시아 노 박테리아의 글리코겐 함량 측정

요약

여기, 시아 노 박테리아 세포에서 글리코겐 함량을 측정하기위한 신뢰할 수 있고 쉬운 분석법을 제시합니다. 이 과정은 침전, 선택 가능한 해중합 및 포도당 잔류 물의 검출을 수반한다. 이 방법은 야생형 및 유 전적으로 변형 된 균주 모두에 적합하며 시아 노 박테리아의 대사 공학을 촉진 할 수 있습니다.

초록

시아 노 박테리아는 글리코겐을 광합성 과정에서 주요 세포 내 탄소와 에너지 저장 물질로 축적합니다. 최근의 연구 결과는 생합성 및 이화 과정의 산화 환원 조절, 산화 환원 조절 및 비 암호화 RNA의 관련을 포함한 글리코겐 대사의 복잡한 기전을 강조했다. 동시에, 생산량을 향상시키기 위해 글리코겐의 탄소를 유 전적으로 생산 된 시아 노 박테리아의 바람직한 제품으로 방향을 바꾸려는 노력이 이루어지고 있습니다. 여러 방법이 다양한 정확도와 기술적 복잡성을 지닌 시아 노 박테리아의 글리코겐 함량을 결정하는 데 사용됩니다. 여기, 표준 생명 과학 실험실에서 수행 할 수있는 시아 노 박테리아의 글리코겐 함량을 신뢰할 수있게 결정하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 프로토콜은 세포 lysate에서 글리코겐의 선택적 석출과 글루코스 단량체를 생성하는 글리코겐의 효소 해중합을 포함하며, 이는 글루코스 옥시idase-peroxidase (GOD-POD) 효소 커플 링 분석. 이 방법은 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002, 신진 대사 공학에서 널리 사용되는 두 개의 모델 시아 노 박테리아 종. 또한,이 방법은 조절 요소 또는 글리코겐 생합성 유전자가 결핍 된 야생형과 돌연변이 체 사이에서 글리코겐 함량의 차이를 성공적으로 나타냈다.

서문

남조류는 광합성 광 고정 CO _2에서 탄소의 주요 탄수화물 저장소로서 글리코겐을 축적. 글리코겐은 α-1,6- 연결 글루코 실 결합에 의해 생성 된 가지를 갖는 선형 α-1,4- 결합 글루칸으로 구성된 글리 칸이다. 시아 노 박테리아에서의 글리코겐 생합성은 포스 포 글루코 튜 타제와 ADP- 글루코스 피로 인산화 효소의 순차적 작용을 통해 글루코오스 -6- 인산을 ADP- 글루코스로 전환시키는 것으로 시작한다. ADP- 포도당의 글루코오스 잔기는 하나 이상의 글리코겐 합성 효소 (GlgA)에 의해 글리코겐의 α-1,4- 글루칸 백본의 비 환원 말단으로 전달된다. 이어서, 분지 효소가 α-1,6- 결합 된 글루코 실 결합을 도입하고, 글리코겐 입자를 생성하도록 추가 확장시킨다. 어둠 속에서 글리코겐은 글리코겐 포스 포 릴라 제, 글리코겐 탈 분기 효소, α- 글루 카노 트랜스퍼 라제 및 말토 덱스트린 포스 포 릴라 제에 의해 인산화 된 글루코오스와 유리 글루코스로 분해됩니다. 이러한 피드 int산화성 오탄당 인산 경로, Embden-Meyerhof-Parnas 경로 (glycolysis), Entner-Doudoroff 경로 ^{1 , 2 , 3 , 4를} 포함한 이화 경로.

시아 노 박테리아의 글리코겐 대사는 시아 노 박테리아가 햇빛에 의해 화학 물질과 연료를 생산하는 미생물 세포 공장으로 발전 할 가능성이 있기 때문에 최근 몇 년 동안 관심이 증가하고 있습니다. 글리코겐은이 박테리아에서 가장 큰 유연한 탄소 저장고이기 때문에 글리코겐 대사가 생성물의 수율을 높이기 위해 변형 될 수 있습니다. 예는 cyanobacterium Synechococcus sp. 만니톨을 생산하기 위해 유 전적으로 조작 된 PCC 7002; 글리코겐 합성의 유전 파괴는 만니톨 수율 3 ~ ⁵ 배 ^{증가한다.} 또 다른 예는 글리코겐이 함유 된 야생에서 바이오 에탄올을 생산하는 것입니다ype Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . 야생형 세포 글리코겐 함량은 질소 기아 동안 세포의 건조 중량의 60 %까지 될 수 있습니다 ⁶ .

최근 글리코겐 대사와 조절에 대한 우리의 이해 또한 넓어졌습니다. 글리코겐은 빛에 축적되어 어둠 속에서 대사되는 것으로 알려져 있지만, 딜주기 동안의 글리코겐 대사의 상세한 동역학은 최근 Synechocystis sp.에서 드러났다. PCC 6803 ⁷ . 또한, 글리코겐의 축적에 영향을 미치는 몇 가지 유전자가 확인되었습니다. 주목할만한 예는 추정 히스티딘 키나아제 PmgA와 비 암호화 RNA PmgR1이 조절 캐스케이드를 형성하고 글리코겐의 축적을 제어한다는 발견이다. 흥미롭게도, pmgA 및 pmgR1 결실 돌연변이 체는 Synechocystis sp.의 야생형 균주의 2 배의 글리코겐을 축적한다. PCC 68038 ^{, 9} . 기타 규제 요소는 대체 시그마 인자 E와 전사 인자 CyAbrB2 ^{(10), (11)을} 포함하여 글리코겐의 축적에 영향을 미치는 것으로 알려져있다.

글리코겐 조절 및 신진 대사에 대한 관심이 증가함에 따라 글리코겐 함량의 결정을 설명하는 상세한 프로토콜이 보증됩니다. 여러 가지 방법이 문헌에서 사용된다. 산에 의한 가수 분해와 펄스에 의한 암페어 검출기 또는 산과 페놀로 처리 한 분광 측정으로 결합 된 고압 음이온 교환 액체 크로마토 그래피를 통한 모노 사카 라이드 함량 측정은 글리코겐 함량 ^{9 , 10 , 12 , 13} 을 근사하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 그러나, 고압 음이온 교환 액체 크로마토 그래프c기구는 매우 고가이며 일부 시아 노 박테리아 종에 축적되는 것으로 알려진 수크로오스 ¹⁴ , 글루코 실 글리세롤 ¹⁵ 및 셀룰로오스 ^{16 , 17 , 18} 과 같은 다른 글루코오스 - 함유 글리코 콘쥬 게이트로부터 유도 된 것에서 글리코겐 유래의 글루코 구별하지 않는다. 산 - 페놀 방법은 표준 실험실 장비를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 그러나, 그것은 매우 독성 시약을 사용하고 다른 glycoconjugates에서 파생 된 포도당을 구별하지 않으며, 당분자, lipopolysaccharides 및 세포 외 매트릭스 ¹² 같은 세포 물질을 구성하는 다른 monosaccharides에서 포도당을 구분하지 않습니다. 특히, 고온 산 - 페놀 분석은 포도당 함량의 특정 측정보다는 총 탄수화물 함량의 측정에 종종 사용됩니다 ¹² . 효소 적알파 - 아밀로 글루코시다 아제에 의한 글리코겐의 글루코오스로의 효소 - 결합 분석을 통한 글루코스 검출은 글리코겐으로부터 유도 된 글루코스에 매우 민감하고 특이적인 비색계 판독 값을 생성한다. 에탄올 ^{5 , 8 , 19에} 의한 세포 용 해물로부터의 글리코겐의 특이 적 침전으로 특이성을 더욱 향상시킬 수있다.

여기에서 가장 널리 연구 된 시아 노 박테리아 종인 Synechocystis sp.에서 글리코겐 함량의 효소 기반 분석을위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002, 야생형 및 돌연변이 균주에서. 효율적인 가수 분해를 보장하기 위해 α- 아밀라아제와 α- 아밀로 글루코시다 아제의 칵테일을 사용합니다 ⁸ . Endo-acting α- 아밀라아제는 다양한 글루칸의 α-1,4- 결합을 덱스트린으로 가수 분해하여 더 가수 분해됩니다엑소 아밀 글루코시다 제 ²⁰ 을 엑소 - 작용하여 포도당을 생성한다. 이러한 효소의 상승 효과는 잘 알려져 있으며 식물 바이오 매스 ²¹ 의 셀룰로오스와 같은 다른 당 결합제에 영향을 미치지 않으면 서 글리코겐과 같은 α 결합 글루칸 인 전분의 선택적 가수 분해에 일상적으로 사용됩니다. 방출 된 포도당은 과산화수소에서 산소의 환원과 포도당의 락톤으로의 산화를 촉진하는 포도당 산화 효소와 과산화수소로부터 핑크색 퀴 노니 민 염료를 생성하는 과산화 효소로 구성된 효소 결합 분석법에 따라 정량적으로 검출됩니다. 페놀 화합물, 4- 아미노 안티피린 ²² .

프로토콜

1. 준비

1. 시아 노 박테리아 배양
   1. 성장 Synechocystis sp. 1 % (v / v) CO _2가 보충 된 일정한 공기 공급으로 30 ℃에서 액체 BG11 배지 ⁸ 에서 PCC 6803. 50 μmol photon / m ² / s의 광합성 광자 자속 밀도에서 빛으로 문화를 지속적으로 조명하십시오.
   2. 성장하는 Synechococcus sp. PCA 7002는 1 % (v / v) CO _2가 보충 된 일정량의 공기가 공급되는 액체 A + 배지 ²³ (BG11 배지도 사용 가능). 온도는 37 ° C이어야합니다. 150 μmol photon / m ² / s의 광합성 광자 자속 밀도에서 빛으로 문화를 지속적으로 조명하십시오.
   3. 1cm의 빛 경로와 함께 큐벳을 사용하여 730 nm에서 문화의 광학 밀도 (OD)를 측정합니다. OD 값이 0.8 이상이면 적절한 희석을하여 th에 비례하는 OD 측정 값을 얻으십시오e 세포 농도.
      참고 : 아래 제시된 프로토콜은 액체 배양에 적합하며 OD _730nm 값이 2 이상인 세포 밀도가 있습니다. 전형적으로 1보다 작은 OD _730nm 값을 갖는 지수 성장 단계의 배양 물을 원심 분리 및 완충액 또는 배지에서 재현 탁하여 OD _730nm 값이 2 _이상이 되도록 세포 밀도를 농축시킨다.
2. 완충액 및 시약
   1. pH 8에서 50 mM Tris-HCl 완충액을 만든다.
   2. pH 5에서 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액을 만든다.
   3. 50 MM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5)에 8 U / mL amyloglucosidase의 저장 용액을 만든다.
   4. 50 MM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5)에 2 U / mL의 α- 아밀라아제의 저장 용액을 만든다.
   5. 증류수를 사용하여 0 ~ 100 μg / mL 농도의 메이크 루카스 표준 용액을 만듭니다.
   6. D- 포도당 분석 키트 (GODPOD 형식)에서 GOD-POD 시약 준비, f제조업체의 지시를 따르십시오.

2. 세포 건조 중량의 결정 (선택 사항)

1. 배양액 또는 세포 재 현탁액 2 mL (1.1 단계 참조)를 2.0 mL 튜브에 옮기고 6,000 xg 및 4 ° C에서 5 분간 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다.
2. 물 1 ML에 펠렛을 Resuspend 및 5 분 6,000 XG 및 4 ° C에서 원심 분리기. 뜨는을 버리고 물 0.5 ML에 세포 펠렛을 resuspend.
3. 현가 장치를 미리 무게를 측정 한 알루미늄 트레이에 옮깁니다. 하룻밤 건조 (약 18 시간)하기 위해 트레이를 105 ℃의 건조 오븐으로 옮긴다.
   중요 : 손가락에서 재료가 전달되지 않도록 트레이를 집게로 다루는 것이 중요합니다. 동일한 조건에서 비어있는 사전 무게가있는 알루미늄 트레이를 건조시켜 건조 중에 용지함의 중량 손실을 확인합니다.
4. 건조 후 오븐에서 트레이를 꺼내어 주변 온도에서 평형을 유지하게하십시오5 분간 정치 한 후 0.0001 g의 정확도로 계량하십시오.
   참고 :이 값은 셀 건조 중량 기준으로 글리코겐 함량을 표준화하는 데 사용할 수 있습니다.

3. 시아 노 박테리아 세포의 용해

1. 배양 물 또는 세포 재 현탁액 (1 단계 참조) 1 mL를 1.5 mL 튜브에 옮기고 6,000 xg 및 4 ° C에서 10 분간 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다.
2. 50mM Tris-HCl, pH 8 1 ML에 펠렛을 Resuspend하고 10 분 동안 6,000 XG와 4 ° C에서 원심 분리기. 상층 액을 버리고 Tris-HCl 완충액 1 mL에 세포 펠렛을 재현 탁한다. 과정을 반복하십시오.
3. 철저히 50 MM 트리스 - HCl 버퍼, 산도 8 500 μL에 펠렛을 resuspend.
   중요 : 효율적인 세포 용해를 위해 펠렛을 잘 부유시킵니다. 얼음에 resuspension을 보관하십시오.
4. 4에서 resuspended 세포를 lyse ° C ultrasonication의 30주기를 수행하여, 각주기는 최대 진폭과 20 kHz의 주파수에서 30 초 구성된,없이 90 초.
   참고 :이 방법은 Synechococcus sp.를 효율적으로 용해 할 수 있습니다. PCC 7002.
   1. 또는 세포 resuspension을 나사 캡 튜브로 옮기고 제조업체의 지침에 따라 튜브에 지르코늄 산화물 비즈를 추가하십시오. 조직 homogenizer에 튜브를 설정하고 4에서 세포를 해동 ° C의 두주기를 실행하여 각주기는 5의 주파수 설정에서 5 분으로 구성된 각주기.
      참고 :이 방법은 효율적으로 Synechocystis sp. PCC 6803 및 Synechococcus sp. PCC 7002.
5. 6,000 xg 및 4 ° C에서 10 분 동안 용 해물이 담긴 튜브를 원심 분리하십시오.
   참고 : 펠렛은 주로 큰 세포 파편으로 구성되어야합니다. 상당한 수의 끊어지지 않은 셀이 있으면 3.4 단계를 반복하십시오. 얼음에 뜨는 것을 유지하십시오.
6. 상용 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오.
   참고 :이 값은 글리코겐 함량을 표준화하는 데 사용할 수 있습니다단백질 함량 기준.

4. 글리코겐 침강

1. 96 % (V / V) 에탄올과 1.5 ML 스크류 캡 튜브에서 단계 3.5에서 뜨는의 100 μL의 900 μL를 혼합하여 세포 lysate에서 엽록소 a 를 제거합니다. 뚜껑을 닫은 후 표준 실험실 가열 블록을 사용하여 90 ° C에서 10 분간 가열합니다.
2. 30 분 동안 얼음에 튜브를 품어.
3. 튜브를 20,000 xg 및 4 ° C에서 30 분간 원심 분리하고 조심스럽게 상등액을 제거합니다. 펠렛은 글리코겐을 함유하고있다. 과량의 에탄올을 제거하기 위해 펠렛을 가볍게 건조시킵니다.
   중요 : 펠릿의 과도한 건조는 피해야하며, 그렇지 않으면 단계 5.1에서 용해시키기가 어려워진다.
4. 선택적 : 엽록소에게 콘텐츠를 결정하기 위해 664 nm에서의 단계 4.3에서 얻어진 상청액의 흡광도를 측정한다. 84.6 L / g / cm ²⁴ 의 흡수 계수를 사용하십시오.
   참고 :이 값은 normalize에 사용될 수 있습니다.e 글리코겐 함량.

5. 효소 가수 분해 및 글리코겐 결정

1. 단계 4.3에서 얻은 펠렛을 50 MM 나트륨 아세테이트 (pH 5) 100 μL에서 용해시키고 8 U / mL 아밀로 글루코시다 아제 50 μL와 2 U / mL α- 아밀라아제 50 μL를 첨가한다. 소용돌이를 사용하여 이러한 물질을 잘 혼합하십시오.
   참고 : 글리코겐 펠렛이 점성을 띄기 때문에 피펫 팅을 통한 혼합은 권장하지 않습니다.
2. 글루코오스 분자로 glycogen의 소화를 가능하게하기 위해 2 시간 가열 블록에 60 ° C에서 혼합물을 품어.
3. 샘플을 10,000 xg에서 5 분간 원심 분리하고 상층 액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다.

6. GOD-POD 시약을 사용하여 총 포도당 함량 측정

1. GOD-POD 시약을 사용하여 단계 5.3에서 얻은 상청액의 포도당 농도를 측정합니다. 단계 5.3의 상층 액 100 μL를 96- 웰 플레이트의 웰에 옮긴다. 부정적인 통제로서,50 mM sodium acetate (pH 5) 100 μL를 사용하십시오. 검량선을 생성하려면 혈당 표준 용액도 측정하십시오.
2. 각 샘플에 GOD-POD 시약 150 μL를 넣고 pipetting으로 신속하게 혼합하십시오.
3. 플레이트를 25 ° C에서 30 분 동안 정치한다. 플레이트 판독기를 사용하여 510 nm에서 흡광도 값을 기록하십시오.
4. 포도당 표준에서 얻은 검량선을 사용하여 포도당의 농도를 계산하십시오.
   참고 : 세포 용 해물의 글리코겐 농도는 글루코스 농도 (μg / mL)로 표시됩니다.

결과

10 mL의 야생형 Synechocystis sp. PCC 6803은 OD _730nm 값이 약 0.8에 도달 할 때까지 광 자기 영양 조건 하에서 성장시켰다. 세포를 수확하고 50 mM Tris-HCl, pH 8에 재현 탁시켰다. OD ₇₃₀ nm 값을 2-3으로 조정 하였다. 상기 한 프로토콜에 따라 글리코겐 함량을 분석 하였다. OD _730nm 당 글리코겐 함량은 13 ± 1.8 μg / mL / OD ₇₃₀ nm ( N = 12)이었다. 글리...

토론

프로토콜 내에서 중요한 단계는 글리코겐 침전 및 재 부유입니다. 에탄올 침전 후 원심 분리 후, 글리코겐은 미세 원심 분리 튜브의 벽에 느슨하게 부착되는 반투명 펠렛을 형성한다. 따라서 상등액을 제거 할 때 pellet을 제거하지 않도록 특별한주의가 필요합니다. 글리코겐 펠렛은 끈적 거리며, 건조되면 가용화가 어려울 수 있습니다. 글리코겐 펠렛의 완전한 가용화는 중요하지 않은데, 이는 불?...

자료

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Bullet Blender Storm	Next Advance	BBY24M-CE	Beads beater
Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer	Amersham Biosciences	NA	Spectrophotometer
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Buffer
HCl	Merck	1-00317	pH adjutment
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	32319	Buffer
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)	Megazyme	E-AMGPU	Enzyme for glycogen depolymerization
α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)	Sigma-Aldrich	A3176	Enzyme for glycogen depolymerization
D-Glucose	Merch	8337	Standard for the glucose assay
Pierce BCA Protein assay kit	Thermo Fisher scientific	23225	For determination of protein concentrations
Aluminum drying trays, disposable	VWR	611-1362	For determination of cell dry weights
D-Glucose assay kit (GODPOD format)	Megazyme	K-GLUC	For determination of glucose concentrations
Zirconium oxide breads, 0.15 mm	Next Advance	ZrOB015	Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm
RINO tubes	Next Advance	NA	Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm