Détermination du contenu en glycogène dans les cyanobactéries

Résumé

Ici, nous présentons un dosage fiable et facile pour mesurer la teneur en glycogène dans les cellules cyanobactériennes. La procédure implique des précipitations, une dépolymérisation sélectionnable et la détection de résidus de glucose. Cette méthode est appropriée pour les souches de type sauvage et génétiquement modifiées et peut faciliter l'ingénierie métabolique des cyanobactéries.

Résumé

Les cyanobactéries accumulent du glycogène comme stockage majeur de carbone et d'énergie intracellulaire pendant la photosynthèse. Les développements récents dans la recherche ont mis en évidence des mécanismes complexes du métabolisme du glycogène, y compris le cycle diels de la biosynthèse et du catabolisme, la régulation redox et l'implication de l'ARN non codant. Dans le même temps, des efforts sont faits pour rediriger le carbone du glycogène vers des produits désirables dans des cyanobactéries génétiquement modifiées pour améliorer les rendements des produits. Plusieurs méthodes sont utilisées pour déterminer le taux de glycogène dans les cyanobactéries, avec des précisions variables et des complexités techniques. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour la détermination fiable de la teneur en glycogène dans les cyanobactéries qui peuvent être effectuées dans un laboratoire de sciences de la vie standard. Le protocole implique la précipitation sélective du glycogène à partir du lysat cellulaire et la dépolymérisation enzymatique du glycogène pour générer des monomères de glucose, qui sont détectés par un bœuf de glucoseIdase-peroxydase (GOD-POD) couplé à l'enzyme. La méthode a été appliquée à Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002, deux types d'espèces de cyanobactéries largement utilisées dans l'ingénierie métabolique. En outre, la méthode a montré avec succès des différences dans les teneurs en glycogène entre le type sauvage et les mutants défectueux dans les éléments régulateurs ou les gènes de biosynthèse du glycogène.

Introduction

Les cyanobactéries accumulent du glycogène comme principal stock de glucides provenant du CO ₂ fixé à la lumière par la photosynthèse. Le glycogène est un glycan consistant en un glucane linéaire α-1,4-lié avec des branches créées par des liaisons glucosyle liées à l'α-1,6. La biosynthèse du glycogène dans les cyanobactéries commence par la conversion du glucose-6-phosphate en ADP-glucose par l'action séquentielle de la phosphoglucomutase et de la pyrophosphorylase ADP-glucose. La fraction de glucose dans ADP-glucose est transférée à l'extrémité non réductrice du squelette α-1,4-glucane du glycogène par une ou plusieurs glycogènes synthases (GlgA). Par la suite, des enzymes de ramification introduisent la liaison glucosyle liée à l'α-1,6, qui est encore étendue pour générer la particule de glycogène. Dans le noir, le glycogène est décomposé par la glycogène phosphorylase, les enzymes débranchantes du glycogène, l'α-glucanotransférase et la malto-dextrine phosphorylase dans le glucose phosphorylé et le glucose libre. Ces flux intLes voies cataboliques, y compris la voie de phosphate de pentose oxydante, la voie d'Embden-Meyerhof-Parnas (glycolyse) et la voie de Entner-Doudoroff ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Le métabolisme du glycogène dans les cyanobactéries a suscité un intérêt croissant au cours des dernières années en raison de la possibilité que les cyanobactéries se développent dans des usines de cellules microbiennes entraînées par la lumière du soleil pour produire des produits chimiques et des combustibles. Le métabolisme du glycogène pourrait être modifié pour augmenter le rendement des produits, car le glycogène est le plus grand pool de carbone flexible de ces bactéries. Un exemple est la cyanobactérie Synechococcus sp. PCC 7002, qui a été génétiquement conçu pour produire du mannitol; La rupture génétique de la synthèse du glycogène augmente le rendement en mannit 3 fois ⁵ . Un autre exemple est la production de bioéthanol à partir de cellules sauvages chargées de glycogèneYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . La teneur en glycogène des cellules de type sauvage peut représenter jusqu'à 60% du poids sec de la cellule pendant la famine par l'azote ⁶ .

Notre compréhension du métabolisme et de la régulation du glycogène a également été élargie ces dernières années. Alors que le glycogène est connu pour s'accumuler dans la lumière et être catabolisé dans l'obscurité, la cinétique détaillée du métabolisme du glycogène pendant le cycle diel n'a été révélée que récemment dans Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . En outre, plusieurs gènes affectant l'accumulation de glycogène ont été identifiés. Un exemple notable est la découverte que la putative histidine kinase PmgA et l'ARN non codant PmgR1 forment une cascade régulatrice et contrôlent l'accumulation de glycogène. Fait intéressant, les mutants de suppression de pmgA et pmgR1 accumulent deux fois plus de glycogène que la souche de type sauvage de Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . D'autres éléments réglementaires sont également connus pour affecter l'accumulation de glycogène, y compris le facteur de sigma alternatif E et le facteur de transcription CyAbrB2 ^{10 , 11} .

À mesure que l'intérêt pour la régulation du glycogène et le métabolisme augmente, un protocole détaillé décrivant la détermination de la teneur en glycogène est justifié. Plusieurs méthodes sont utilisées dans la littérature. L'hydrolyse acide suivie de la détermination de la teneur en monosaccharides par une chromatographie liquide à échange d'anions haute pression associée à un détecteur ampérométrique pulsé ou à une détermination spectrométrique après des traitements avec de l'acide et du phénol sont des méthodes largement utilisées pour rapprocher la teneur en glycogène ^{9 , 10 , 12 , 13} . Cependant, une chromatographie liquide à échange d'anions haute pressionL'instrument c est très coûteux et ne distingue pas le glucose dérivé du glycogène de celui dérivé d'autres glycoconjugués contenant du glucose, tels que le saccharose ¹⁴ , le glucosylglycérol ¹⁵ et la cellulose ^{16 , 17 , 18} , qui sont connus pour s'accumuler dans certaines espèces de cyanobactéries. La méthode acide-phénol peut être effectuée en utilisant des équipements de laboratoire standard. Cependant, il utilise des réactifs hautement toxiques et ne distingue pas le glucose dérivé de différents glycoconjugués, ni distingue le glucose des autres monosaccharides qui constituent des matériaux cellulaires tels que les glycolipides, les lipopolysaccharides et les matrices extracellulaires ¹² . Notamment, le dosage acide acide-phénol est souvent utilisé pour la détermination de la teneur totale en glucides plutôt que pour la détermination spécifique de la teneur en glucose ¹² . Enzymatic hyL'hydrolyse du glycogène en glucose par l'α-amyloglucosidase suivie de la détection du glucose par un dosage couplé à une enzyme génère une lecture colorimétrique hautement sensible et spécifique au glucose dérivé du glycogène. La spécificité peut être renforcée avec la précipitation préférentielle du glycogène à partir des lysats cellulaires par l'éthanol ^{5 , 8 , 19} .

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour un dosage enzymatique du contenu en glycogène dans deux des espèces de cyanobactéries les plus étudiées, Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002, dans les souches de type sauvage et mutant. Afin d'assurer une hydrolyse efficace, un cocktail d'α-amylase et d'α-amyloglucosidase est utilisé ⁸ . L'α-amylase à effet endo hydrolyse les liaisons α-1,4 dans divers glucanes dans les dextrines, qui sont encore hydrolysées tO glucose par ex-action de l'α-amyloglucosidase ²⁰ . Les effets synergiques de ces enzymes sont bien connus, et ces enzymes sont habituellement utilisées pour l'hydrolyse sélective de l'amidon, qui est un glucane glycogène tel que glycogène, sans affecter d'autres glycoconjugants, comme la cellulose, dans la biomasse végétale ²¹ . Le glucose libéré est détecté quantitativement suite à un essai couplé par une enzyme consistant en glucose oxydase - qui catalyse la réduction de l'oxygène au peroxyde d'hydrogène et l'oxydation du glucose à une lactone et à la peroxydase - qui produit un colorant de quinoneimine de couleur rose provenant du peroxyde d'hydrogène, Un composé phénolique et la 4-aminoantipyrine ²² .

Protocole

1. Préparation

1. Les cultures de cyanobactéries
   1. Grow Synechocystis sp. PCC 6803 à 30 ° C dans un milieu liquide BG11 ⁸ , avec un apport constant d'air additionné de CO ₂ à 1% (v / v). Illuminer les cultures en continu avec de la lumière à une densité de flux photonique photosynthétique de 50 μmol de photon / m ² / s.
   2. Grow Synechococcus sp. PCC 7002 en liquide A + moyen ²³ (milieu BG11 peut également être utilisé), avec un apport constant d'air additionné de CO ₂ à 1% (v / v). La température devrait être de 37 ° C. Illuminer les cultures en continu avec de la lumière à une densité de flux photonique photosynthétique de 150 μmol de photon / m ² / s.
   3. Mesurer la densité optique (OD) de la culture à 730 nm à l'aide d'une cuvette avec un chemin d'éclairage de 1 cm. Si la valeur de l'OD est supérieure à 0,8, faites des dilutions appropriées pour obtenir des mesures de DO qui sont proportionnelles à laConcentration de cellule e.
      NOTE: Les protocoles présentés ci-dessous conviennent aux cultures liquides, avec une densité cellulaire correspondant à une valeur OD _730nm de 2 ou supérieure. Lorsque des cultures dans la phase de croissance exponentielle sont souhaitées, qui ont typiquement une valeur de DO _730nm inférieure à 1, concentrent la densité cellulaire par centrifugation et remise en suspension dans un tampon ou un milieu pour obtenir une valeur de DO _730nm de 2 ou plus.
2. Buffers et réactifs
   1. Faire un tampon Tris-HCl 50 mM à pH 8.
   2. Faire un tampon 50 mM d'acétate de sodium à pH 5.
   3. Faire une solution mère de 8 U / ml d'amyloglucosidase dans du tampon 50 mM d'acétate de sodium, pH 5.
   4. Faire une solution mère de 2 U / ml d'a-amylase dans du tampon 50 mM d'acétate de sodium, pH 5.
   5. En utilisant de l'eau distillée, des solutions standards de formolucose à des concentrations comprises entre 0 et 100 μg / mL.
   6. Préparer le réactif GOD-POD du kit D-Glucose Assay (Format GODPOD), fEn suivant les instructions du fabricant.

2. Détermination du poids sec à la cellule (en option)

1. Transférer 2 mL d'une culture ou une resuspension cellulaire (voir étape 1.1) dans un tube de 2,0 mL et centrifuger à 6000 xg et 4 ° C pendant 5 min. Jeter le surnageant.
2. Remettre en suspension la pastille dans 1 mL d'eau et centrifuger à 6000 xg et 4 ° C pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 0,5 ml d'eau.
3. Transférer la suspension dans un plateau en aluminium pré-pesé. Transférez le plateau à un four à sécher à 105 ° C pour un séchage pendant une nuit (environ 18 h).
   CRITIQUE: Il est important que le bac soit manipulé avec une pince pour éviter le transfert du matériau des doigts. Séchez un bac en aluminium pré-pesé vide dans les mêmes conditions pour déterminer toute perte de poids des plateaux pendant le séchage.
4. Après séchage, retirez le plateau du four et laissez-le équilibrer à la température ambiantePendant 5 min avant de le peser avec une précision de 0,0001 g.
   REMARQUE: la valeur peut être utilisée pour normaliser la teneur en glycogène sur une base cellulaire-sèche.

3. Lysis of Cyanobacterial Cells

1. Transférer 1 mL d'une culture ou une remise en suspension cellulaire (voir étape 1.1) dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 6 000 xg et 4 ° C pendant 10 min. Jeter le surnageant.
2. Remettre en suspension la pastille dans 1 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8 et centrifuger à 6 000 xg et 4 ° C pendant 10 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml du tampon Tris-HCl. Répétez le processus.
3. Remettre complètement le culot dans 500 μL de tampon Tris-HCl 50 mM, pH 8.
   CRITIQUE: Resuspendre bien le culot pour une lyse cellulaire efficace. Garder la resuspension dans la glace.
4. Lyse les cellules remises en suspension à 4 ° C en effectuant 30 cycles d'ultrasons, chaque cycle étant constitué de 30 s à une fréquence de 20 kHz avec l'amplitude maximale,Suivi de 90 s sans.
   REMARQUE: Cette méthode peut efficacement lyse Synechococcus sp. PCC 7002.
   1. Sinon, transférez la suspension de la cellule à un tube à vis et ajoutez des billes d'oxyde de zirconium au tube, conformément aux instructions du fabricant. Réglez le tube dans un homogénéisateur de tissu et lysez les cellules à 4 ° C en effectuant 2 cycles de battement, chaque cycle étant constitué de 5 min au réglage de fréquence de 5.
      REMARQUE: cette méthode peut efficacement lyse Synechocystis sp. PCC 6803 et Synechococcus sp. PCC 7002.
5. Centrifuger le tube contenant le lysat pendant 10 min à 6000 xg et 4 ° C.
   REMARQUE: La pastille doit être principalement constituée de débris de grandes cellules. S'il existe un nombre important de cellules ininterrompues, répétez l'étape 3.4. Gardez le surnageant sur la glace.
6. Déterminer la concentration de protéines en utilisant un kit commercial de dosage de protéines BCA.
   NOTE: La valeur peut être utilisée pour normaliser le contenu en glycogèneSur une base de protéines.

4. Précipitations de glycogène

1. Enlever la chlorophylle a du lysat cellulaire en mélangeant 900 uL d'éthanol à 96% (v / v) et 100 μL du surnageant à partir de l'étape 3.5 dans un tube à bouchon à vis de 1,5 ml. Après avoir fermé le capuchon, chauffez le tube à 90 ° C pendant 10 min en utilisant un bloc de chauffage de laboratoire standard.
2. Incuber le tube sur de la glace pendant 30 min.
3. Centrifuger le tube à 20 000 xg et 4 ° C pendant 30 min et enlever soigneusement le surnageant; La pastille contient du glycogène. Sécher légèrement la pastille à l'air pour éliminer l'excès d'éthanol.
   CRITIQUE: Le séchage excessif de la pastille doit être évité, sinon il devient difficile de se solubiliser à l'étape 5.1.
4. OPTIONNEL: Mesurer l'absorbance du surnageant obtenu à l'étape 4.3 à 664 nm pour déterminer la teneur en chlorophylle a . Utilisez un coefficient d'absorption de 84,6 L / g / cm ²⁴ .
   REMARQUE: la valeur peut être utilisée pour normaliserE la teneur en glycogène.

5. Détermination enzymatique de l'hydrolyse et du glycogène

1. Solubiliser le pastille obtenu à l'étape 4.3 dans 100 μl d'acétate de sodium 50 mM, pH 5, et ajouter 50 μL de 8 U / mL d'amyloglucosidase et 50 μL d'α-amylase 2 U / mL. Mélangez bien ces matériaux à l'aide d'un vortex.
   REMARQUE: le mélange par pipettage n'est pas recommandé car la pastille de glycogène est visqueuse.
2. Incuber le mélange à 60 ° C sur un bloc de chauffage pendant 2 h pour permettre la digestion du glycogène en molécules de glucose.
3. Centrifuger l'échantillon à 10 000 xg pendant 5 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml.

6. Détermination du contenu total en glycémie à l'aide du réactif GOD-POD

1. Mesurer la concentration de glucose dans le surnageant obtenu à l'étape 5.3 en utilisant le réactif GOD-POD. Transférer 100 μL du surnageant de l'étape 5.3 à un puits dans une plaque à 96 puits. Comme un contrôle négatif,Utiliser 100 μl d'acétate de sodium 50 mM, pH 5. Pour générer une courbe d'étalonnage, mesurer également les solutions standard de glucose.
2. Ajouter 150 μL de réactif GOD-POD à chaque échantillon et mélanger rapidement par pipettage.
3. Incuber la plaque de manière statique à 25 ° C pendant 30 min. Enregistrez la valeur d'absorbance à 510 nm à l'aide d'un lecteur de plaques.
4. Calculer la concentration de glucose en utilisant une courbe d'étalonnage obtenue à partir des normes de glucose.
   NOTE: La concentration de glycogène dans le lysat cellulaire est exprimée en concentration de glucose (μg / mL).

Résultats

10 ml de Synechocystis sp. Le PCC 6803 a été cultivé dans des conditions photoautotrophiques jusqu'à ce que la valeur de la DO _730nm atteigne environ 0,8. Les cellules ont été récoltées et remises en suspension dans du Tris-HCl 50 mM, pH 8. La valeur de la _{DO730nm a} été ajustée à 2-3. La teneur en glycogène a été analysée selon le protocole décrit ci-dessus. La teneur en glycogène par OD _730nm était de 13 ± 1,8 μg / mL / ...

Discussion

Les étapes critiques dans le protocole sont la précipitation et la resuspension du glycogène. Après centrifugation suite à la précipitation de l'éthanol, le glycogène forme une pastille translucide qui adhère légèrement aux parois des tubes de microcentrifugeuse. Par conséquent, lors de l'élimination du surnageant, une attention particulière doit être accordée afin de ne pas enlever la pastille. La pastille de glycogène est collante, et la solubilisation peut être difficile si elle sèche. Note...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
QSonica Sonicators Q700	Qsonica, LLC	NA	QSonica
SpectraMax 190 Microplate Reader	Molecular Devices	NA	Eliza plate reader
Bullet Blender Storm	Next Advance	BBY24M-CE	Beads beater
Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer	Amersham Biosciences	NA	Spectrophotometer
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Buffer
HCl	Merck	1-00317	pH adjutment
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	32319	Buffer
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)	Megazyme	E-AMGPU	Enzyme for glycogen depolymerization
α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)	Sigma-Aldrich	A3176	Enzyme for glycogen depolymerization
D-Glucose	Merch	8337	Standard for the glucose assay
Pierce BCA Protein assay kit	Thermo Fisher scientific	23225	For determination of protein concentrations
Aluminum drying trays, disposable	VWR	611-1362	For determination of cell dry weights
D-Glucose assay kit (GODPOD format)	Megazyme	K-GLUC	For determination of glucose concentrations
Zirconium oxide breads, 0.15 mm	Next Advance	ZrOB015	Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm
RINO tubes	Next Advance	NA	Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm