Miniosmotic의 주입 펌프 및 요로의 트레이서의 배달 병태 생리 학적 조건에서 뇌 조직 개편을 연구에

요약

In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.

초록

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.

서문

The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments ^1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain ^3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain ⁴. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug⁵. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen^2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor ^6,7.

Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections^8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity ^6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.

Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.

프로토콜

동물 실험은 정부의 승인을 수행 하였다 (G1361 / 13, AZ84-02.04.2013.A192 및 G1362 / 13 AZ84-02.04.2013.A194, Bezirksregierung 뒤셀도르프) 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드 라인을 기반으로.

Miniosmotic 1. 준비 펌프

1. 무균 환경에서 (예., 세포 배양 후드), 펌프, 도관을 얻었다 중재자 뇌 주입 뉼러 및 스페이서 디스크 사용되는 (도 1)를 흐른다.
2. 캐 뉼러 바늘의 선단이 심실과 접촉하도록 뇌실에 직접 약물을 전달하기위한 하나의 스페이서 디스크를 사용한다. 거꾸로 집게로 캐 뉼러를 잡습니다. 시아 노 아크릴 레이트 접착제 (CA)의 2 방울을 추가 한 스페이서 디스크를 소개합니다.
3. 위쪽으로 향하도록 평평한 표면에 캐 뉼러를 남겨 있도록 스페이서 디스크와 캐 뉼러가 마를 사이의 접착제.
4. 약 2.5 cm의 섹션에 카테터를 잘라.
5. EA의 경우이 카테터 내의 기포의 형성을 방지하기 위해 그 안에 완전히 따라서 모든 공기를 압출 펌프를 채우기 위해 필요하므로 CH 펌프 관심 용액 300-350 μL의 최소의 준비. 거품의 흐름을 방해 할 것이다 뇌에 솔루션을 제공합니다.
6. 조심스럽게 흐름 운영자에 카테터를 연결합니다.
7. 용액의 양이 적은 내부에 따라서 기포를 방지하는 펌프를 탈출 할 때까지 뇌 주입 키트가 제공 바늘에 연결된 2 mL를 주사기를 사용하여 펌프를 채운다.
8. 조심스럽게 흐름 운영자를 작성하고주의를 기울이고 카테터는 카테터 내부에 남아있는 거품을 방지하기 위해.
9. 펌프 내부의 흐름 사회자를 소개합니다.
10. 충진되면, 신중 카테터의 끝을 연결하는 캐 뉼러. 이는 거품이 캐뉼라를 제거하고 신중 비히클 또는 약액으로 카테터 리필 후 캐뉼라를 재 도입 형성되는 것을 관찰하는 경우.
11. PU 배치멸균 생리 식염수와 컨테이너의 MP와 37 ° CO / N에두고.
12. 주입하기 전에 거품 형성을 위해 다시 확인. 필요 (예., 기포가 관찰되는) 경우 정맥을 제거하고 튜브를 리필. 정맥을 다시 연결합니다. 이 솔루션의 몇 마이크로 리터를 취해야한다.

Miniosmotic 2. 주입 펌프

주 :이 실험 동물은 1 % 이소 플루 란 (30 % O _2, 70 % N ₂ O)로 마취시켰다 들어. 이 사용할 수없는 경우, 그러나, 마취의 복강 내 주사의 사용은 ^{11 일} 수있다.

1. 마취하에 정위 장치에서 동물을 찾아 마취 동안 건조를 방지하기 위해 보호 연고와 눈을 커버한다. 손가락 또는 집게로 누르면 뒷발에 응답의 부족을 관찰하여 마취를 확인합니다. 동물이 완전히 잠이 될 때까지 진행하지 마십시오.
2. 그 위에 모피를 잘라가위 면도 기계와 하나의 광고. 피부 손상없이 가능한 한 많이 잘랐다.
3. 항균 및 살균제 특성을 가진 70 % 에탄올 및 살균제로 피부를 청소합니다.
4. 메스로 정중선의 오른쪽에 약간 1cm 절개를 열고 두개골을 노출.
5. 면봉으로 두개골을 청소합니다. 70 % 에탄올을 만끽하고 두개골에 그것을 전달합니다. 이 두개골은 건조 유도 할 것이다.
6. 두개골 빛 출혈이있는 경우, 출혈 점을 제거하기 위해 cauterizer를 사용합니다. 혈액은 정맥을 이식하면 뼈를 통해 제대로 건조에서 CA를 방지 할 수 있습니다.
7. 캐 뉼러가 주입됩니다 두개골의 지점에 표시를 만들기 위해 정위 장치를 사용하십시오. 왼쪽 반구 좌표에 심실 주입 용 -0.2 mm의 꼬리, 브레 그마 0.9 측면 MM (그림 2A)입니다.
8. 조심스럽게 45도 각도를 만드는 두개골을 통해 드릴; 이 실수로 꼰 로프 코에 들어 가지 드릴 것을 방지엔. 반복하여 몇 초 후 드릴 구멍이 얼마나 깊게 검사. 두개골 두께가 얇아지기는하지만, 아직 충분히 침투하지 된 후 시추 중지합니다.
9. 뇌에 대한 모든 권한이 달성 될 때까지 멸균 된 바늘의 끝 수막 휴식. 뇌를 손상하지 않도록 매우 조심스럽게 수행합니다.
10. 면봉을 사용하여 70 % 에탄올로 두개골을 청소합니다.
11. 안테 - 꼬리 방향으로 동물의 피부 아래에 직선 집게를 소개합니다. 펌프가 이식 될 동물의 뒷면에있는 피부 아래 공간을 열려면 집게를 사용합니다. 외부 카테터와 정맥 (그림 2B)를 떠나 동물의 뒷면에 펌프를 소개합니다. 이 제거되고 어떤 종류의 고정을 필요로하지 않을 때까지 펌프가이 위치에 남아있을 것이다.
12. 조심스럽게 옆에있는 정맥에 바늘에 접착제의 네 개의 작은 방울을 배치합니다.
13. 조심스럽게 옆으로 이동하지 않고 두개골을 통해 바늘을 소개합니다. 15 ~ 30 초 동안 위치에 고정 U정맥이 완전히 연결되어 ntil (그림 2C.1). 하나 스페이서 디스크가 사용 된 경우 일단 자리에, 정맥은 배측 복부 방향으로 2.5 mm에 도달합니다. 적절하게 장착 된 경우, 캐 뉼러는 실험이 끝날 때까지 뼈에 부착 된 상태로 유지된다.
14. 이동식 탭을 통해 하나의 손가락 위치하게 한 후, 가위 세트 (그림 2C.2)과 목하여 잘라 다른 손을 사용합니다.
15. 5-0 봉합으로 피부에 상처를 폐쇄하고 (도 2D)에 감염을 방지하기 위해 상처 위에 포비돈 - 요오드 용액 ​​(PVP-I) 몇 방울을 추가한다.
16. 새 케이지에 동물을 이동합니다. 아직 운영되지 않은 동물들과 함께 운영 동물을 두지 마십시오. 약물 투여의 시간 동안 자신의 새장에서 혼자 펌프 이식 된 동물을 유지합니다.
17. 그들이 깨어과 흉골 드러 누움을 회복 할 때까지 무인 쥐를 두지 마십시오.

3. 펌프 Remova엘

주 : 일반적으로 실험에 의해 허용 펌프 납기의 끝에 종료되며, 그러나 그것은이 약물 전달 후속으로 차 실험을 수행하기 위해 펌프를 제거하는 것이 가능하다. 요로 트레이서 주사를 수행하기 위해서는 그 펌프를 제거 할 필요가있다.

1. 마취 seterotactic 장치에서 동물을 배치하고 마취 동안 건조를 방지하기 위해 보호 연고와 눈을 커버한다. 손가락 또는 집게로 누르면 뒷발에 응답의 부족을 관찰하여 마취를 확인합니다. 동물이 완전히 잠이 될 때까지 진행하지 마십시오.
2. 조심스럽게 펌프 주입의 날에 수행 절개를 통해 절단하여 피부를 엽니 다.
3. 수술 용 클램프 캐 뉼러를 잡고 잡아 당깁니다. 그것은 쉽게 두개골로부터 제거되어야한다. 부드러운 출혈이 예상됨에 따라, 면봉을 배치하여 중지하고 1-2 분 동안 기다립니다.
4. 카테터에 의해 펌프를 잡아 당깁니다. 남자그것은, 밀어 피부에 압력을 만들어 나올 LP로.
5. 5-0 봉합 다시 상처를 닫고 PVP-I 몇 방울을 추가합니다.
6. 새 케이지에 동물을 이동합니다. 수행 여전히 작동되지 않은 동물들과 함께 운영하는 동물을 넣지. 수술을받은 동물은 함께 넣어 수 있습니다.
7. 그들이 깨어과 흉골 드러 누움을 회복 할 때까지 무인 쥐를 두지 마십시오.
8. 동물이 기관의 추적 주사로 진행하기 전에 십일에 대한 복구 할 수 있습니다.

오른쪽 운동 피질에 45 ° 각도 4. 압력 요로 추적기 주입

1. 마취 정위 장치에 동물을 배치하고 마취 동안 건조를 방지하는 보호 연고 눈을 커버. 손가락 또는 집게로 누르면 뒷발에 응답의 부족을 관찰하여 마취를 확인합니다. 동물이 완전히 잠이 될 때까지 진행하지 마십시오.
2. 머리의 상처를 엽니 다.
3. 기음70 % 에탄올을 면봉을 이용하여 두개골 희박​​.
4. 장치의 수직 홀더 5 μL 유리 주사기 (26S GA)을 소개한다. 유리 홀더의 하단이 유지 조각을 정확하게 확인하십시오. 다음은 수직 위치에서 45 °로 배치하고 주입을 수행하는 것은 불가능하므로 주사기 너무 멀리 아래에있을 수 없습니다.
5. 브레 그마 바로 위에 주사기의 방향을 다음 원하는 좌표를 찾습니다. 포인트 # 1 : +0.5 mm 및 2.5 mm 입쪽은 브레 그마에 대하여 측 방향 운동 피질 좌표에 주사한다. 포인트 # 2 : 1.34 mm의 입쪽, 정수리에 대하여 2.5 mm 폭.
6. 좌표가 위치한되고 나면, 얇은 팁 마커로 두개골을 통해 자신의 위치를​​ 나타냅니다. 정확한 좌표를 숨길 수있는 과도한 잉크 출시로 두개골에 하나의 점을 확인합니다.
7. 조심스럽게 45 °에서 드릴을 들고 두개골을 드릴. 완전히 반환 한되지 않도록 단계 2.8에서와 같이, 자주 두개골을 확인드릴에 의한 뇌 손상을 방지하기 위해 orated. 모든 뼈 제거 된 것을 확인하기 위해 주사기의 끝을 사용한다.
8. 주사기로 기관의 추적 희석 600 NL을로드합니다.
9. 동물의 오른쪽으로 45 °의 수직 위치를 조정합니다. 현미경, 오른쪽 구멍 앞에 주사기의 바늘의 선단을 배치했다.
10. 1.5 mm 정도의 수직 방향으로 이동합니다. 압력 주입을하기 전에 30 초 분 1이 위치에 바늘이 정상 보자.
11. 30 초만큼 서로 분리 NL 100의 세 단계로 트레이서 희석액 300 NL을 주입. 마지막 주사 후, 두뇌의 유출 트레이서를 피하기 위하여 30 초 내지 1 분 동안 대면 주사기를 떠난다.
12. 천천히, 주사기를 꺼내 두 번째 구멍을 통해 위치를 변경하고 주사기 내부에 남아있는 300 NL과 같은 과정을 반복합니다.
13. 두 번째 주입 한 후 주사기를 제거하고 올릴 때를 닫 진행차와 5-0 봉합과 PVP-I 몇 방울을 추가합니다.
14. 새 케이지에 동물을 이동합니다. 수행 여전히 작동되지 않은 동물들과 함께 운영하는 동물을 넣지. 수술을받은 동물은 함께 넣어 수 있습니다. 그들이 깨어과 흉골 드러 누움을 회복 할 때까지 무인 쥐를 두지 마십시오.
15. 동물이 희생 전에 십일에 대한 복구 할 수 있습니다.

5. 요로 추적기 관측

1. 기관 가이드 라인을 완전히 동물을 마취. 손가락 또는 집게로 누르면 뒷발에 응답의 부족을 관찰하여 마취를 확인합니다. 동물이 완전히 잠이 될 때까지 진행하지 마십시오.
2. 표준 프로토콜 ^(6)에서 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PH 7)과 동물을 관류.
3. 4 % 파라 포름 알데히드에서 O / N 침수에 의해 뇌와 포스트 수정을 제거합니다.
4. 뇌가 가라 앉을 때까지 30 %에서 자당의 두뇌를 Cryoprotect. 그런 다음 머리를 제거하고 10 초 imme하여 그들을 동결액체 질소에 rsion. 섹션이 될 때까지 -80 ° C에서 머리를 유지합니다.
5. cryostate에 절편으로 역 행성 요로 추적 분석 및 선행 성 요로 추적 분석을 위해 40 μm의 20 μm의에서 섹션을 생성합니다.

참고 : FG 레이블 뉴런은 자외선 여기에서 백혈구로 관찰 할 수있다. BDA는 섬유 ^-6,7-의 콘트라스트를 향상시키기 위해 아비딘 - 비오틴 - 퍼 옥시다아제 복합체와 0.4 %의 니켈을 첨가 한 3,3 '디아 미노 벤지딘으로 O / N 항온 처리에 의해 검출된다.

결과

우리는 3 일 후에 시작하는 30 일 동안 miniosmotic 펌프 (그림 1, 그림 3)에 의해 직접적으로 뇌에 rhEPO로 전달 후 왼쪽 선조체 (striatum)에서 병변을 유도 관내 봉합 방법으로 중간 대뇌 동맥 폐색의 30 분에 동물을 제출 행정 ^6. 그림 4는 CB와 BDA 주입 추적자를 주입 된 영역 후 추적 된 cortico 척추 기관의 개략도를 보여줍니다. 우리는 각각 rhEPO로 전달의 14, 42 일 후에 악력과 모터 성능 (도 5)의 개선을 보였다. 왼쪽 선조체에 뇌졸중을받은 동물의 오른쪽 운동 피질에 BDA의 배달로 섬유를 돋 성공적으로 염색을 보여, 빨간색과 얼굴 핵의 수준에서 중간 선을 넘어 모터 섬유의 증가 (그림 5)을 보여 주었다 miniosmot와 약물 치료의 결과IC 펌프. rhEPO로 처리 또한, 확산 astrocytosis 지연, 신경 세포의 생존을 증가 폐해 흉터 형성을 감소하고, 연구 기간 ⁶ 혈관 신생을 증가했다. 요로 추적 주입이 같은 기술을 사용하여 우리는 성공적으로 역 행성 요로 추적 FG의 주입 (그림 6)에 의해 피질에 연결되어 시상 핵을 감지 할 수 있습니다.

그림이 프로토콜에 사용되는 miniosmotic 펌프 1. 구성 요소. 스페이서 디스크, 정맥 및 이동식 탭, 카테터, 흐름 위원장과 miniosmotic 펌프는 관찰 할 수있다. 완전히 조립 된 펌프의 화면은 그림 2A에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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펌프 주입 요점 2. 요약 그림. 옆 완전히 구성된 miniosmotic 펌프 정위 장치에 위치로 (A) 마우스가 도시된다. 화살표는 주입 선정 좌표를 나타낸다. (B) 펌프가 동물의 뒤쪽에 도입 만 뉼러가 외부에 남아있다. 이식 후 머리의 두개골이 이미 드릴되었습니다. (C) 화면. (C.1) 정맥 위치에 있지만 이동할 수있는 탭이 절단되지 않았습니다. (C.2) 제거 탭 잘라 바느질 된 상처가 이제 시작될 수있다. (D) 별표 30 일 주입 (#) 후 동물에 비해 최근에 주입 된 동물을 나타낸다. 제대로 수용 할 때 화상에 나타낸 바와 같이, 상처 절차의 종료까지 닫혀한다.ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3에 주입 피질 부위를 나타내는 Nissl 염색. 작은 절개가 왼쪽 피질 (화살표)의 부분에서 관찰 될 수있다. 투과 영역의 폭은 대략 50 μm의 것이다. 반대쪽 대응 영역 (*)에 비해는 Nissl 염색에 기초하여, 명확한 심한 조직 변화 없다. R : 오른쪽 반구. L : 왼쪽 반구. 스케일 바 = 300 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 요로Reitmeier 등. ^{6, 7에} 의해 이전에 발표 된 추적 주입 전략. (A) CB 반면 반대측 운동 피질에서 요로 추적 BDA에 대한 회로도를 나타내는 주사 부위가 경색 반구의 운동 피질에 주사 하였다. 섬유는 도시되어 적색 핵 (도시하지 않음)와 얼굴 핵 (도 5 참조). (B) 다음에 운동 피질에 선행 성 관 트레이서 BDA의 주사 부위를 관찰 하였다. 검은 색 화살표가 BDA으로 표시 몇 대뇌 피질 세포를 보여줍니다 반면 바늘 트랙을 나타내는 빨간색 화살표를합니다. CX : 코어 텍스. CC : 뇌량. V : 뇌실. FN : 얼굴 핵. B의 스케일 바 = 200 μm의.도 4a는 종류의 허가를 ^6으로 재생된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

rhEPO로 전달 후 경색 뇌의 그림 5. 복구. (A) BDA는 contralesional 운동 피질에 주입 후 얼굴 핵의 수준 (브레 그마 -5.8 mm의 -6.3 ㎜)에서 corticobulbar 섬유에서 감지된다. 각 반구에 교차 선이 중간 선 및 ipsilesional 및 contralesional 반구에 방향의 선을 넘어 섬유에 평행하게 그려진 카운트와 피질 기관에서 총 레이블 섬유의 백분율로 표시 하였다. 수단 + 에리트로 포이 에틴은 contralesional 얼굴 핵 데이터 방향으로 섬유 횡단을 증가 - SD는. 데이터는 최하위 차이 테스트, §P <0.05 차량 처리 된 비 허혈성 쥐와 비교. (B) 모터의 동작은 로타로드 테스트에서 핸드 그립 강도와 조정의 개선을 보여 주었다 다음 일원 분산 분석에 의해 분석 하였다. 데이터는 평균 가치있는이다ES + - SD. 데이터는 각 시간 점에 대한 일방향 ANOVA / 최하위 차이 테스트 이어 양방향 반복 측정 ANOVA로 분석 하였다. §P <사전 허혈성 기준에 비해 0.05; * P 차량 처리 허혈성 쥐에 비해 <0.05. 5A와 B 종류의 허가 ⁶ 재현들이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 6 표적 구조 fluorogold (FG)에 주입 한 후 도달했다. (A) 운동 피질 옆 FG의 주사 부위도 1에 나타낸 바와 같이. 니들 트랙 및 몇 표지화 된 세포를 나타내는 흰색 화살표를 나타내는 붉은 화살표 참고 피질. (B) FG 모터 근처에 주입피질 VPL에서 검출된다. 인터넷 : Fimbria. IC : 내부 캡슐. RT : 시상 망상 핵. VPL : 시상 복부 외측 핵. 스케일 바 = 200 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

몇 년 동안, 허혈성 뇌졸중이나 외상성 뇌 손상과 같은 신경 퇴행성 조건에 대한 연구는 급성 뇌졸중 단계에서 신경 세포의 생존을 촉진하는 것을 목표로 신경 치료의 개발에 초점을 맞추고있다. 병원에 번역 할 때 발견 된 약물 치료의 대부분은 실패 설치류 모델에서 효과가 있습니다. 이 치료 실패에 대한 이유를 포함하지만 기능적인 신경 학적 회복을 지속의 결과로 지속적인 약물 효과의 부족으로 제한되지 않습니다. 그것은 장기적으로 뇌의 리모델링을 촉진 전략을 개발하는 것이 중요하다. 신경 생존의 촉진만으로는 성공적인 뇌졸중 회복을 허용하기에 충분하지 않기 때문에 실패 신경 시험의 다수에 의해 제안 된 바와 같이, 신경 가소성의 자극은 최근 주요 관심 분야를 획득했다.

약물 전달되어 복강 내 주사, 꼬리 혈관 나는 수단njection, 대퇴 주입, 단일 정위 뇌에 벡터의 주입 및 miniosmotic 펌프에 의해 일정하게 배달을 계속했다. 펌프 뉼러가 없거나 우리가 뇌에 전달하기 위해 도시 한 바와 같이, 장기 지향 될 수있는 경우에 후자는, 전신 전달을 포함 할 수있다. miniosmotic 펌프의 예외 및 바이러스 벡터를 사용하여, 모든 다른 전략은 약물 농도 변동을 유도 할 것이다. 장기간 실험에 따라서 그것은 빈번한 주사를받는 동물에게 스트레스를 제출할 필요하게된다. BBB는 뇌에서의 치료 농도를 달성하기 위해 큰 단백질 또는 약물 투여의 필요성의 결과, 혈액에서 단백질이나 약물의 뇌 침투를위한 중요한 장애물을 부과한다. 예 페예 그리니 등 알하십시오. 30g (300g 쥐 750 IU / 일)의 동물 75 IU / 일에 해당하는 용량으로 복강 내 주사에 의해 rhEPO로 전달 (2013) ^5. 이에 비해, rhEp 전달을 타겟팅뇌에 O를 우리가 0.25 μL / hr의 고정 금리에 큰 시간 스케일을 통해 복구를 달성 할 수있었습니다 성공적으로 뇌졸중 복구를위한 연구에 10 IU / 일의 훨씬 낮은 복용량을 사용하는 것을 허용했다.

본 연구에서 우리는 따라서 BBB를 우회 뇌실에 직접 소성 촉진 rhEPO로 단백질을 제공하기 위해 두개골에 접속을 햄스터 뉼러와 주입 방법을 도시하고있다. 이 방법에 의해, rhEPO로는 경색 크기의 축소, 아교 흉터 형성의 감소 및 혈관 형성의 유도를 포함한 다수의 방식으로 신경 회복을 촉진. rhEPO로는 신경 세포의 생존을 촉진하고 denervated 빨간 핵과 얼굴 핵으로 contralesional 운동 피질에서 예측 증가했다. 섬유의 발아는 운동 피질 (도 4A 및 5A)에 선행 성 요로의 추적 BDA의 주입에 의해 밝혀졌다. 섬유의 발아에 기능적인 상관 관계는 홍보입니다운동 능력의 향상 (그림 5B)에 의해 ovided. 또한, 우리는 요로 트레이서 주입에 대해 동일한 방법이 역행 요로 트레이서 FG (도 6b)의 주사에 의해 thalamo 피질 연결 공개 적용될 수 있음을 보여 주었다.

miniosmotic 펌프의 제조에있어서, 상기 목표점과 스페이서의 사용을 고려하는 것이 중요하다. 우리는와, 0.9 mm 폭, 바늘의 매우 끝 주어진 좌표 뇌실 접촉 (-0.2 mm 꼬리에 이러한 방식으로 0.5mm의 2.5 mm 배측 복부를 바늘의 길이를 줄이기 위해 하나의 스페이서를 사용하여 브레 그마에 대해). 깊은 구조 연구의 대상이다 그러나 경우, 다음에는 스페이서가 필요하지 않습니다. 이상의 외부 배달 지점이 필요한 경우 마찬가지로, (예., 피질), 다음 더 스페이서 디스크가 필요합니다. 펌프가 머리에 너무 가까이되지 않도록이 양해 각서 (MOU)의 움직임을 방해하므로 카테터는 충분히 길어야한다SE는, 또한 너무 오래 같이 한번 주입 된 과도한 길이 따라서 마우스의 자연스러운 움직임으로 뉼러 제거의 위험성을 증가시키는, 카테터가 구부러 발생할 수있다. 카테터 2cm의 부분은 이동성과 임플란트의 안정성 (도 1 및 2)의 관점에서 아주 양호한 결과를 준다. 37 ° CO / N에서 펌프의 배양은 펌프가 즉시 이식의 순간에 뇌에 약물을 펌핑 시작할 수 있습니다.

miniosmotic 펌프 주입 그것은 두개골이 제대로 정맥을 이식하기 전에 건조되는 것을 보장하는 것이 중요합니다. 일반적으로 건조 뼈를 유도 할 것이다 70 % 에탄올로 청소하지만, 지속적인 출혈이 발견되면, cauterizer 부드럽게 두개골을 터치하면 완전히 건조합니다. 이 바늘의 도입 가능한 수직 및 느린 것을 보장하는 것이 중요하다. 위치 및 접착제가 건조되는 동안 한번 뉼러 위에 손가락을두면 OV 옆으로 움직이는 것을 방지두개골을 어. 특별한주의 캐 뉼러의 상처 및 배치에 주어져야한다. 이는 절개 정확히 두개골의 중간 라인 위에하지만 약간 우측으로 수행되지 않는 것이 중요하다. 상처를 닫을 때 절개 중간 배관에서 수행 된 경우, 피부 창상 따라서 개구부의 위험을 증가 심하게 잡아 것이다. 한쪽으로 약간 절개 만들기 봉합사 포인트 뉼러의 높은 부분으로부터 멀리 할 수​​ 있도록한다. 결과적으로이 봉합사 포인트 장력에 덜되며 상처가 제대로 치유 할 것이다. 동물은 혼자 갇힌 특히 이식 후 첫 10~15일 동안 매일 확인해야합니다. 권취 열개시, 상처는 가능한 빨리 폐쇄되어야한다. 캐 뉼러가 제거 또는 동물이 감염을 제시하는 경우, 실험을 종료한다. 캐 뉼러의 재 주입하지 않는 것이 좋습니다. 성공적인 이식 조직이 광고의 충분한 양을 사용하는 것이 매우 중요, 접착 테이프 (너무 많이!)는 뼈를 저하와 정맥 제거의 위험을 증가로. 그러나 또한 뼈에 부착 된 정맥을 보유하지 너무 작은 접착제를 사용. miniosmotic 펌프는 용매가 생체 적합성 이에 만 한정되는, 물질의 다양한 약물 용해를 수행 할 수있다. 또한, 음량이 작은 것을 소정의 (200 μL) 중 하나는 실험에 필요한 농도가 적합한 지 여부를 결정해야하고 펌프 내부에 침전을 유발하지 것이다.

선행 성 또는 역 행성 중 하나 추적기와 추적 기관은 뇌의 연결 및 소성을 연구하는 매우 잘 확립 된 기술이다. 하나 공부하고자하는 뇌 영역을 대상에 정확성을 기하기 위해 주입 할 때는주의가 사용 정위 프레임에 부여해야합니다 (피질을 주입 할 때 즉, 뇌량에 주입을 방지하기 위해).

모든 수술 개입과 통증을 감소시키기 위하여 및염증은, 동물의 개입 후 3 일 동안 / kg을 하루에 한 번 4 밀리그램의 개입과 Caprofen 전에 0.1 ㎎ / ㎏ 부 프레 놀핀으로 처리해야한다.

결론적으로,이 접근법은 또한 뇌 가소성 연구에 적합 방법을 나타내는 부상 뇌에서 단백질 또는 화합물의 약물 학적 효과를 연구하기위한 적절한 수단을 제공한다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alzet miniosmotic pump. Model 2004.	Alzet	000298	Drug container
Brain infusion kit 3 1-3 mm	Alzet	0008851	Drug brain delivery system
Loctite  454 Prism gel	Loctite	45404	Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull
75N glass syringe	Hamilton	87900/00	Injection of tract tracers
Biotin Dextran Amine (10,000 MW)	Molecular probes	N-7167	Anterograde tract tracer
Fluorogold	Fluorochrome, LLC.		Retrograde tract tracer
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)	Stoelting	53311	Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection.