Determinación del contenido de glucógeno en las cianobacterias

Resumen

Aquí, presentamos un ensayo fiable y fácil para medir el contenido de glucógeno en células de cianobacterias. El procedimiento implica precipitación, despolimerización seleccionable y la detección de residuos de glucosa. Este método es adecuado para cepas de tipo salvaje y genéticamente modificadas y puede facilitar la ingeniería metabólica de las cianobacterias.

Resumen

Las cianobacterias acumulan glucógeno como almacenamiento intracelular de carbono y energía durante la fotosíntesis. Los recientes avances en la investigación han puesto de relieve los complejos mecanismos del metabolismo del glucógeno, incluyendo el ciclo diel de biosíntesis y catabolismo, la regulación redox, y la participación de ARN no codificante. Al mismo tiempo, se están haciendo esfuerzos para redirigir el carbono del glicógeno a productos deseables en cianobacterias modificadas genéticamente para mejorar los rendimientos del producto. Se utilizan varios métodos para determinar los contenidos de glucógeno en las cianobacterias, con precisión variable y complejidades técnicas. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la determinación fiable del contenido de glucógeno en cianobacterias que se puede realizar en un laboratorio estándar de ciencias de la vida. El protocolo implica la precipitación selectiva de glicógeno a partir del lisado celular y la despolimerización enzimática de glucógeno para generar monómeros de glucosa, que son detectados por un buey de glucosaIdase-peroxidasa (GOD-POD). El método se ha aplicado a Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus sp. PCC 7002, dos especies de cianobacterias modelo que se utilizan ampliamente en la ingeniería metabólica. Además, el método mostró con éxito diferencias en los contenidos de glucógeno entre el tipo salvaje y mutantes defectuosos en elementos reguladores o genes biosintéticos de glicógeno.

Introducción

Las cianobacterias se acumulan glucógeno como el principal almacén de carbohidratos de carbono de CO ₂ fijado a la luz a través de la fotosíntesis. El glucógeno es un glicano que consiste en glucano enlazado con α-1,4 lineal con ramificaciones creadas por enlaces glucosilo unidos por α-1,6. La biosíntesis de glicógeno en cianobacterias comienza con la conversión de glucosa-6-fosfato en ADP-glucosa a través de la acción secuencial de fosfoglucomutasa y ADP-glucosa pirofosforilasa. El resto de glucosa en ADP-glucosa se transfiere al extremo no reductor del esqueleto de α-1,4-glucano de glucógeno por una o más glucógeno sintasas (GlgA). Posteriormente, las enzimas ramificadoras introducen el enlace glucosilo unido a 1,6, que se extiende adicionalmente para generar la partícula de glicógeno. En la oscuridad, el glucógeno se descompone por glucógeno fosforilasa, enzimas desramificantes de glucógeno, α-glucanotransferasa y malto-dextrina fosforilasa en glucosa fosforilada y glucosa libre. Estos int de alimentaciónO las vías catabólicas, incluida la vía oxidativa de pentosa fosfato, la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (glicólisis) y la vía de Entner-Doudoroff ^{1 , 2 , 3 , 4} .

El metabolismo del glicógeno en las cianobacterias ha despertado un interés creciente en los últimos años debido a la posibilidad de que las cianobacterias se conviertan en fábricas de células microbianas impulsadas por la luz solar para producir productos químicos y combustibles. El metabolismo del glicógeno podría modificarse para aumentar el rendimiento de los productos, porque el glicógeno es el grupo de carbono flexible más grande de estas bacterias. Un ejemplo es la cianobacteria Synechococcus sp. PCC 7002, que ha sido genéticamente modificado para producir manitol; La interrupción genética de la síntesis de glucógeno aumenta el rendimiento de manitol 3 veces ⁵ . Otro ejemplo es la producción de bioetanol a partir de wildt cargado con glucógenoYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . El contenido de glucógeno de células de tipo salvaje puede ser hasta 60% del peso seco de la célula durante la inanición de nitrógeno ⁶ .

Nuestra comprensión del metabolismo del glucógeno y la regulación también se ha expandido en los últimos años. Aunque se sabe que el glucógeno se acumula a la luz y se cataboliza en la oscuridad, la cinética detallada del metabolismo del glucógeno durante el ciclo de diel fue revelada recientemente en Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Además, se han identificado varios genes que afectan a la acumulación de glucógeno. Un ejemplo notable es el descubrimiento de que la supuesta histidina quinasa PmgA y el ARN no codificante PmgR1 forman una cascada reguladora y controlan la acumulación de glucógeno. De manera interesante, los mutantes de deleción pmgA y pmgR1 acumulan el doble de glucógeno que la cepa de tipo salvaje de Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . Se sabe también que otros elementos reguladores afectan la acumulación de glucógeno, incluyendo el factor sigma E alternativo y el factor transcripcional CyAbrB2 ^{10 , 11} .

Como el interés en la regulación del glucógeno y el metabolismo crecen, un protocolo detallado que describe la determinación del contenido de glucógeno está garantizado. En la literatura se utilizan varios métodos. La hidrólisis ácida seguida por la determinación del contenido de monosacárido mediante cromatografía líquida de intercambio aniónico de alta presión acoplada con un detector amperométrico pulsado o determinación espectrométrica después de tratamientos con ácido y fenol son métodos ampliamente utilizados para aproximar el contenido de glucógeno ^{9 , 10 , 12 , 13} . Sin embargo, un cromatógrafo líquido de intercambio aniónico de alta presiónC es muy cara y no discrimina la glucosa derivada del glucógeno de la derivada de otros glicoconjugados que contienen glucosa, tales como la sacarosa ¹⁴ , el glucosilglicerol ¹⁵ y la celulosa ^{16 , 17 , 18} , que se sabe que se acumulan en algunas especies de cianobacterias. El método ácido-fenol se puede realizar utilizando equipo de laboratorio estándar. Sin embargo, utiliza reactivos altamente tóxicos y no distingue glucosa derivada de diferentes glicoconjugados, ni distingue glucosa de otros monosacáridos que constituyen materiales celulares, como glicolípidos, lipopolisacáridos y matrices extracelulares ¹² . En particular, el ensayo ácido-fenol caliente se utiliza a menudo para la determinación del contenido total de hidratos de carbono más que para la determinación específica del contenido de glucosa ¹² . Enzymatic hyLa hidrólisis de glicógeno a glucosa por α-amiloglucosidasa seguida por la detección de glucosa a través de un ensayo acoplado a enzima genera una lectura colorimétrica que es altamente sensible y específica a glucosa derivada de glucógeno. La especificidad puede mejorarse adicionalmente con la precipitación preferencial de glucógeno a partir de lisados ​​celulares por etanol ^{5 , 8 , 19} .

Aquí, describimos un protocolo detallado para un ensayo basado en enzimas del contenido de glucógeno en dos de las especies de cianobacterias más estudiadas, Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus sp. PCC 7002, en el tipo salvaje y cepas mutantes. Con el fin de garantizar la hidrólisis eficiente, un cóctel de α-amilasa y α-amiloglucosidasa se utiliza [ ^8] . La alpha - amilasa que actúa endo hidroliza los enlaces alpha - 1,4 en diversos glucanos en dextrinas, que se hidrolizan adicionalmente tO de glucosa mediante la α-amiloglucosidasa exoactiva ²⁰ . Los efectos sinérgicos de estas enzimas son bien conocidos, y estas enzimas se utilizan rutinariamente para la hidrólisis selectiva del almidón, que es un glucano α-ligado como el glucógeno, sin afectar a otros glicoconjugantes, como la celulosa, en la biomasa vegetal ²¹ . La glucosa liberada se detecta cuantitativamente después de un ensayo acoplado a enzima que consiste en glucosa oxidasa, que cataliza la reducción de oxígeno en peróxido de hidrógeno y la oxidación de glucosa en lactona y peroxidasa, lo que produce un colorante quinoneimina rosado a partir de peróxido de hidrógeno, Un compuesto fenólico y 4-aminoantipirina ²² .

Protocolo

1. Preparación

1. Cultivos de cianobacterias
   1. Cultivar Synechocystis sp. PCC 6803 a 30 ° C en medio BG11 líquido ⁸ , con un suministro constante de aire suplementado con CO _{2 al} 1% (v / v). Iluminar los cultivos continuamente con luz a una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 50 μmol fotón / m ² / s.
   2. Cultivar Synechococcus sp. PCC 7002 en medio A + líquido ²³ (se puede utilizar también medio BG11), con un suministro constante de aire suplementado con CO _{2 al} 1% (v / v). La temperatura debe ser de 37 ° C. Iluminar los cultivos continuamente con luz a una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 150 μmol fotón / m ² / s.
   3. Medir la densidad óptica (DO) del cultivo a 730 nm usando una cubeta con un trayecto de luz de 1 cm. Si el valor de OD es superior a 0,8, haga las diluciones apropiadas para obtener mediciones de DO que sean proporcionales aE concentración de células.
      NOTA: Los protocolos presentados a continuación son adecuados para cultivos líquidos, con una densidad celular que corresponde a un valor de DO _730nm de 2 o superior. Cuando se desean cultivos en fase de crecimiento exponencial, que normalmente tienen un valor de _{730 nm} OD por debajo de 1, se concentra la densidad celular mediante centrifugación y resuspensión en un tampón o medio para alcanzar un valor de _{730 nm} OD de 2 o superior.
2. Tampones y reactivos
   1. Hacer un tampón Tris-HCl 50 mM a pH 8.
   2. Hacer tampón de acetato de sodio 50 mM a pH 5.
   3. Hacer una solución madre de 8 U / mL de amiloglucosidasa en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5.
   4. Hacer una solución madre de 2 U / mL de α-amilasa en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5.
   5. Utilizando agua destilada, soluciones patrón de manglucosa en concentraciones que oscilan entre 0 y 100 μg / mL.
   6. Prepare el reactivo GOD-POD del kit de ensayo de D-glucosa (formato GODPOD), fSiguiendo las instrucciones del fabricante.

2. Determinación del peso seco de la célula (opcional)

1. Transferir 2 ml de un cultivo o una resuspensión celular (ver paso 1.1) a un tubo de 2,0 ml y centrifugar a 6000 xg ya 4 ° C durante 5 min. Deseche el sobrenadante.
2. Resuspender el gránulo en 1 mL de agua y centrifugar a 6.000 xg y 4 ° C durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 0,5 ml de agua.
3. Transfiera la suspensión a una bandeja de aluminio previamente pesada. Transferir la bandeja a un horno de secado a 105 ° C para el secado durante la noche (aproximadamente 18 h).
   CRÍTICO: Es importante que la bandeja se manipule con fórceps para evitar la transferencia de material de los dedos. Se seca una bandeja de aluminio pre-pesada vacía bajo las mismas condiciones para determinar cualquier pérdida de peso de las bandejas durante el secado.
4. Después del secado, retirar la bandeja del horno y permitir que se equilibre a temperatura ambienteOns durante 5 min antes de pesarlo con una precisión de 0.0001 g.
   NOTA: El valor puede usarse para normalizar el contenido de glucógeno en una base de peso seco de celda.

3. Lisis de Células Cianobacterianas

1. Transferir 1 ml de un cultivo o una resuspensión celular (ver paso 1.1) a un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 6000 xg ya 4 ° C durante 10 min. Deseche el sobrenadante.
2. Resuspender el gránulo en 1 mL de Tris-HCl 50 mM, pH 8, y centrifugar a 6.000 xg y 4 ° C durante 10 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 1 mL del tampón Tris-HCl. Repita el proceso.
3. Resuspender completamente el sedimento en 500 μl de tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8.
   CRÍTICO: Resuspender bien el sedimento para una lisis celular eficiente. Mantenga la resuspensión en hielo.
4. Lyse las células resuspendidas a 4 ° C mediante la realización de 30 ciclos de ultrasonicación, cada ciclo que consiste en 30 s a una frecuencia de 20 kHz con la amplitud máxima,Seguido por 90 s sin.
   NOTA: Este método puede lisar eficientemente Synechococcus sp. PCC 7002.
   1. Alternativamente, transfiera la resuspensión de la célula a un tubo de tapa roscada y añada perlas de óxido de circonio al tubo, siguiendo las instrucciones del fabricante. Colocar el tubo en un homogeneizador de tejidos y lisar las células a 4 ° C mediante la realización de 2 ciclos de batido, cada ciclo que consiste en 5 min en el ajuste de frecuencia de 5.
      NOTA: Este método puede lisar eficientemente Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus sp. PCC 7002.
5. Centrifugar el tubo que contiene el lisado durante 10 min a 6.000 xg y 4 ° C.
   NOTA: El pellet debe consistir principalmente en desechos de celda grande. Si hay un número significativo de células intactas, repita el paso 3.4. Mantenga el sobrenadante sobre hielo.
6. Determine la concentración de proteína usando un kit comercial de ensayo de proteína BCA.
   NOTA: El valor puede usarse para normalizar el contenido de glucógenoSobre una base de contenido proteico.

4. Precipitación de glicógeno

1. Eliminar la clorofila a del lisado celular mezclando 900 μl de etanol al 96% (v / v) y 100 μl del sobrenadante de la etapa 3.5 en un tubo de tapa roscada de 1,5 ml. Después de cerrar la tapa, calentar el tubo a 90 ° C durante 10 min utilizando un bloque de calefacción de laboratorio estándar.
2. Incubar el tubo en hielo durante 30 min.
3. Centrifugar el tubo a 20.000 xg y 4 ° C durante 30 min y retirar cuidadosamente el sobrenadante; El gránulo contiene glicógeno. Secar ligeramente el gránulo en el aire para eliminar el exceso de etanol.
   CRÍTICO: Se debe evitar el secado excesivo del gránulo, de lo contrario resulta difícil solubilizar en el paso 5.1.
4. OPCIONAL: Mida la absorbancia del sobrenadante obtenido en el paso 4.3 a 664 nm para determinar el contenido de clorofila a . Utilizar un coeficiente de absorción de 84,6 L / g / cm ²⁴ .
   NOTA: El valor se puede utilizar para normalizarE el contenido de glucógeno.

5. Hidrólisis enzimática y determinación de glicógeno

1. Solubilizar el sedimento obtenido en el paso 4.3 en 100 μl de acetato sódico 50 mM, pH 5, y añadir 50 μl de 8 U / ml de amiloglucosidasa y 50 μl de α-amilasa 2 U / mL. Mezclar bien estos materiales utilizando un vórtice.
   NOTA: No se recomienda la mezcla por pipeteado porque el gránulo de glucógeno es viscoso.
2. Incubar la mezcla a 60 ° C en un bloque de calentamiento durante 2 h para permitir la digestión de glucógeno en moléculas de glucosa.
3. Centrifugar la muestra a 10.000 xg durante 5 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml.

6. Determinación del contenido total de glucosa utilizando el reactivo GOD-POD

1. Mida la concentración de glucosa en el sobrenadante obtenido en el paso 5.3 usando el reactivo GOD-POD. Transferir 100 μl del sobrenadante del paso 5.3 a un pocillo en una placa de 96 pocillos. Como control negativo,Use 100 μl de acetato de sodio 50 mM, pH 5. Para generar una curva de calibración, también mida las soluciones patrón de glucosa.
2. Añadir 150 μl de reactivo GOD-POD a cada muestra y mezclar rápidamente por pipeteo.
3. Incubar la placa estáticamente a 25 ° C durante 30 min. Registre el valor de absorbancia a 510 nm usando un lector de placas.
4. Calcular la concentración de glucosa usando una curva de calibración obtenida de los estándares de glucosa.
   NOTA: La concentración de glucógeno en el lisado celular se expresa como la concentración de glucosa (μg / ml).

Resultados

Se añadieron 10 ml de Synechocystis sp. Se cultivaron PCC 6803 en condiciones fotoautótrofas hasta que el valor de DO _730nm alcanzó aproximadamente 0,8. Las células se recogieron y se resuspendieron en Tris-HCl 50 mM, pH 8. El valor de DO _730nm se ajustó a 2-3. El contenido de glucógeno se analizó siguiendo el protocolo descrito anteriormente. El contenido de glucógeno por la OD _730nm fue de 13 ± 1,8 μg / mL / OD _730nm ( ...

Discusión

Los pasos críticos dentro del protocolo son la precipitación del glucógeno y la resuspensión. Después de la centrifugación después de la precipitación con etanol, el glucógeno forma una pastilla translúcida que se adhiere flojamente a las paredes de los tubos de microcentrífuga. Por lo tanto, cuando se retira el sobrenadante, se debe prestar especial atención para no quitar el gránulo. El gránulo de glucógeno es pegajoso, y la solubilización puede ser difícil si se seca. Obsérvese que la solubilizació...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
QSonica Sonicators Q700	Qsonica, LLC	NA	QSonica
SpectraMax 190 Microplate Reader	Molecular Devices	NA	Eliza plate reader
Bullet Blender Storm	Next Advance	BBY24M-CE	Beads beater
Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer	Amersham Biosciences	NA	Spectrophotometer
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Buffer
HCl	Merck	1-00317	pH adjutment
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	32319	Buffer
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)	Megazyme	E-AMGPU	Enzyme for glycogen depolymerization
α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)	Sigma-Aldrich	A3176	Enzyme for glycogen depolymerization
D-Glucose	Merch	8337	Standard for the glucose assay
Pierce BCA Protein assay kit	Thermo Fisher scientific	23225	For determination of protein concentrations
Aluminum drying trays, disposable	VWR	611-1362	For determination of cell dry weights
D-Glucose assay kit (GODPOD format)	Megazyme	K-GLUC	For determination of glucose concentrations
Zirconium oxide breads, 0.15 mm	Next Advance	ZrOB015	Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm
RINO tubes	Next Advance	NA	Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm