forseps ile basıldığında arka ayağın içinde yanıt eksikliği gözlemleyerek anestezi onaylayın. Hayvan tamamen uykuda kadar devam etmeyin.
2. Standart protokoller ⁶ altında PBS içinde% 4 paraformaldehid (pH 7) ile hayvanların serpmek.
3. % 4 paraformaldehid O / N daldırma yoluyla beyin ve sonrası düzeltme onu kaldırın.
4. Beyin lavaboya kadar% 30 sakaroz olarak beyinleri cryoprotect. Sonra beyinleri çıkarın ve 10 saniye Imme onları dondurmaksıvı nitrojen içinde rsion. Bölümler üretilmektedir kadar -80 ° C'de beyinleri tutun.
5. Bir cryostate üzerinde kesit ile retrograd yolu tracer analizi ve anterograde yolu izleyici analizi için 40 mikron 20 mikron de bölümleri üretin.

Not: FG etiketli nöronlar ultraviyole ışık uyarma altında beyaz hücreler olarak görülebilir. BDA elyaf ^6,7 kontrastının arttırılması için bir avidin-biyotin-peroksidaz kompleksi ve% 0.4 nikel ilavesiyle 3,3 'diaminobenzidin ile O / N içerikli inkübasyon ile tespit edilir.

Sonuçlar

Biz 3 gün sonra başlayan 30 gün boyunca ozmotik pompalar (Şekil 1, Şekil 3) vasıtasıyla doğrudan beyne rhEPO teslim sonra sol striatum lezyon ve uyaran intraluminal sütür yöntemiyle orta serebral arter tıkanıklığı 30 dakika hayvanların teslim strok ^6. Şekil 4 CB ve BDA enjeksiyonu ve izleyiciler enjekte edildi alana sonrasında takip edildi kortiko spinal kanalın şemasını göstermektedir. Biz sırasıyla rhEPO teslimat 14 ve 42 gün sonra kavrama gücü ve motor performansı (Şekil 5) bir iyileşme gösterdi. Sol striatum bir inme alınan hayvanların sağ motor korteksin içine BDA teslim olarak lifleri çimlenme başarılı boyama gösteren kırmızı ve yüz çekirdek düzeyinde orta çizgiyi motor lifler bir artış (Şekil 5) gösterdi miniosmot ile farmakolojik bir tedavi sonucuic pompalar. rhEPO tedavisi de yaygın astrositoz gecikmiş nöronal hayatta kalma artmış glial skar oluşumu azalır ve çalışılan dönemde ⁶ anjiyogenez arttı. Yolu izleyici enjeksiyon için aynı tekniği kullanarak başarılı retrograd yolu izleyici FG enjeksiyonu (Şekil 6) tarafından korteks bağlı talamik çekirdekleri algılayabilir.

Şekil Bu protokolde kullanılan mini-ozmotik pompa 1. Bileşenleri. Aralama disk, kanül ve çıkarılabilir sekme, kateter, akış moderatör ve mini-ozmotik pompa görülebilir. Tam olarak monte pompa yönü Şekil 2A görülebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

ithin-page = "1">
Pompa implantasyonu kilit noktaları 2. Özeti Şekil. Yanında tam olarak inşa, mini-ozmotik pompa ile stereotaktik cihaz yerleştirilir (A), fare gösterilmiştir. Ok implantasyonu için seçilen koordinatları gösterir. (B) pompa hayvanın sırtında tanıttı ve sadece kanül dış yüzeyinde kalır edilmiştir. İmplantasyondan sonra baş kafatası önceden delinmiştir. (C) boy. (C.1) kanül konumuna ancak çıkarılabilir sekme kesilmiş edilmemiştir. (C.2) çıkarılabilir sekme kesilmiş ve dikiş arasında olmuştur Yara hemen başlayabilir. (D) yıldız 30 gün implantasyon (#) sonra, bir hayvan ile karşılaştırıldığında, bir son implante hayvan gösterir. Doğru yer zaman görüntüde gösterildiği gibi, yara prosedürü sonuna kadar kapalı kalmalıdır.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3. korteks üzerinde implantasyon siteyi gösteren Nissl boyama. Küçük bir kesi, sol korteks (ok) kısmında görülebilir. Nüfuz alanının genişliği yaklaşık 50 mm. Karşılık gelen karşı taraftaki bölgede (*) ile karşılaştırıldığında Nissl boyama göre belirgin bir ciddi doku değişiklikler vardır. R: Sağ hemisfer. L: Sol yarım küre. Ölçek çubuğu = 300 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. YoluReitmeier ve ark., ^6,7 ile daha önce yayınlanmış olan izleyici enjeksiyon stratejisi. (A) CB ise kontralateral motor korteks de yolu izleyici BDA için şematik belirten enjeksiyon siteleri enfarkte yarımkürenin motor kortekste enjekte edildi. Lifler gösterilen kırmızı çekirdeğe (gösterilmemiştir) ve yüz çekirdeğe (Şekil 5). (B) aşağıdaki motor korteks anterograd yolu izleyici BDA enjeksiyon site takip edildi. Siyah ok BDA etiketli birkaç kortikal hücreler gösterir, oysa iğne izi gösteren kırmızı ok unutmayın. Cx: Cortex. CC: Korpus kallosum. V: Ventrikül. FN: Sakal çekirdeği. B Ölçek çubuğu = 200 mikron. Şekil 4A tür izni ⁶ çoğaltılamaz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

RhEPO doğum sonrası enfarkte beyin Şekil 5. Kurtarma. (A) BDA contralesional motor korteks enjekte daha sonra yüz çekirdeğin seviyesinin (bregma -5.8 mm -6,3 mm) kortikobulbar lifleri tespit edilir. Her bir yarım küre üzerinde kesişme hatları orta hat ve ipsilesional ve contralesional yarımküre yönünde her satırı geçen liflerin paralel çizildi sayılır ve kortikospinal sistem toplam etiketlenmiş liflerin yüzdesi olarak ifade edildi. Araçlar + Eritropoietin contralesional yüz çekirdek Veri yönünde lif geçişleri arttı vardır - SD. Veriler en az önemli farklar testleri, §P <0.05 araçla tedavi edilen iskemik olmayan fareler ile karşılaştırıldığında. (B) motor davranışı rota çubuk testinde el kavrama gücü ve koordinasyon bir iyileşme göstermiştir ve ardından tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. Veriler ortalama valu vardıres + - SD. Veriler, her zaman noktası için tek yönlü ANOVA / en az önemli farklar testleri, ardından iki tekrarlı ölçümler ANOVA ile analiz edilmiştir. §P 5A ve B tür izni ⁶ ile yeniden üretilir Şekil. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6. Hedef yapıları Fluorogold (FG) enjeksiyonundan sonra ulaştı. (A) motor korteksin yanında FG enjeksiyon sitesi Şekil 1'de gösterildiği gibi. İğne parça ve birkaç etiketli hücreleri gösteren beyaz ok gösteren kırmızı ok Not Korteks. (B) FG motora yakın enjektekorteks VPL saptanır. Fi: fimbria. IC: İç kapsül. RT: Talamik retiküler nükleus. VPL: Talamik ventral posterolateral çekirdek. Ölçek çubuğu = 200 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Uzun yıllar boyunca, iskemik inme veya travmatik beyin hasarı gibi nörodejeneratif koşulları araştırma akut inme aşamasında nöronal canlılığı teşvik etmeyi amaçlamaktadır nöroprotektif tedavilerin geliştirilmesi üzerine odaklanmıştır. Kliniğe çevrilirken bulunmuştur ilaç tedavilerinin büyük çoğunluğu başarısız kemirgen modellerinde etkili olduğu bulunmuştur. Bu tedavi başarısızlığının nedenleri arasında, ancak fonksiyonel nörolojik iyileşme kalıcı sonuçlanan sürekli ilaç etkileri olmaması sınırlı değildir. Bu uzun vadede beyin yenileme teşvik stratejileri geliştirmek ve böylece önemlidir. Nöronal hayatta kalma promosyon yalnız başarılı inme kurtarma izin vermek için yeterli değildir, çünkü başarısız nöro çalışmaların çok sayıda tarafından önerilen, nöronal plastisite uyarılması son zamanlarda alanında büyük bir ilgi aldı.

Ilaç dağıtım olan intraperitoneal enjeksiyon, kuyruk intravasküler i için araçlarnjection femoral enjeksiyon, tek stereotaktik beyin içine vektörlerin enjeksiyon ve mini-ozmotik pompalar ile sabit teslim sürdürdü. Pompa bir kanül yoktur, ya da biz beyne teslimat için gösterdiği gibi, organı yönlendirilmiş edilebildiği takdirde ikincisi, sistemik teslimat içerebilir. Mini-ozmotik pompalar hariç ve viral vektörlerin kullanımı, tüm diğer stratejiler dalgalı ilaç konsantrasyonları neden olacaktır. Uzun süreli deneyler için böylece sıklıkla enjeksiyonlarını alan strese hayvan göndermek için gerekli olur. BBB beyinde terapötik konsantrasyonları elde etmek için büyük bir protein ya da ilaç dozlarına ihtiyaç sonuçlanan kan protein veya ilaçların beyne alınmasındaki için önemli bir engel getirmektedir. Örnek Pellegrini ve diğerleri için. 30 g (300 g bir fare için 750 IU / gün), bir hayvan için 75 lU / gün eşdeğer bir dozda intraperitonal enjeksiyon yoluyla rhEPO teslim (2013) ^5. Buna karşılık, rhEp teslim hedeflenenbeyne o bize 0,25 ul / saat sabit bir hızda büyük bir zaman ölçeği üzerinde iyileşme elde etmemizi sağladı başarılı inme kurtarma için çalışmamızda, sadece 10 IU / gün çok daha düşük dozda kullanmak için izin.

Bu çalışmada biz, böylece BBB engellemeyi, ventrikül içine doğrudan plastisite teşvik protein rhEPO sunmak için kafatasına bağlı bir kanül mini pompalardan implantasyon yöntemini göstermiştir. Bu yöntem ile, rhEPO enfarktüs boyutunun azaltılması, glial yara oluşumunun azaltılmasına ve anjiyogenez indüksiyonu da dahil olmak üzere, bir dizi yolla, nörolojik düzelme sağlamıştır. rhEPO da nöronal hayatta kalma terfi ve Denerve kırmızı çekirdek ve yüz çekirdekleri karşı contralesional motor korteks gelen projeksiyonlar yükselmiştir. Liflerin filizlenme motor korteks (Şekil 4A ve 5A) içine anterograd yolu izleyici BDA enjeksiyonuyla ortaya çıktı. Liflerin filizlenmesi için fonksiyonel bir korelasyon prmotor becerilerinin geliştirilmesi (Şekil 5B) tarafından ovided. Buna ek olarak, sistem izleyici enjeksiyon için aynı yaklaşım retrograd yolu tracer FG (Şekil 6B) enjeksiyonu ile talamo-kortikal bağlantıları meydana çıkarmak için uygulanabilir olduğunu göstermiştir.

Mini-ozmotik pompası hazırlanmasında, hedef noktası ve aralama kullanımını dikkate için kritik öneme sahiptir. Biz birlikte, 0.9 mm yanal, iğnenin çok uç verilen koordinatlarda ventrikül ile temas (-0.2 mm kuyruktaki bu yolla olduğu gibi 0.5mm 2,5 mm dorso ventral iğnenin uzunluğu azaltmak için bir ayırıcı kullanabilirsiniz Bregma saygı). Derin yapılar Araştırmanın hedefi olan ancak, daha sonra hiçbir pullar ihtiyaç duyulacaktır. Daha harici teslim noktası isteniyorsa Benzer şekilde, (yani., Korteks), daha sonra boşluk diskler gerekli olacaktır. Pompa kafasının çok yakın değildir bu yüzden MM'nin hareketlerini engelleyecektir kateter, yeterince uzun olmalıdırse, aynı zamanda çok uzun zaman olduğu gibi bir kez implante aşırı uzunluğu böylece fare doğal hareketi ile kanül çıkarılması riskini artıran, kateter eğilmesine neden olabilir. Kateterin 2 cm bir bölümü hareketlilik ve implantın stabilitesi (Şekiller 1 ve 2) açısından çok iyi sonuçlar vermektedir. 37 ° CO / N pompanın Kuluçka pompa hemen implantasyon anında beyine ilaç pompalamaya başlamanızı sağlar.

Mini-ozmotik pompa implantasyonu o kafatası düzgün kanül implante önce kurutulur sağlamak için kritik öneme sahiptir. Genellikle kuru kemik neden olacaktır% 70 Etanol ile temizlik, ama sürekli kanama tespit edilmesi halinde, bir cauterizer hafifçe kafatası dokunmadan tamamen kurur. Bu iğne giriş mümkün olduğu kadar dikey ve yavaş olduğundan emin olmak için önemlidir. Pozisyonda, ve tutkal kururken sonra, kanül üstünde parmak yerleştirme ov yanlara hareket etmesini önlerkafatası er. Özel bakım kanül yara ve yerleştirme verilmelidir. Bu kesi tam kafatasının orta hat üzerinde ama biraz sağ tarafında gerçekleştirilmez önemlidir. Yarayı kapatırken insizyon orta hattında yapıldığı takdirde, cilt ve böylece yara açılması riskini artırarak, overstretched olacaktır. Bir tarafa hafifçe kesi yaparak dikiş noktaları kanül en yüksek kesiminde uzak olmasını sağlayacaktır. Sonuç olarak orada dikiş noktaları daha az gerginlik olacak ve yara düzgün iyileşir. Hayvanlar yalnız kafesli ve özellikle implantasyon sonrası ilk 10-15 gün boyunca, her gün kontrol edilmelidir. Yara açılması durumunda, yaralar kısa sürede kapalı olması gerekir. Kanül çıkarılır veya hayvan enfeksiyon sunarsa, deney sonlandırılır için vardır. Kanülün yeniden implantasyonu tavsiye edilmez. Başarılı implantasyon doku reklamın yeterli miktarda kullanmak için çok önemlidirhesive (çok değil!) bu kemik alçaltır ve kanül çıkarılması riskini artırır olarak. Ancak, aynı zamanda kemiğe bağlı kanül tutmayacağını çok az yapıştırıcı kullanılarak. Mini-ozmotik pompalar Çözücü biyolojik olarak uyumlu olan, bu tek sınırlama olarak, maddelerin çeşitli içinde çözülmüş ilaç taşıyabilir. Buna ek olarak, hacim ufak olacak verilen (200 ul), bir deney için gerekli konsantrasyon uygun olup olmadığını tespit olmalı ve pompa içindeki çökelmesine neden olmaz.

Anterograd veya retrograd ya izleyiciler ile izleme Yolu beyin bağlantısı ve plastisite incelemek için çok iyi kurulmuş bir tekniktir. Tek incelemek istediği beyin alanı hedefleme doğruluğunu sağlamak için enjekte dikkatli kullanımı stereotaktik çerçeveler verilmelidir (korteks enjekte ederken, yani korpus kallosum üzerinde enjeksiyon engellemek için).

Tüm cerrahi müdahaleler için ve ağrıyı azaltmak için veinflamasyon, hayvanlar müdahaleden sonra üç gün / kg, günde bir kez 4 mg müdahale ve Caprofen önce 0.1 mg / kg Buprenorfin ile tedavi edilmelidir.

Sonuç olarak, bu yaklaşım, zamanda beyin plastisitesi çalışmalar için uygun olan bir yöntem temsil yaralı beyinde protein ya da farmakolojik bileşiklerin etkisini incelemek için uygun bir araç sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alzet miniosmotic pump. Model 2004.	Alzet	000298	Drug container
Brain infusion kit 3 1-3 mm	Alzet	0008851	Drug brain delivery system
Loctite  454 Prism gel	Loctite	45404	Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull
75N glass syringe	Hamilton	87900/00	Injection of tract tracers
Biotin Dextran Amine (10,000 MW)	Molecular probes	N-7167	Anterograde tract tracer
Fluorogold	Fluorochrome, LLC.		Retrograde tract tracer
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection.