Yanıt olarak erkek C. Elegans baş nöronlar Feromonlar nöronal aktivite görüntüleme için adapte mikrosıvısal koku kozu kullanımı

Özet

C. elegans erkeklerin verimli kalsiyum görüntüleme için bir adapte "koku çip" kullanımı burada açıklanmıştır. Gliserol ve bir feromon erkek maruz çalışmaların da gösterilir.

Özet

Kalsiyum göstergeleri kullanımını büyük ölçüde sinirsel dinamikleri ve yönetmelik anlayışımızı geliştirmiştir. Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans, tamamen eşleştirilmiş sinir sistemi ve şeffaf anatomi, kalsiyum göstergeler kullanarak gerçek zamanlı sinirsel dynamics anlamak için ideal bir model sunar. Mikrosıvısal teknolojileri ve deneysel tasarımlar ile birlikte, hem ücretsiz taşıma ve kapana kısılmış hayvanlarda kalsiyum görüntüleme çalışmaları bu göstergeler kullanılarak gerçekleştirilir. Ancak, içinde Chronis ve ark., açıklanan koku çip gibi yakalama aygıtları kullanan en önceki çalışmaları olarak daha az yaygın erkek hem morfolojik ve yapısal olarak daha yaygın hermafrodit olarak kullanılmak üzere tasarlanan aygıt var birbirine benzemeyen. Adapte bir koku çip tasarlanmıştır ve genç yetişkin hayvanlar kullanarak erkek nöronal görüntülemede verimlilik artışı için fabrikasyon. Bir dönüş hayvanlar döndürmek için ve 2D görüntülemede ikili bir çift bireysel nöronlar ayrılması için izin vermek için bağlantı noktası yükleme solucan içine dahil oldu. Solucanlar propil mikrosıvısal aygıt içinde kontrollü bir akış önceki hermafrodit çalışmalarda açıklandığı gibi maruz kalır. Kalsiyum geçişler sonra açık kaynak yazılım ImageJ kullanarak analiz edilir. Burada açıklanan yordamı erkek tabanlı C. elegans artan miktarda için izin vermelidir çalışmalar seks özgü nöronal sinyal verme mekanizmaları bizim anlayış derinleştirilmesi, Imaging kalsiyum.

Giriş

Yuvarlak solucanlar C. elegans,-ebilmek var olmak deneysel olarak işlenmiş¹gibi mikrosıvısal aygıtları tam kontrollü ortamlarda, artan erişim hayvanlar, neyin sağlar. Bu çalışmalar davranış deneyleri, kalsiyum görüntüleme çalışmaları veya hatta gösterimleri deneysel sonuçlar^{1,2,3,4daha kesin ölçümler sonucu belirli fenotipleri için dahil, 5,6}. Havacilik hangi aracılığıyla detaylı deneyler reaktifler en az miktarda gerçekleştirirken çalıştırılabilir küçük ölçekli sıvı koşulları sağlamak. Yeni mikrosıvısal cihaz tasarımları sürekli üretim ve her kullanımı, sinirsel görüntülemede kullanılan aygıtları yakalamak doğal sinüsoidal hareketi C. elegans davranış deneyleri ve sinirsel görüntüleme çalışmaları için izin arenalar gelen değişir ve yüksek üretilen iş fenotipik analizde genetik^4,5,6,7ekranlar için izin aygıtlara koku çalışmaları. Ana kalıp imalatı mikrosıvısal aygıt oluşturmak ucuzdur — efendi kullanılırlığı verilen — ve kullanımı kolay, bırakmak için hızlı veri üretimi ile yüksek-den geçerek çalışmalar. Fabrikasyon polimerler polydimethylsiloxane (PDMS) gibi kullanan aygıtların saat içinde yeni cihazlar yaratılması için izin verir.

Kalsiyum görüntüleme çalışmaları ifade hedef hücrelerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Turk) gerçek zamanlı^8,9,10,11bu hücrelere sinirsel dinamikleri ölçmek için kullanın. C. elegans şeffaf doğası bu proteinler Canlı hayvanlarda floresan düzeyde kayıt sağlar. Geleneksel olarak, Turk yeşil flüoresan protein (GFP) üzerinde itimat-sensör GFP-Calmodulin-M13 peptid (GCaMP), her ne kadar daha yeni çalışmalar daha iyi sinyal-gürültü oranı ve kırmızı kaymıştır uyarma profiller için izin vermek için bu sensörler adapte olması dayalı. GCaMP3 gelişimini, bu özellikleriyle proteinler çeşitli, GCaMP6s ve GCaMP6f gibi sensörler dahil olmak üzere (yavaş ve floresan kapalı-fiyatlar, sırasıyla hızlı), RFP-Calmodulin-M13 peptid (lebomm) yanı sıra, sahip olduğu kırmızı kaymıştır harekete geçirmek profil. Bu Turk C. elegans hücre özel gen organizatörü dizileri ile kombinasyonu ilgi, özellikle duyusal sinir hücreleri^12,13,14,15 hücreleri hedef alabilirsiniz ^{, 16}.

Mikrosıvısal çalışmalarda C. elegans kullanım kolaylığı belirgin olsa da, hemen hemen tüm çalışmalar hünsa üzerinde odaklanmıştır. Erkekler sadece 0,01-0,02 için muhasebe rağmen vahşi türü nüfusunun %, çok değerli bulgular--dan onların karakterizasyonu çıkabilir. Hermafrodit sinir sisteminin fiziksel connectome tam on yıl¹⁷için eşlenen süre erkek connectome özellikle hayvan¹⁸kafa bölgesinde eksik, kalır. Kalsiyum görüntüleme erkeklerde kullanımı erkek sinir sistemi ve iki cinsiyetler arasında ortaya çıkan farklılıklar bir anlayış oluşturmak için yardımcı olacaktır. C. elegans Yetişkin erkekler daha küçük boyutu daha büyük hermoafroditler için tasarlanan geleneksel koku aygıt yükleme noktalarından etkili ve güvenilir yakalama engeller. Bu sorunu çözmek için Chronis koku çip¹⁹ değiştirilmiş bir versiyonu daha dar bir yükleme limanı ile alt kanal yüksekliği, geliştirilmiş ve ikili sol/sağ görselleştirme için izin (hangi hayvan döndürmek) solucan yükleme limanı, döner nöronal çiftleri. Bu tasarım izin verir: genç yetişkin erkekler (1 etkili bindirme, ikili eşleştirilmiş sinir hücreleri iki üye ve (3) erkek nöronlar sinirsel aktivite hassas görüntüleme görselleştirme için hayvan daha güvenilir (2) bir yönünü.

C. elegans erkek farklı hünsa daha için a değişiklik-in ascarosides (ascr) veya Yuvarlak solucanlar Feromonlar^{20,21,22,23 yanıt çalışmalar giderek, göstermek ,24}. Bu nedenle, sinirsel dynamics ve temsilcilikleri erkek connectome içinde bir anlayış geliştirmek bile daha uygun oldu. Erkek C. elegans içeren 87 seks özgü nöronlar hermafrodit^25,26' da yok içinde connectome olarak değiştirme-henüz belirlenmemiş yolları. Bu benzersiz sinirsel dinamikler resim edememek bizi daha iyi seks özel yanıt ve sinirsel ifadeleri anlamak izin verir.

Bu iletişim kuralı bir erkek adapte koku çip erkek C. elegans sinirsel görüntüleme için açıklar chemosensation. ASH, güvenilir bir şekilde 1 M gliserol için erkeklerde, önceki ile tutarlı hermaphroditic yanıt nosiseptif nöron²⁷çalışmalar. Ascarosides maruz gerektiren test edilecek hayvanlar daha çok sayıda hayvan hayvan, değişken olan yanıt-e doğru çıkarmak. Erkek özel CEM nöronların yanıt daha önce Elektrofizyoloji ve çalışmalar, Imaging kalsiyum degisken ascaroside #3²³için yanıt vermek için gösterilmiştir.

Protokol

1. cihaz imalat

Not: bkz: başvuru ¹.

Not: silikon ana kalıpları fabrikasyon SU-8 fotorezist silikon ana ^{1 , 7} desenlendirme için standart photolithographic teknikleri kullanarak. Photomasks gofret desenlendirme için 25.000 dpi çözünürlükte basıldı. ¹⁹ bağlantı noktası yükleme, M. Zimmer (özel yazışmaları, 2016) elde edilen bir tasarım adapte solucan bir değişiklik ile tasarım erkek adapte aygıt özellikleri Chronis koku çip. Bir dönüş hayvanlar dönüşü kontrol için bulunur. Bağlantı noktası Kanal yükleme solucan genişliğini için 50 mikron daralmış. Tüm kanallar 32 mikron uzun boylu vardır. Silikon ana kalıp kullanıcı için kullanıma hazır olduğunda, kullanıcı sonraki takip edebilirsiniz, protokol ¹ daha önce açıklandığı gibi.

1. Mix PDMS temel ve kür Ajan ağırlık tarafından 10:1 oranında.
2. Karıştırın iyice transfer Pipetler ile.
3. Tüm görünür kabarcıklar kaldırılana kadar 1s için bir vakum desiccator karışımı degas.
5 mm kalınlığında (100 gr) kadar
4. bir silikon kalıp yöneticisinde bir 150 mm çapında çanak üzerine karışımı dökün. Herhangi bir kabarcıklar veya karışıma ortaya konan toz kaldırmak için bir Pasteur pipet kullanın.
5. İçin en az 3 h ya da bir gecede 65 ° C'de pişirin.
6. PDMS neşter kullanarak kalıp uzak kesmek ve ayrı aygıtlar ayrı bir jilet kullanarak kesti.
7. 1 mm dermal yumruk ile giriş ve çıkış delikleri yumruk.
8. Sifonu dH ile delik ₂ O, etanol ve parçacıklar yumruk kaldırmak için tekrar dH ₂ O ile. Bir hava akışı darbe cihazda kuru.
9. Temiz kanal taraf ve yapışkan bant, toz ve başarılı bağ için izin vermek için cihaz üzerinde kalan enkaz kaldırma cihazın üst kısmında.
10. Plazma-bond cihazın bir No 1 kapak cam kanal tarafı aşağı,.
    1. Maruz kapak cam ve aygıt (kanal-tarafına kadar) 100 W 30 gibi uygun bağ için izin koşulları kullanarak hava plazma s veya 24 W 60 s.
       Not: Ayarları bağ etkinliğini artırmak için ayarlanabilir. Plazma-bağ koşullar bağ etkinliğini artırmak çalışırken uygun temizlik olarak kritik değildir. Yeterince temizlenmiş bir aygıt, hatta ideal plazma koşullar altında bağ değil.
    2. İle 5 için başparmak aşağı cam kanal yan aygıt ve basın üzerine ters çevir s.

2. Arabellek hazırlık

1. Dilute 1 x S Bazal (100 mM NaCl ve 0,05 M KPO ₄, pH 6.0) steril 10 x stoktan.
2. Tüm çözümleri arabellek için 1 M tetramisole hisse senedi 1 S Bazal x 1 mM son bir konsantrasyon için oranında seyreltin.
3. Fluoresein için her iki ekleyin " akış denetimi " ve " tampon " rezervuarlar.
   1. Fluoresein 100-mg/mL stokunun 1 x S Bazal oluşturun.
   2. Hisse senedi için akış denetimi 1 µg/mL ve 0.1 µg/mL arabellek son konsantrasyonları sulandırmak.
4. Uyaranlara oluşturmak.
   1. Son konsantrasyonu 1 m 1 X S Bazal seyreltik gliserol.
   2. Seyreltik ascaroside #3 (ascr 3) 1 µM son bir konsantrasyon 1 X S Bazal içine için.

3. Aygıt Kurulumu

Not: bkz: ¹.

şekil 1. Mikrosıvısal aygıt ayarları. (A) rezervuar ve boru. 30 mL şırınga olmadan bir dalgıç olarak hizmet veren " rezervuar. " bu üç akış seçenekleri ile bir radarı Vana bağlı olduğu. Diğer mikrosıvısal cihaza baðlanýr tüp takılı olduğundan bir iğne (turuncu) için bağlı olduğu sırada bir çıkış pompası, 3 mL şırınga bağlıdır. (B) genel deneme Imaging mikrosıvısal kuruluşu. Cihazın objektif lensler üzerinde bir ters epifluorescence mikroskop bir sahnede yer alıyor. " Akış denetimi " arabellek seyahatleri ile belgili tanımlık tertibat üstünde rafta bir birimi tarafından kontrol edilir bir 3-yollu vana. Arabellek içeren satırların sonra uygun aygıt bağlantı noktaları eklenir. (C) mikrosıvısal aygıtının bağlantı noktalarını. " Akış denetimi " bağlantı noktaları diğer giriş bağlantı noktalarını yan: " uyarıcı " ve " tampon " bağlantı noktaları. " Çıkış " en sağdaki port limanıdır. Solucan yükleme arena, konumu nedeniyle " yükleme solucan " Merkez-çoğu bağlantı noktası aygıt üzerindeki bağlantı noktasıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3 mL şırınga ve iğne ( şekil 1A) olduğu gibi de radarı Vana bağlı ile 3-yönlü radarı Vana, 30 ya da 60 mL şırınga ekleyerek

1. hazırla üç sıvı su depoları. İğne mikrosıvısal aygıta uzanan boru bağlanmak ( şekil 1A olduğu gibi -B).
2. Hava kabarcıkları rezervuar ve boru çıkarın.
3. 1 S Bazal x ile ekli boru ile 3 mL şırıngaya doldur ve prize takın limanda
4. Arabellek giriş delikleri üst kısmında görünene kadar yavaşça uygulamak basınç-şırıngaya.
5. Akış denetimi, arabellek ve uyarıcı boru uygun giriş delik bağlantısı ( şekil 1B olduğu gibi -C), her iki yükleme noktasındaki sıvı damla mevcut sağlama delik ve bağlanmak tampon tüp.
6. Yine yavaşça damlacıkları bağlantı noktası giriş yükleme solucan görününceye kadar çıkış bağlantı noktasına bağlıysa şırınga basınç uygulamak.
7. Limanda yükleme solucan içine sağlam bir engelleme çiviyi yerleştirmeden
8. Şırınga çıkış bağlantı noktasından çıkarın ve ev vakum (-670 Torr) bağlı çıkış satırına ekleyebilir.
9. Kontrol aygıtı akışında herhangi bir kabarcık açısından kanalları, görsel ve fotoğraf makinesi ile uyumlu bir yazılım yoluyla video onay aracılığıyla, kullanılan açık kaynak yazılım Mikro-yemlik gibi. Adım 6 mikro-Yöneticisi'ni kullanma hakkında ipuçları için bkz:.
   1. Herhangi bir kabarcıklar varsa beklemek onları çıkarmak veya PDMS absorbe duvar herhangi bir hayvan önce yükleme; kabarcıklar varlığı sıvıların uygun akış aygıtı aracılığıyla rahatsız edemeyecek.
10. GFP filtreyi kullanarak onaylamak uygun akış dinamiği içinde belgili tanımlık aygıt yükleme 3-yollu vana aktüatör ve arabellek geçiş gözlemleyerek solucan önce.
    1. Belirleme uygun akış dinamikleri: akış denetimi ve tampon çözümlerinde mevcut floresein gözlemlemek ( şekil 2B -2E) denetim basarak akış denetimi değeri değiştiğinde değiştirme 3-yollu vana Vana bağlantısını ( şekil 1B) karşılık gelen düğmeyi.
    2. Mikro-Yöneticisi'ni açtıktan sonra tıklayın " Live " cihazın canlı bir görüntü gözlemlemek için. Cihazın arabellekleri akışını Floresan ışık kaynağı açın ( şekil 2B -2E).

Resim 2: Bir erkek adapte mikrosıvısal koku çip. (A) akışını desenleri solucan maruz kaldığında cihazın tampon. Arabellek (B) kahverengi gösterilir ve akış denetimi (FC) beyaz sarı, uyarıcı (S) ile gösterilir. Bağlantı noktası yükleme solucan solucan yönlendirme daha iyi kontrol için sağlar bir eğri eklemek için uyarlanmıştır. (B) akışını desenleri solucan için uyarıcı maruz kaldığında cihazın. Arabellek (B) kahverengi gösterilir ve akış denetimi (FC) beyaz sarı, uyarıcı (S) ile gösterilir. (C) ölçümleri fabrikasyon olarak adapte cihazın. Bağlantı noktası yükleme solucan, erkek genişliği için tasarlanmış bir 50 µm kanal açılarak bir 42 µm biter. Ölçülen Kanallar tasarımı 25 µm hedef rağmen 32 µm yüksekliğidir. (D-E) A tuzak erkek ifade p sra-6:: GCaMP3. Sra-6 organizatörü kül özgü değildir ve hiçbir kalsiyum geçişler ASI tespit edildi, ancak bazı ifade ASI nöron gözlenen. (E) sadece floresan ise (D) alan parlak ve floresan aydınlatma, bir arada görüntüdür. Ölçek çubukları 42 µm. (F) ASH nöron tepki 1 M gliserol stimülasyon ile sağlam sinirsel aktivite gösterir. Mavi alanı 1 M gliserol uyarıcı zamanı gösterir. Gölgeli bölge n ile standart hatasını gösterir yedi solucanlar dan 20 bakliyat =. Kırmızı izler depolarize yanıt-e doğru göstermek. Axes ΔF/F ₀ göster. 5 ölçek çubuğu gösterir s. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

4. hayvan hazırlık

Not: bkz: başvuru ²³.

1. 1 M gliserol yanıtlarını görüntüleme kül. P sra-6 için olumlu
   1. yer yaklaşık 20 C. elegans erkek:: GCaMP3 dizi ifade nematodunun büyüme orta (NGM) agar plaka üzerine numaralı seribaşı OP50 E. coli çim ile. Floresan GECI ifade ve/veya bir ortak enjeksiyon marker dizi pozitif hayvanların tanımlanması için kullanın.
      Not: Dizi olumlu hayvanlar kullanılan GECI göre belli (Yani, hayvanlar GCaMP ifade bulabilsem yeşil mavi ışık stimülasyon altında lebomm hayvanlar kırmızı yeşil ışık stimülasyon altında belli iken). Ortak enjeksiyon işaretçileri GFP ve RFP, gibi floresan diğer proteinler gibi rol-6, fenotipik işaretleri alanı kullanılabilir veya pha-1 mutasyon ²⁸ gibi baskın bir fenotip kurtarabilirsiniz.
      Eğer hemen tahlil önce çekme genç yetişkin erkekler toplama
      1. . Gün önce tahlil, L4 larva erkekler cevap.
2. 1 µM ascr 3 CEM yanıtlarını görüntüleme.
   1. Çekme yaklaşık 20 L4 C. elegans erkekler (fkEx98 [p pkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; PHA-1 (e2123ts); onu-5 (e1490); Lite-1 (ce314)) dsRed ortak enjeksiyon marker ifade için olumlu.
      Not: dsRed ray nöronlar içinde erkek masalı gözlemlemek ve GCaMP ifade dört CEM nöronlar içinde daha onaylamak daha kolay ifadesidir.
   2. İzole hünsa görüntüleme deneme yapmadan önce bir çim OP50 E. coli için 5-14 h seribaşı NGM agar tabakta gelen bu erkek.
      Not: en az 5 h için izole değil erkek davranışsal ascr 3 yanıt vermeyen ve bu nedenle ascaroside için burada görülmektedir daha bile az kalsiyum geçişler sergileyebilirler.

5. Hayvan yükleme

Not: bkz: refefence ¹.

1. Standart solucan bakım teknikleri kullanarak bir seribaşı NGM agar plaka üzerine bir solucan seçin.
   1. Çekme solucanlar bakteri çekme üzerine toplama (düzleştirilmiş Platin tel yapılmış) bir çekme, alev ve " dabbing " almak için bir solucan. Yavaşça solucan kapalı, kendi tarama izin yeni plaka üzerine yerleştirin.
2. Plaka sular altında olacak yaklaşık 5 mL 1 x S Bazal seribaşı plakasına eklemek.
3. 1 x S Bazal ile önceden doldurulmuş oldu bir yükleme şırınga (Yani, 3 mL şırınga ile ekli boru) içine belgili tanımlık kurt çizin.
   1. Solucan değil sonuna kadar içine şırınga, sadece tüp içine emmek için emin olun.
      Not: solucan şırınga geçerse, yakın olduğunu onu geri içine tüp imkansız.
4. Çıkış radarı kapak kapatarak akışını durdurmak için vakum kapatmak.
5. Sağlam iğneyi limanda yükleme solucan engelleme kaldırma
6. Açmak böylece bu havalandırma ( şekil 1B) çıkış bağlantı noktasına bağlı radarı Vana.
   Not: bir canlı video solucan yüklenirken konumunu ve yönünü hayvan (Adım 5.8-5.13) onaylamak için kullanın.
7. Limanda yükleme solucan tüpüne yükleme solucan Ekle
8. Solucan yükleme kanalda görünene kadar yavaşça uygulamak basınç-şırıngaya.
9. Solucan kuyruk-ilk kanal başlanır, solucan kanal girmesini önlemek için şırınga pistonu üzerinde çekin.
10. Uygulama ve baş kanal ilk girene kadar basınç ters arasındaki geçiş.
11. 3'lü radarı kapak kapatarak vakum atmosfer yerine vakum açmak için çıkış noktasına bağlı açık.
12. El ile yönlendirmek ve arabellek akışı kanal, ama henüz maruz öyle ki solucan kafa yerleştirmek için şırınga dalgıç tarafından iç karartıcı baş serbestçe taşıyabilirsiniz basınç uygulayın ( Şekil 2 D-2E).

6. Uyarıcı ve satın alma

1. bir açık kaynak mikroskobu yazılımını kullanarak, mikro-Yöneticisi gibi tarafından esir alma imge: 10 kare/s Mavi ışıklı uyarma kullanarak TIFF yığını olarak kaydetmek (470 nm) 30 s.
2. 1. Açık 100 Bayan için ana menüsünde pozu ayarlamak " çok D alma. " yazılım ana menüden. Ayarla " numarası " için " 300, " ve " Aralık " için " 0. "'ı tıklatın " edinme! " video kazanmaları.
3. Uygula 10 s nabzı satın alma başlatılıyor sonra uyarıcı 5 s. İstediğiniz gibi uyarıcı uygulama süresi ayarlamak.
   1. 5 edinme sonra s video, değiştirme uyarıcı test edilen hayvan uygulamak için akış denetimi arabellek kontrol 3-yollu vana. Vana bağlantı ( şekil 1B) en sol düğmesini.
   2. Sonra 10 s uyarana maruz kalma (Bu sefer ayarlanabilir kullanıcı tarafından istediğiniz gibi), yine Vana linke en soldaki düğmeye basarak akışı arabellekleri alter.
4. Kayıt sadece 30-s pencere temele dönmek GECI Floresans izin vermek için tamamlanana kadar tampon altında.
5. İstediğiniz şekilde yineleyin. Bekle 30 s edinme sonu ve sonraki deneme inisiyasyon arasında.

7. Görüntü analizi

1. dosya ImageJ penceresine sürükleyerek açık kaynak yazılım ile ImageJ, TIFF yığın açın.
2. İmleç kullanarak tıklatın ve faiz (ROI) faiz nöron çevresinde bölge ayarlamak için sürükleyin. Faiz (olduğu gibi şekil 3A) nöron soma içerecek şekilde bölgesi ayarlayın.
3. Aç'ı tıklatarak yığınları arasında yatırım Getirisi floresan yoğunluğu z yığını arsa-> görüntü - > yığınları - > z ekseni profil çiz.
4. Tıklama " listesi " açılır penceresinde. Düzenle-'yi > değerleri kopyalamak için Kopyala. Değerleri Yapıştır bir elektronik tablo programına.
5. GCaMP ifade içermeyen solucan bir bölgeye yatırım Getirisi sürükleyerek her darbe için arka plan Floresans analiz.
6. Arka plan Floresans nöron floresan yoğunluğu değerinden çıkararak her darbe için arka plan çıkarma gerçekleştirmek.
7. ΔF/F ₀ her darbe her çerçeve için hesaplamak.
   1. Olarak yatırım Getirisi için ilk 1 ortalama yoğunluk değerini hesaplamak F ₀ s satın alma (Örneğin, çerçeve 1-10).
   2. ΔF/F ₀ faiz çerçeve arka plan düşülen değeri hesaplanan F ₀ değerine göre bölerek hesaplamak.
8. Görüntüsü her nöron ve her uyarıcı darbe için yineleyin.
9. Nöronlar ile tutarlı yanıt profilleri, ASH gibi tüm darbeleri her neuron için ortalama ve SEM (olduğu gibi şekil 2F) hesaplamak için.
10. Her neuron için zaman içinde SEM ile ortalama ΔF/F ₀ arsa.
    Not: Bu durumda, bu heatmaps her deneme de bireysel nöronal tepkilerin dahil etmek yaygın uygulamadır. Kalsiyum geçişler tekrarlanan elektrodlar arasında uyarıcılara maruz üzerine tutarlı değişiklikler sergi değil nöronlar, veya farklı kişiler ²³, bireysel darbe izlemeler (olarak göstermek için daha uygun olabilir şekil 4). Ayrıntılar için tartışma verilerin nasıl görüntüleneceğini belirleme bkz.

Sonuçlar

Genel aygıt kurulum örneği şekil 1A-Bgörülebilir. Şekil 1A uygun rezervuar inşaat ve kurulum gösteriyor. Şekil 1B mikrosıvısal aygıt depolar bağlantılarını gösterir. Şekil 1 c ile netlik için etiketli bağlantı noktalarını ayrı ayrı bir mikrosıvısal aygıtı gösteriyor.

Tartışmalar

Erkek adapte koku çip bir dönüş yönünün daha fazla denetim ve erkek C. elegansverimli yakalama sağlar daha dar bir yükleme limanı içine içermektedir. Bu z-istifleme için gerek kalmadan nöronal ikili çift sol ve sağ üyeleri görselleştirme sağlar. Bu eğri bir solucan zamanında yönünü dikey %100 uzak nerede sadece bir ikili çift kül (şekil 2B-E)^29,30gibi floresan bir marker ile hedef...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Wafer	University Wafer	452
SU-8 2035	MicroChem	Y111070-0500L1GL
Developer	MicroChem	Y020100-4000L1PE
Wafer Mask	Cad/Art Services	-	Custom order. Printed at 25,000 dpi.
Sylgard-184	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
1.0 mm Dermal Punches	Acuderm Inc.	P150
Soft Tubing	Cole-Palmer	EW-06419-01
Hard Tubing	IDEX Health & Science	1622
Pins	New England Small Tube	NE-1027-12
Blocking Pins	New England Small Tube	0.415/0.425" OD x .500 Long	Batch PB07027
3 mL syringes	BD	309657
30 mL syringes	Vitality Medical	302832	Used as buffer reservoirs.
Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer	Component Supply Company	NE-231PL-50
Stopcocks with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile	Cole-Palmer	EW-30600-07
Fisherfinest Premium Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5M
Mercator Control System LF-5 Plasma System	Mercator	LF-5
Scotch Tape	Scotch	BSN43575
Series 20 Chamber	Warner Instruments	P-2
Vacuum Desicator	Bel-Art Scienceware	420250000	24 cm inner diameter.
Weigh Boats	Cole-Palmer	EW-01017-27
Classic Plus Balance	Mettler Toledo	PB1501-S/FACT
Glass Pasteur Pipettes	Cole-Palmer	EW-25554-06
Transfer pipettes	Genesee Scientific	30-202
Oven	Sheldon Manufacturing Inc	9120993	Model Number: 1500E.
60 mm, non-vented, sharp edge Petri dishes	TriTech Research	T3308
Zeiss Axio Observer.A1	Zeiss	-
Hammamatsu Orca Flash 4.0 Digital CMOS	Hammamatsu	C11440-22CU
Blue Fluorescent Light	Lumencor	SOLA SM6-LCR-SA	24-30V/7.9A DC.
Illumination Adaptor	Zeiss	423302-0000
Series 1 and 2 Miniature Inert PTFE Isolation Valve	Parker	001-0017-900	3-way valve for controlling flow.
ValveLink8.2®	AutoMate Scientific	01-18	Flow Switch Controller
Micro Manager	Micro-Manager	-	Free software, can be downloaded at: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release
ImageJ	ImageJ	-	Free software, can be downloaded at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Agar, Bacteriological Grade	Apex	9012-36-6
Peptone	Apex	20-260
CaCl2	VWR	BDH0224-1KG
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391-1kg
Cholesterol	Alfa Aesar	A11470
Ethanol	Sigma-Aldrich	270741-4L
Tetramisole	Sigma-Aldrich	L9756-10(G)	Store at 4 °C.
Fluorescein	Sigma-Aldrich	FD2000S-250mg	Light Sensitive. Store in photoprotective vials.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279-1L
Ascaroside #3	-	-	Synthesized in the Schroeder Lab (Cornell University).
NaCl	Genesee Scientific	18-215
KH2PO4	BDH	BDH9268.25
K2HPO4	J.T. Baker	3252-025
ASH GCaMP3 line	-	-	CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Developed in Bargmann lab. Provided from Albrecht Lab library.
CEM GCaMP6 line	-	-	JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::dsRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Developed by Robyn Lints. Provided from Srinivasan Lab library.
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center	OP50
"Reservoir"	-	-	To create a Reservoir: A "30 mL syringe", is connected to a "Stopcock with Luer connections; 3-way; male lock; 5 flow pattern; non-sterile", which is connected to a "3 mL syringe" and a "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer". The "Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" is then inserted into "Soft Tubing" approximately 1/3 of the way down the needle.