Siyanobakterlerde Glikojen İçeriğinin Belirlenmesi

Özet

Burada, siyanobakteriyel hücrelerdeki glikojen içeriğini ölçmek için güvenilir ve kolay bir test sunuyoruz. İşlem, çökeltme, seçilebilir depolimerizasyon ve glikoz artıklarının belirlenmesini gerektirir. Bu yöntem hem vahşi hem de genetik mühendisliği yapılmış suşlar için uygundur ve siyanobakterilerin metabolik mühendisliğini kolaylaştırabilir.

Özet

Siyanobakteriler, fotosentez sırasında ana hücre içi karbon ve enerji depolaması olarak glikojen biriktirir. Araştırmalardaki son gelişmeler, biyosentezin ve katabolizma döngüsü, redoks düzenlemesi ve kodlamayan RNA'nın dahil edilmesi gibi kompleks mekanizmaları vurgulamıştır. Aynı zamanda, ürün verimi artırmak için, karbonu glikojenden genetik olarak tasarlanmış siyanobakterilerdeki istenen ürünlere yönlendirmek için çaba sarf edilmektedir. Değişken doğruluk ve teknik karmaşıklıkla, siyanobakterilerdeki glikojen içeriğini belirlemek için çeşitli yöntemler kullanılır. Burada, standart yaşam bilimi laboratuarında yapılabilen siyanobakterlerdeki glikojen içeriğini güvenilir şekilde belirlemek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, hücre lisatından glikojenin seçici olarak çökeltilmesini ve bir glikoz öküzü tarafından saptanan glikoz monomerlerinin üretilmesi için glikojenin enzimatik depololimerizasyonunu gerektirirIdase-peroksidaz (GOD-POD) enzim bağlı testi. Yöntem, Synechocystis sp. PCC 6803 ve Synechococcus sp. PCC 7002, metabolik mühendislikte yaygın olarak kullanılan iki model siyanobakteriyel tür. Üstelik, yöntem, düzenleyici elemanlarda veya glikojen biyosentetik genlerde bozuk olan vahşi tip ve mutantlar arasındaki glikojen içeriğinde başarılı bir şekilde farklılık sergiledi.

Giriş

Siyanobakteriler, fotosentez yoluyla ışığa sabitlenmiş CO _2'den gelen karbonun başlıca karbonhidrat deposu olarak glikojen biriktirir. Glikojen, α-1,6-bağlantılı glukosil bağlantıları ile yaratılan dalları olan doğrusal α-1,4-bağlı glukandan oluşan bir glıkan. Siyanobakterlerdeki glikojen biyosentezi, fosfoglukomütaz ve ADP-glikoz pirofosforilazın ardışık eylemi yoluyla glikoz-6-fosfatın ADP-glükoza dönüştürülmesiyle başlar. ADP-glikozdaki glukoz kısmı, bir veya daha fazla glikojen sentezleyicisi (GlgA) ile glikojen α-1,4-glukan omurgasının indirgeyici olmayan ucuna aktarılır. Daha sonra, dallanmış bir enzim, glikojen parçacığını üretmek için daha da genişletilen α-1,6-bağlantılı glukosil bağlantısını getirir. Karanlıkta, glikojen, glikojen fosforilaz, glikojen debranjivasyon enzimleri, α-glukanotransferaz ve malto-dekstrin fosforilazın fosforile glikoza ve serbest glikoza indirgenmesi ile parçalanır. Bu besleme intOksidatif pentoz fosfat yolu, Embden-Meyerhof-Parnas yolu (glikoliz) ve Entner-Doudoroff yolu ^{1 , 2 , 3 , 4} de dahil olmak üzere katabolik yolaklar.

Siyanobakterlerdeki glikojen metabolizması, son yıllarda cyanobacteria'nın, kimyasallar ve yakıtlar üretmek için güneş ışığı altında çalışan mikrobiyal hücre fabrikalarına dönüşmesi potansiyelinden dolayı artan bir ilgi topladı. Glikojen metabolizması, ürünlerin verimini artıracak şekilde modifiye edilebilir, çünkü glikojen bu bakterilerdeki en büyük esnek karbon havuzudur. Bunun bir örneği siyanobakteriyum Synechococcus sp. Mannitol üretmek için genetik olarak tasarlanmış PCC 7002; glikojen sentezinin genetik bozulma manitol verimi, 3-kat ⁵ artar. Bir başka örnek, biyoetanolün glikojen yüklü vahşi türevlerindenYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . Vahşi hücre glikojen içeriği azot açlığı sırasında hücrenin kuru ağırlığının% 60'ına kadar olabilir ⁶ .

Glikojen metabolizması ve düzenlenmesi konusundaki anlayışımız son yıllarda da genişlemiştir. Glikojenin ışığa birikmesi ve karanlıkta katabolize olması bilinmesine rağmen, diel döngüsü boyunca glikojen metabolizmasının ayrıntılı kinetiği, Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Dahası, glikojen birikimini etkileyen birkaç gen tespit edilmiştir. Dikkate değer bir örnek, varsayılan histidin kinaz PmgA'nın ve kodlamayan RNA PmgRl'in bir düzenleyici kaskad oluşturması ve glikojenin birikimini kontrol ettiği bulgudur. İlginç olarak, pmgA ve pmgR1 silme mutantları, Synechocystis sp. ' Un vahşi türü suşu kadar iki kat daha fazla glikojen birikir. PCC 68038 ^{, 9} . Diğer düzenleyici elementlerin alternatif sigma faktörü E ve transkripsiyon faktörü CyAbrB2 ^{10 , 11} de dahil olmak üzere glikojenin birikimini etkilediği bilinmektedir.

Glikojen düzenlenmesi ve metabolizması ilgi arttıkça, glikojen içeriğinin tayinini açıklayan ayrıntılı bir protokol gereklidir. Literatürde çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Asit hidrolizi, ardından yüksek basınçlı anyon değişimli sıvı kromatografisi ile monosakkarit içeriğinin saptanması, ardından atımlı amperometrik bir detektör veya asit ve fenille yapılan muameleler sonrası spektrometrik tayin ^{, 9 , 10 , 12 , 13} glikojen içeriğini yaklaştırmak için yaygın olarak kullanılan yöntemlerdir. Bununla birlikte, yüksek basınçlı bir anyon değişimi sıvı kromatografisiC enstrümanı çok pahalıdır ve bazı siyanobakteriyel türlerde biriken bilinen sukroz ¹⁴ , glikosilgliserol ¹⁵ ve selüloz ^{16 , 17 , 18} gibi diğer glikoz içeren glikon konjugatlardan türetilen glikojeden türetilmiş glikozu ayırt etmez. Asit-fenol yöntemi, standart laboratuar ekipmanı kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, oldukça toksik reaktifler kullanır ve farklı gliko-konjügatlardan türeyen glikozu ayırt etmediği gibi glikoziti, glikolipidleri, lipopolisakaridleri ve hücre dışı matrisleri ¹² gibi hücresel malzemeleri oluşturan diğer monosakaritlerden ayırt etmez. Özellikle, sıcak asit-fenol testi, glikoz içeriğinin spesifik belirlenmesi için değil, toplam karbonhidrat içeriğinin saptanması için sıklıkla kullanılır ¹² . Enzimatik hyA-amiloglukozidaz ile glikozun glikoza droizlenmesi ve ardından bir enzim-eşlemeli analiz yoluyla glikozun saptanması, glıkojenden türetilmiş glukoza karşı oldukça hassas ve spesifik bir kolorimetrik okuma üretir. Özgüllük, hücre lizatlarından glikojenin etanol ^{5 , 8 , 19} tarafından tercihli olarak çökeltilmesi ile daha da geliştirilebilir.

Burada, en yaygın olarak incelenen iki siyanobakteriyal türün, Synechocystis sp. ' Deki glikojen içeriğinin enzim bazlı tahlili için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. PCC 6803 ve Synechococcus sp. PCC 7002, yabani tip ve mutant suşlarda. Etkin hidrolizi sağlamak için, α-amilaz ve α-amiloglükosidaz'dan oluşan bir kokteyl kullanılır ⁸ . Endo-etkili α-amilaz, çeşitli glukanlardaki α-1,4-bağlarını dekstrinlere hidrolize eder; bunlar, daha da hidrolize edilirler.O glukozun ekzo-etki eden α-amiloglükosidaz ^{20 ile} sentezlenmesi. Bu enzimlerin sinerjistik etkileri çok iyi bilinmektedir ve bu enzimler, bitki biyokütle ^21'inde selüloz gibi diğer glikoconjugantları etkilemeden glikojen gibi α'ya bağlı glukan olan nişastanın seçici hidrolizinde rutin olarak kullanılır. Serbest bırakılan glikoz, oksijenin hidrojen peroksite indirgenmesini katalize eden glikoz oksidaz ve glükozun bir laktona yükseltgenmesini katalizleyen bir enzim eşlenimli tahlilden sonra niceliksel olarak tespit edilir - ve peroksidaz hidrojen peroksitten pembe renkli bir kinonimin boyası üretir, Bir fenolik bileşik ve 4-aminoantipirin ^{22'yi içerir} .

Protokol

1. Hazırlık

1. Siyanobakteri kültürleri
   1. Synechocystis sp. PCC 6803,% 1 (v / v) CO ₂ ile takviye edilmiş sabit bir hava kaynağı ile 30 ° C'de sıvı BG11 ortamı ^{8'de karıştırılır} . Kültürleri 50 umol foton / m ² / s'lik bir fotosentetik foton akı yoğunluğunda sürekli olarak ışıkla aydınlatın.
   2. Synechococcus sp. % 1 (v / v) CO ₂ ile takviye edilmiş sabit bir hava kaynağı ile, sıvı A + ortam ^23'te (BG11 ortam da kullanılabilir) PCC 7002'yi. Sıcaklık 37 ° C olmalıdır. Kültürleri 150 μmol foton / m ² / s'lik bir fotosentetik foton akı yoğunluğunda ışıkla sürekli olarak aydınlatın.
   3. 1 cm'lik bir ışık yoluna sahip bir küvet kullanarak 730 nm'de kültürün optik yoğunluğunu (OD) ölçün. OD değeri 0.8'in üstünde ise, uygun olan OD ölçümlerini elde etmek için uygun dilüsyonları yapın.Hücre konsantrasyonu.
      NOT: Aşağıda sunulan protokoller, hücre yoğunluğu 2 veya daha yüksek bir OD _730nm değerine karşılık gelen sıvı kültürler için uygundur. Üslü büyüme fazındaki kültürler, tipik olarak _1'in altında bir OD _{730 nm} değerine sahip olan istendiğinde, santrifüjleme ve 2 ya da daha yüksek bir OD _{730 nm} değerini elde etmek için bir tampon ya da ortam içinde yeniden süspansiyon ile hücre yoğunluğunu konsantre hale _getirin .
2. Tamponlar ve reaktifler
   1. PH 8'de 50 mM Tris-HCl tamponu yapın.
   2. PH 5'de 50 mM sodyum asetat tamponu yapın.
   3. 50 mM sodyum asetat tamponu, pH 5 içinde 8 U / mL amiloglükosidaz stok solüsyonu yapın.
   4. 50 mM sodyum asetat tamponu, pH 5 içinde 2 U / mL α-amilaz stok solüsyonu yapın.
   5. Damıtılmış su kullanarak, 0 ila 100 ug / mL arasında değişen konsantrasyonlarda makyaj standart solüsyonları.
   6. GOD-POD reaktifini D-Glükoz Tahlil Setinden (GODPOD Formatı) hazırlayın, fÜreticinin talimatını kaldırmak.

2. Hücre Kuru Ağırlığının Belirlenmesi (Opsiyonel)

1. 2 mL'lik bir kültür veya bir hücre yeniden süspansiyonu (adım 1.1'e bakın) 2.0 mL'lik bir tüpe aktarın ve 6,000 xg'de ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
2. Pelet 1 mL suda tekrar süspanse edin ve 6,000 xg'de ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücre topağını 0.5 mL suda tekrar süspanse edin.
3. Süspansiyonu önceden tartılmış alüminyum tepsiye aktarın. Tepsiyi 105 ° C'de kurutma fırınına gece boyunca kurutma (yaklaşık 18 saat) için aktarın.
   ÖNEMLİ: Malzemenin parmaklardan taşınmasını önlemek için tepsinin forsepsle işlenmesi önemlidir. Kurutma sırasında tepsilerden gelen herhangi bir kilo kaybını belirlemek için aynı koşullar altında önceden tartılmış alüminyum tepsi kurutun.
4. Kurumadan sonra tepsiyi fırından çıkarın ve ortam koşullarında dengeye gelmesine izin verin.0,0001 g hassasiyetle tartılmadan önce 5 dakika süreyle bekletilir.
   NOT: Bu değer, hücre kuru ağırlığa dayalı olarak glikojen içeriğini normalleştirmek için kullanılabilir.

3. Siyanobakteriyel Hücrelerin Lizizasyonu

1. 1 mL'lik bir kültür veya bir hücre yeniden süspansiyonu (adım 1.1'e bakın) 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 6,000 xg'de ve 4 ° C'de 10 dakika süreyle santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
2. Pelet 1 mL 50 mM Tris-HC1, pH 8 içinde süspansiyon haline getirin ve 10 dakika 6000 xg ve 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücre peletini 1 mL Tris-HC1 tamponunda tekrar süspansiyon haline getirin. İşlemi tekrarlayın.
3. Pelleti 500 mcL 50 mM Tris-HC1 tamponu (pH 8) içinde iyice süspanse edin.
   ÖNEMLİ: Etkin bir hücre lizisi için peleti iyice süspanse edin. Yeniden süspansiyonu buzda tutun.
4. Yeniden süspanse edilen hücreleri 4 ° C'de, 30 siklüs ultrasonikasyon gerçekleştirerek, her siklüs, maksimum amplitüd ile, 20 kHz'lik bir frekansta 30 s'lik,90 s olmadan takip etti.
   NOT: Bu yöntem, Synechococcus sp. PCC 7002.
   1. Alternatif olarak, hücre resüspansiyonunu vidalı bir boruya aktarın ve üreticinin talimatlarını izleyerek boruya zirkonyum oksit boncukları ekleyin. Tüpü bir doku homojenleştiricisine yerleştirin ve hücreleri 4 ° C'de 5 frekans ayarında 5 dakikalık bir devirden oluşan 2 devirle yenerek çalkalayın.
      NOT: Bu yöntem, Synechocystis sp. PCC 6803 ve Synechococcus sp. PCC 7002.
5. Lisatı içeren tüpü 6,000 xg ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
   NOT: Pelet esas olarak büyük hücre artıkları içermelidir. Kesintisiz sayıda hücre varsa, adım 3.4'ü tekrarlayın. Süpernatanı buz üzerinde tutun.
6. Ticari bir BCA Protein test kiti kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
   NOT: Değer, glikojen içeriğini normalleştirmek için kullanılabilirBir protein içeriği temelinde.

4. Glikojen Çökeltme

1. 1.5 mL vidalı kapta adım 3.5'ten 900 μL% 96'lık (v / v) etanol ve 100 μL süpernatan karıştırılarak hücre lizatından klorofil a alınır. Kapağı kapattıktan sonra, tüpü standart bir laboratuar ısıtma bloğu kullanarak 10 dakika boyunca 90 ° C'de ısıtın.
2. Tüp 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
3. Boruyu 20,000 xg'de ve 4 ° C'de 30 dakika santrifüj edin ve süpernatanı dikkatle çıkarın; Pelet glikojen içerir. Aşırı etanolü temizlemek için pelleti havada hafifçe kurutun.
   ÖNEMLİ: Pelletin fazla kurutulması gerekir, aksi takdirde adım 5.1'te çözündürmek güçleşir.
4. İSTEĞE BAĞLI: klorofil a içeriğini belirlemek için 664 nm 'de aşama 4.3' de elde edilen yüzer absorbansı ölçülür. 84,6 L / g / cm ²⁴ emme katsayısı kullanın.
   NOT: Bu değer normalize etmek için kullanılabilirE glikojen içeriği.

5. Enzimatik Hidroliz ve Glikojen Tayini

1. Adım 4.3'te elde edilen pelleti, 100 uL 50 mM sodyum asetat, pH 5 içinde çözünür hale getirin ve 50 uL 8 U / mL amiloglükosidaz ve 50 uL 2 U / mL α-amilaz ekleyin. Bir girdap kullanarak bu malzemeleri iyice karıştırın.
   NOT: Pipetleme ile karıştırma tavsiye edilmez, çünkü glikojen pelleti viskozdur.
2. Karışımı 60 ° C'de bir ısıtma bloğu üzerinde 2 saat boyunca inkübe ederek glikojenin glikoz moleküllerine sindirilmesini sağlayın.
3. Numuneyi 10,000 xg'de 5 dakika santrifüj edin ve süpernatanı yeni bir 1.5 mL tüp içine aktarın.

6. GOD-POD Reaktifini Kullanarak Toplam Glikoz İçeriğinin Saptanması

1. GOD-POD reaktif maddesini kullanarak adım 5.3'te elde edilen süpernatanın glikoz konsantrasyonunu ölçün. Adım 5.3'ten 100 μL süpernatanı 96 oyuklu bir plakada bir oyuğa aktarın. Negatif bir kontrol olarak,100 μL 50 mM sodyum asetat, pH 5 kullanın. Bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için, glikoz standart solüsyonlarını da ölçün.
2. Her bir numuneye 150 μL GOD-POD reaktif ekleyin ve pipetle hızlı bir şekilde karıştırın.
3. Plakayı statik olarak 25 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Bir plaka okuyucu kullanarak absorbans değerini 510 nm'de kaydedin.
4. Glikoz standartlarından elde edilen bir kalibrasyon eğrisi kullanarak glukoz konsantrasyonunu hesaplayın.
   NOT: Hücre lizatındaki glikojen konsantrasyonu glikoz konsantrasyonu (μg / mL) olarak ifade edilir.

Sonuçlar

10 mL vahşi tipli Synechocystis sp. PCC ₆₈₀₃ , OD _730nm değeri yaklaşık 0.8'e ulaşana kadar foto- _ototrofik koşullar altında yetiştirildi. Hücreler hasat edilmiş ve 50 mM Tris-HC1, pH 8 içinde yeniden süspanse edilmiştir. OD _{730 nm} değeri 2-3'e ayarlanmıştır. Glikojen içeriği, yukarıda tarif edilen protokolü izleyerek analiz edildi. OD _730nm başına glikojen içeriği 13 ± 1.8 μg / mL / OD

Tartışmalar

Protokolün kritik adımları glikojen çökmesi ve yeniden süspansiyon. Etanol çökeltisini takiben santrifüjden sonra, glikojen, gevşek şekilde mikrosantrifüj tüplerinin duvarlarına yapışan yarı saydam bir pelet oluşturur. Bu nedenle, yüzer maddenin çıkarılması sırasında, pelletin çıkarılmaması için özel dikkat gösterilmelidir. Glikojen pelleti yapışkandır ve kuruyorsa çözündürme zor olabilir. Glikojen pelletinin tamamen çözündürülmesinin önem taşıdığına dikkat edin, çünk?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
QSonica Sonicators Q700	Qsonica, LLC	NA	QSonica
SpectraMax 190 Microplate Reader	Molecular Devices	NA	Eliza plate reader
Bullet Blender Storm	Next Advance	BBY24M-CE	Beads beater
Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer	Amersham Biosciences	NA	Spectrophotometer
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Buffer
HCl	Merck	1-00317	pH adjutment
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	32319	Buffer
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)	Megazyme	E-AMGPU	Enzyme for glycogen depolymerization
α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)	Sigma-Aldrich	A3176	Enzyme for glycogen depolymerization
D-Glucose	Merch	8337	Standard for the glucose assay
Pierce BCA Protein assay kit	Thermo Fisher scientific	23225	For determination of protein concentrations
Aluminum drying trays, disposable	VWR	611-1362	For determination of cell dry weights
D-Glucose assay kit (GODPOD format)	Megazyme	K-GLUC	For determination of glucose concentrations
Zirconium oxide breads, 0.15 mm	Next Advance	ZrOB015	Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm
RINO tubes	Next Advance	NA	Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm