Determinazione del contenuto di glicogeno nei cianobatteri

Riepilogo

Qui presentiamo un test affidabile e facile per misurare il contenuto di glicogeno nelle cellule cianobatteriche. La procedura prevede precipitazione, depolimerizzazione selezionabile e rilevazione di residui di glucosio. Questo metodo è adatto sia per ceppi selvatici che geneticamente modificati e può facilitare l'ingegnerizzazione metabolica dei cianobatteri.

Abstract

I cianobatteri accumulano il glicogeno come un importante deposito intracellulare di carbonio e di energia durante la fotosintesi. I recenti sviluppi della ricerca hanno evidenziato meccanismi complessi di metabolismo del glicogeno, compreso il ciclo di biosintesi e catabolismo, la regolazione redox e il coinvolgimento di RNA non codificante. Allo stesso tempo, si stanno tentando di reindirizzare il carbonio dal glicogeno a prodotti desiderabili in cianobatteri geneticamente modificati per migliorare le rese dei prodotti. Diversi metodi sono usati per determinare il contenuto di glicogeno nei cianobatteri, con precisione variabile e complessità tecnica. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la determinazione affidabile del contenuto di glicogeno nei cianobatteri che può essere eseguito in un laboratorio di vita standard. Il protocollo prevede la precipitazione selettiva di glicogeno dal lisato cellulare e la depolimerizzazione enzimatica del glicogeno per generare monomeri di glucosio, rilevati da un gatto di glucosioIdase-perossidasi (GOD-POD). Il metodo è stato applicato a Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, due specie cianobatteriche di modello che sono ampiamente utilizzate nell'ingegneria metabolica. Inoltre, il metodo ha dimostrato con successo le differenze nel contenuto di glicogeni tra il tipo selvatico e mutanti difettosi in elementi regolatori o geni biosintetici al glicogeno.

Introduzione

I cianobatteri accumulano glicogeno come il principale deposito di carboidrati del carbonio da CO ₂ fissato alla luce attraverso la fotosintesi. Il glicogeno è un glicano costituito da glucano lineare α-1,4 collegato con rami creati da legami glucosilici legati al α-1,6. La biosintesi dei glicogeni nei cianobatteri inizia con la conversione di glucosio-6-fosfato in glucosio ADP attraverso l'azione sequenziale di fosfoglucomutasi e di pirosfosforilasi di glucosio ADP. La parte del glucosio in glucosio ADP viene trasferita all'estremità non riducente del globulo di α-1,4-glucano del glicogeno mediante una o più sintasi glicogene (GlgA). Successivamente, un enzimi ramificanti introducono il legame glucosilico legato al α-1,6, che viene ulteriormente esteso per generare la particella del glicogeno. Nel buio, il glicogeno viene suddiviso in glicogeno fosforilasi, enzimi di gengogeno debrange, α-glucanotransferasi e fosforilasi di malto-dextrina in glucosio fosforilato e glucosio libero. Questi feed intPercorsi catabolici, compreso il percorso ossidativo del fosfato pentoso, il percorso Embden-Meyerhof-Parnas (glicolisi) e il percorso Entner-Doudoroff ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Il metabolismo dei glicogeni nei cianobatteri ha riscosso un crescente interesse negli ultimi anni a causa del potenziale per i cianobatteri a svilupparsi in fabbriche di cellule microbiche azionate dalla luce solare per produrre sostanze chimiche e combustibili. Il metabolismo del glicogeno potrebbe essere modificato per aumentare la resa dei prodotti, perché il glicogeno è la più grande raccolta di carbonio flessibile in questi batteri. Un esempio è il cianobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, che è stato progettato geneticamente per produrre mannitolo; La rottura genetica della sintesi del glicogeno aumenta la resa del mannitolo 3 volte ⁵ . Un altro esempio è la produzione di bioetanolo da glicogeno-caricato wildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . Il contenuto di glicogeno delle cellule di tipo selvatico può essere fino al 60% del peso secco della cellula durante la fame di azoto ⁶ .

La nostra comprensione del metabolismo e della regolazione del glicogeno si è ulteriormente ampliata negli ultimi anni. Mentre il glicogeno è noto per accumulare alla luce e per essere catabolizzato nella buia, la cinetica dettagliata del metabolismo del glicogeno durante il ciclo di diel è stata solo recentemente rivelata in Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Inoltre, sono stati identificati diversi geni che influenzano l'accumulo di glicogeno. Un esempio notevole è la scoperta che l'istidina kinasi PmgA e l'RNA non codificante PmgR1 formano una cascata regolatrice e controllano l'accumulo di glicogeno. È interessante notare che i mutanti di delezione pmgA e pmgR1 accumulano due volte il maggior numero di glicogeni come il ceppo selvatico di Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . Altri elementi regolatori sono noti anche per influenzare l'accumulo di glicogeno, compreso il fattore sigma alternativo E e il fattore trascrizionale CyAbrB2 ^{10 , 11} .

Poiché l'interesse per la regolazione del glicogeno e il metabolismo cresce, è garantito un protocollo dettagliato che descrive la determinazione del contenuto di glicogeno. Diversi metodi sono usati nella letteratura. L'idrolisi acida seguita dalla determinazione del contenuto di monosaccharide mediante cromatografia liquida a scambio ad anione ad alta pressione accoppiata con un rilevatore amperometrico a pulsazione o una determinazione spettrometrica dopo trattamenti con acido e fenolo sono ampiamente utilizzati per approssimare il contenuto di glicogeno ^{9 , 10 , 12 , 13} . Tuttavia, un cromatografo liquido di scambio anionico ad alta pressioneC è molto costoso e non discrimina il glucosio derivato dal glicogeno da quello derivato da altri glicoconjugati contenenti glucosio, come la saccarosio ¹⁴ , il glucosilglicerolo ¹⁵ e la cellulosa ^{16 , 17 , 18} , notoriamente accumulati in alcune specie di cianobatteri. Il metodo acido-fenolo può essere eseguito utilizzando attrezzature standard di laboratorio. Tuttavia, utilizza reagenti altamente tossici e non distingue il glucosio derivato da diversi glicoconjugati, né distingue il glucosio da altri monosaccharidi che costituiscono materiali cellulari, come i glicolipidi, i liposolucaridi e le matrici extracellulari ¹² . In particolare, il saggio acido-fenolo caldo viene spesso utilizzato per la determinazione del contenuto totale di carboidrati anziché per la determinazione specifica del tenore di glucosio ¹² . Ili enzimaticiLa drolicosi del glicogeno al glucosio da parte di α-amiloglucosidasi seguita dalla rilevazione del glucosio attraverso un dosaggio accoppiato enzima genera una lettura colorimetrica altamente sensibile e specifica al glucosio derivato dal glicogeno. La specificità può essere ulteriormente migliorata con la precipitazione preferenziale di glicogeno da cellule lisati mediante etanolo ^{5 , 8 , 19} .

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per un dosaggio enzimatico del contenuto di glicogeno in due delle specie cianobatteriche più diffuse, Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, nelle specie selvatiche e mutanti. Al fine di garantire un'idrolisi efficiente, viene utilizzato un cocktail di α-amilasi e α-amiloglucosidasi ⁸ . L'α-amilasi ad azione endo idrolizza i legami α-1,4 in vari glucani in dextrine, che vengono ulteriormente idrolizzatiO glucosio mediante eso-azione α-amyloglucosidase ²⁰ . Gli effetti sinergici di questi enzimi sono ben noti e questi enzimi vengono utilizzati abitualmente per l'idrolisi selettiva dell'amido, che è un glicogeno a glucano associato a α, senza influenzare altri glicoconjuganti, come la cellulosa, nella biomassa vegetale ²¹ . Il glucosio rilasciato viene rilevato quantitativamente in seguito a un dosaggio enzimatico composto da glucosio ossidasi che catalizza la riduzione dell'ossigeno al perossido di idrogeno e l'ossidazione del glucosio a un lattone e alla perossidasi che produce un colorante quinoneimina rosa colorato di perossido di idrogeno, Un composto fenolico e 4-aminoantipirina ²² .

Protocollo

1. Preparazione

1. Culture cianobatteriche
   1. Crescere Synechocystis sp. PCC 6803 a 30 ° C in mezzo liquido BG11 ⁸ , con un'alimentazione costante di aria integrata con 1% (v / v) CO ₂ . Illuminare le culture in modo continuo con la luce ad una densità di flusso fotonico fotonico di 50 μmol fotone / m ² / s.
   2. Crescere Synechococcus sp. PCC 7002 in liquido A + medium ²³ (può anche essere utilizzato il medium BG11), con un'alimentazione costante di aria integrata con CO _{2 di} 1% (v / v). La temperatura dovrebbe essere di 37 ° C. Illuminare le colture in modo continuo con la luce ad una densità di flusso fotonico fotonico di 150 μmol fotone / m ² / s.
   3. Misurare la densità ottica (OD) della coltura a 730 nm usando una cuvetta con un percorso leggero di 1 cm. Se il valore OD è superiore a 0,8, fare le diluizioni appropriate per ottenere misure OD che sono proporzionali a thE.
      NOTA: I protocolli presentati di seguito sono idonei per colture a liquido, con una densità di cella corrispondente ad un valore OD _730nm di 2 o superiore. Quando si desiderano colture nella fase di crescita esponenziale, che in genere hanno un valore OD _730nm inferiore a 1, concentrano la densità cellulare mediante centrifugazione e resuspensione in un tampone o mezzo per ottenere un valore di OD _730nm di 2 o superiore.
2. Tamponi e reagenti
   1. Realizzare 50 mM di Tris-HCl tampone a pH 8.
   2. Realizzare un tampone di acetato di sodio 50 mM a pH 5.
   3. Preparare una soluzione di base di 8 U / mL di amiloglucosidasi in 50 mM di tampone di acetato di sodio, pH 5.
   4. Preparare una soluzione di stock di 2 U / mL α-amilasi in 50 mM di tampone di acetato di sodio, pH 5.
   5. Utilizzando acqua distillata, soluzioni standard macroclucose a concentrazioni che vanno da 0 a 100 μg / ml.
   6. Preparare il reagente GOD-POD dal kit di analisi D-glucosio (formato GODPOD), fSeguendo l'istruzione del produttore.

2. Determinazione del peso a secco della cellula (opzionale)

1. Trasferire 2 mL di una coltura o una risospensione cellulare (vedere la fase 1.1) in un tubo da 2,0 mL e centrifugare a 6,000 xg e 4 ° C per 5 minuti. Scartare il surnatante.
2. Resispendere il pellet in 1 ml di acqua e centrifugare a 6000 xg e 4 ° C per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 ml di acqua.
3. Trasferire la sospensione in un vassoio di alluminio pre-pesato. Trasferire il vassoio ad un forno a secco a 105 ° C per un essiccamento notturno (circa 18 h).
   CRITICI: È importante che il vassoio venga trattato con pinze per evitare il trasferimento di materiale dalle dita. Asciugare un vassoio in alluminio vuoto pre-pesato sotto le stesse condizioni per determinare qualsiasi perdita di peso dai vassoi durante l'essiccazione.
4. Dopo l'essiccazione, rimuovere il vassoio dal forno e lasciarlo equilibrare a conditi ambientaliOns per 5 minuti prima di pesarlo con una precisione di 0,0001 g.
   NOTA: il valore può essere utilizzato per normalizzare il contenuto di glicogeno su base cellulare a secco.

3. Lisi delle cellule cianobatteriche

1. Trasferire 1 mL di una coltura o una resuspensione cellulare (vedere la fase 1.1) in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 6,000 xg e 4 ° C per 10 minuti. Scartare il surnatante.
2. Resuspendere il pellet in 1 ml di 50 mM Tris-HCl, pH 8 e centrifugare a 6000 xg e 4 ° C per 10 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone Tris-HCl. Ripetere il processo.
3. Riposizionare completamente il pellet in 500 μl di 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.
   CRITICI: Resuspendere il pozzetto di pellet per una lisi di cellule efficiente. Tenere la resuspensione in ghiaccio.
4. Lyse le cellule resuscitate a 4 ° C eseguendo 30 cicli di ultrasonografia, ogni ciclo composto da 30 s ad una frequenza di 20 kHz con l'ampiezza massima,Seguito da 90 s senza.
   NOTA: Questo metodo può efficacemente lire Synechococcus sp. PCC 7002.
   1. In alternativa, trasferire la resuspensione delle cellule in un tubo a vite e aggiungere branelli di ossido di zirconio al tubo, seguendo le istruzioni del produttore. Impostare il tubo in un omogeneizzatore tissutale e liscivare le cellule a 4 ° C eseguendo 2 cicli di battitura, ciascun ciclo consistente di 5 minuti alla regolazione di frequenza di 5.
      NOTA: Questo metodo può efficacemente lire Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002.
5. Centrifugare il tubo contenente il lisato per 10 min a 6.000 xg e 4 ° C.
   NOTA: Il pellet dovrebbe consistere principalmente in grandi detriti di celle. Se c'è un numero significativo di cellule ininterrotte, ripetere il passo 3.4. Tenere il surnatante sul ghiaccio.
6. Determinare la concentrazione proteica usando un kit di analisi della proteina BCA commerciale.
   NOTA: il valore può essere utilizzato per normalizzare il contenuto di glicogenoSu base di proteine.

4. Precipitazione di glicogeno

1. Togliere la clorofilla a dal lisato cellulare mescolando 900 μl di etanolo al 96% (v / v) e 100 μL del supernatante dal punto 3.5 in un tubo a vite a 1,5 ml. Dopo aver chiuso il coperchio, riscaldare il tubo a 90 ° C per 10 minuti usando un blocco di riscaldamento standard di laboratorio.
2. Incubare il tubo sul ghiaccio per 30 min.
3. Centrifugare il tubo a 20.000 xg e 4 ° C per 30 minuti e rimuovere attentamente il surnatante; Il pellet contiene glicogeno. Asciugare leggermente il pellet in aria per rimuovere l'etanolo in eccesso.
   CRITICA: Si deve evitare l'essiccazione eccessiva del pellet, altrimenti diventa difficile da solubilizzare nel punto 5.1.
4. OPTIONAL: Misurare l'assorbanza del surnatante ottenuto nello stadio 4.3 a 664 nm per determinare la clorofilla un contenuto. Usare un coefficiente di assorbimento di 84,6 L / g / cm ²⁴ .
   NOTA: il valore può essere utilizzato per normalizzareE il contenuto di glicogeno.

5. Idrolisi enzimatica e determinazione dei glicogeni

1. Solubilizzare il pellet ottenuto nel punto 4.3 in 100 μL di 50 mM acetato di sodio, pH 5, e aggiungere 50 μL di 8 U / ml amiloglucosidasi e 50 μL di 2 U / ml α-amilasi. Mescolare bene questi materiali usando un vortice.
   NOTA: La miscelazione mediante pipetta non è raccomandata perché il pellet glicogeno è viscoso.
2. Incubare la miscela a 60 ° C su un blocco di riscaldamento per 2 ore per consentire la digestione del glicogeno in molecole di glucosio.
3. Centrifugare il campione a 10.000 xg per 5 minuti e trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 mL.

6. Determinazione del contenuto totale di glucosio utilizzando il reagente GOD-POD

1. Misurare la concentrazione di glucosio nel supernatante ottenuto nel punto 5.3 utilizzando il reagente GOD-POD. Trasferire 100 μl del supernatante dalla fase 5.3 in un pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Come controllo negativo,Utilizzare 100 μL di 50 mM acetato di sodio, pH 5. Per generare una curva di calibrazione, misurare anche le soluzioni standard di glucosio.
2. Aggiungere 150 μl di reagente GOD-POD a ciascun campione e mescolare rapidamente pipettando.
3. Incubare la lastra staticamente a 25 ° C per 30 min. Registrare il valore di assorbanza a 510 nm utilizzando un lettore di piastre.
4. Calcolare la concentrazione del glucosio utilizzando una curva di calibrazione ottenuta dagli standard di glucosio.
   NOTA: La concentrazione di glicogeno nel lisato cellulare è espressa come concentrazione del glucosio (μg / mL).

Risultati

10 mi di wildtype Synechocystis sp. PCC 6803 sono state coltivate in condizioni fotoautotrofiche fino a quando il valore OD _{730nm ha} raggiunto circa 0,8. Le cellule sono state raccolte e risospese in 50 mM Tris-HCl, pH 8. Il valore OD _{730nm è} stato regolato a 2-3. Il contenuto di glicogeno è stato analizzato seguendo il protocollo sopra descritto. Il contenuto di glicogeno per OD _730nm era di 13 ± 1,8 μg / mL / OD _730nm ( N

Discussione

I punti critici all'interno del protocollo sono la precipitazione e la risospensione del glicogeno. Dopo la centrifugazione dopo la precipitazione dell'etanolo, il glicogeno forma un pallone traslucido che aderisce sciattamente alle pareti dei tubi di microcentrifuga. Pertanto, quando si rimuove il surnatante, è necessario prestare particolare attenzione per non rimuovere il pellet. Il pellet di glicogeno è appiccicoso e la solubilizzazione può essere difficile se si asciuga. Si noti che la solubilizzazione c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
QSonica Sonicators Q700	Qsonica, LLC	NA	QSonica
SpectraMax 190 Microplate Reader	Molecular Devices	NA	Eliza plate reader
Bullet Blender Storm	Next Advance	BBY24M-CE	Beads beater
Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer	Amersham Biosciences	NA	Spectrophotometer
Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Buffer
HCl	Merck	1-00317	pH adjutment
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	32319	Buffer
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)	Megazyme	E-AMGPU	Enzyme for glycogen depolymerization
α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)	Sigma-Aldrich	A3176	Enzyme for glycogen depolymerization
D-Glucose	Merch	8337	Standard for the glucose assay
Pierce BCA Protein assay kit	Thermo Fisher scientific	23225	For determination of protein concentrations
Aluminum drying trays, disposable	VWR	611-1362	For determination of cell dry weights
D-Glucose assay kit (GODPOD format)	Megazyme	K-GLUC	For determination of glucose concentrations
Zirconium oxide breads, 0.15 mm	Next Advance	ZrOB015	Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm
RINO tubes	Next Advance	NA	Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm