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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir einen zuverlässigen und einfachen Assay vor, um den Glykogengehalt in Cyanobakterienzellen zu messen. Das Verfahren beinhaltet die Ausfällung, die selektierbare Depolymerisation und den Nachweis von Glukoseresten. Diese Methode eignet sich sowohl für Wildtyp- als auch für gentechnisch veränderte Stämme und kann das metabolische Engineering von Cyanobakterien erleichtern.

Zusammenfassung

Cyanobakterien akkumulieren Glykogen als eine wichtige intrazelluläre Kohlenstoff- und Energiespeicherung während der Photosynthese. Die jüngsten Entwicklungen in der Forschung haben komplexe Mechanismen des Glykogenstoffwechsels hervorgehoben, einschließlich des Diel-Zyklus der Biosynthese und des Katabolismus, der Redoxregulation und der Beteiligung von nicht-kodierender RNA. Gleichzeitig werden Anstrengungen unternommen, um Kohlenstoff von Glykogen zu wünschenswerten Produkten in gentechnisch veränderten Cyanobakterien umzuleiten, um die Produktausbeuten zu erhöhen. Mehrere Methoden werden verwendet, um den Glykogengehalt in Cyanobakterien mit variablen Genauigkeiten und technischen Komplexitäten zu bestimmen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die zuverlässige Bestimmung des Glykogengehalts in Cyanobakterien zur Verfügung, die in einem Standard-Life-Science-Labor durchgeführt werden können. Das Protokoll beinhaltet die selektive Ausfällung von Glykogen aus dem Zelllysat und die enzymatische Depolymerisation von Glykogen zur Erzeugung von Glucose-Monomeren, die durch einen Glukoseoxyd nachgewiesen werdenIdase-Peroxidase (GOD-POD) enzymgekoppelter Assay. Die Methode wurde auf Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus sp. PCC 7002, zwei Modell-Cyanobakterienarten, die in der Stoffwechseltechnik weit verbreitet sind. Darüber hinaus zeigte das Verfahren erfolgreich Unterschiede in den Glykogeninhalten zwischen dem Wildtyp und Mutanten, die in regulatorischen Elementen oder Glykogen-Biosynthesegenen defekt sind.

Einleitung

Cyanobakterien akkumulieren Glykogen als den Hauptkohlenhydratspeicher von Kohlenstoff aus CO 2, der durch Lichtsynthese in Licht fixiert ist. Glykogen ist ein Glycan, bestehend aus linearem α-1,4-verknüpften Glucan mit Verzweigungen, die durch α-1,6-verknüpfte Glucosyl-Bindungen erzeugt werden. Die Glykogen-Biosynthese in Cyanobakterien beginnt mit der Umwandlung von Glucose-6-phosphat in ADP-Glucose durch die sequentielle Wirkung von Phosphoglucomutase und ADP-Glucose-Pyrophosphorylase. Der Glucoseanteil in ADP-Glucose wird auf das nicht-reduzierende Ende des α-1,4-Glucan-Grundgerüsts von Glykogen durch eine oder mehrere Glykogensynthasen (GlgA) übertragen. Anschließend führt eine Verzweigungsenzyme die α-1,6-verknüpfte Glucosylbindung ein, die weiter ausgedehnt wird, um das Glykogenteilchen zu erzeugen. Im Dunkeln wird Glykogen durch Glykogenphosphorylase, Glykogen-Entzweigungsenzyme, α-Glucanotransferase und Malto-Dextrin-Phosphorylase in phosphorylierte Glukose und freie Glukose abgebaut. Diese FuttermittelO katabolische Wege, einschließlich des oxidativen Pentose-Phosphat-Weges, des Embden-Meyerhof-Parnas-Weges (Glykolyse) und des Entner-Doudoroff-Weges 1 , 2 , 3 , 4 .

Der Glykogen-Metabolismus in Cyanobakterien hat in den letzten Jahren zunehmend Interesse geweckt, weil Cyanobakterien die Möglichkeit haben, sich in mikrobielle Zellfabriken zu entwickeln, die von Sonnenlicht angetrieben werden, um Chemikalien und Kraftstoffe herzustellen. Der Glykogen-Stoffwechsel könnte modifiziert werden, um die Ausbeute der Produkte zu erhöhen, da Glykogen der größte flexible Kohlenstoff-Pool in diesen Bakterien ist. Ein Beispiel ist das Cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, das genetisch hergestellt wurde, um Mannit zu produzieren; Die genetische Störung der Glykogensynthese erhöht die Mannit-Ausbeute 3-fach 5 . Ein weiteres Beispiel ist die Herstellung von Bioethanol aus Glykogen-beladenem WildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 Der Wildtyp-Zell-Glykogengehalt kann bis zu 60% des Trockengewichts der Zelle während des Stickstoff-Verhungerns 6 betragen.

Unser Verständnis von Glykogenstoffwechsel und Regulierung hat sich auch in den letzten Jahren erweitert. Während Glykogen bekannt ist, sich im Licht zu akkumulieren und im Dunkeln zu kalibrieren, wurde die detaillierte Kinetik des Glykogenstoffwechsels während des Diel-Zyklus erst vor kurzem in Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Darüber hinaus wurden mehrere Gene, die die Akkumulation von Glykogen beeinflussen, identifiziert. Ein bemerkenswertes Beispiel ist die Entdeckung, dass die mutmaßliche Histidinkinase PmgA und die nicht-kodierende RNA PmgR1 eine regulatorische Kaskade bilden und die Akkumulation von Glykogen kontrollieren. Interessanterweise sammeln die pmgA- und pmgR1- Deletionsmutanten doppelt so viel Glykogen wie der Wildtyp-Stamm von Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 Es sind auch andere regulatorische Elemente bekannt, die die Akkumulation von Glykogen beeinflussen, einschließlich des alternativen Sigma-Faktors E und des Transkriptionsfaktors CyAbrB2 10 , 11 .

Da das Interesse an der Glykogenregulation und dem Metabolismus zunimmt, ist ein detailliertes Protokoll, das die Bestimmung des Glykogengehalts beschreibt, gerechtfertigt. In der Literatur werden mehrere Methoden angewendet. Säurehydrolyse, gefolgt von der Bestimmung des Monosaccharidgehalts durch Hochdruck-Anionenaustausch-Flüssigkeitschromatographie, gekoppelt mit einem gepulsten amperometrischen Detektor oder spektrometrische Bestimmung nach Behandlungen mit Säure und Phenol, sind weit verbreitete Verfahren zur Annäherung des Glykogengehalts 9 , 10 , 12 , 13 . Allerdings ist ein Hochdruck-Anionenaustausch Flüssigkeit ChromatographieC-Instrument ist sehr teuer und unterscheidet nicht Glukose, die aus Glykogen stammt, aus jener, die von anderen glucosehaltigen Glycokonjugaten abgeleitet ist, wie Saccharose 14 , Glucosylglycerin 15 und Cellulose 16 , 17 , 18 , von denen bekannt ist, dass sie sich in einigen Cyanobakterienarten ansammeln. Das Säure-Phenol-Verfahren kann mit Standard-Laborgeräten durchgeführt werden. Allerdings verwendet es hochgiftige Reagenzien und unterscheidet nicht Glukose, die von verschiedenen Glycokonjugaten abgeleitet ist, noch unterscheidet es Glukose von anderen Monosacchariden, die zelluläre Materialien wie Glykolipide, Lipopolysaccharide und extrazelluläre Matrizen bilden 12 . Bemerkenswerterweise wird der heiße Säure-Phenol-Assay häufig für die Bestimmung des Gesamtkohlenhydratgehaltes und nicht für die spezifische Bestimmung des Glukosegehalts 12 verwendet . Enzymatische hyDie drolyse von Glykogen zu Glucose durch α-Amyloglucosidase, gefolgt von dem Nachweis von Glukose durch einen enzymgekoppelten Assay, erzeugt eine kolorimetrische Auslesung, die hochempfindlich und spezifisch für Glukose ist, die aus Glykogen gewonnen wird. Die Spezifität kann mit der bevorzugten Ausfällung von Glykogen aus Zelllysaten durch Ethanol 5 , 8 , 19 weiter verstärkt werden .

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für einen Enzym-basierten Assay des Glykogengehalts in zwei der am meisten untersuchten Cyanobakterienarten Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus sp. PCC 7002, im Wildtyp und Mutantenstämme. Um eine effiziente Hydrolyse zu gewährleisten, wird ein Cocktail aus α-Amylase und α-Amyloglucosidase verwendet 8 . Die endo-wirkende α-Amylase hydrolysiert die α-1,4-Bindungen in verschiedenen Glucanen in Dextrine, die weiter hydrolysiert werdenO Glucose durch exo-aktive α-Amyloglucosidase 20 . Die synergistischen Wirkungen dieser Enzyme sind bekannt, und diese Enzyme werden routinemäßig für die selektive Hydrolyse von Stärke verwendet, die ein α-verknüpftes Glucan wie Glykogen ist, ohne andere Glycokonjuganten wie Cellulose in der Pflanzenbiomasse 21 zu beeinflussen . Die freigesetzte Glukose wird nach einem enzymgekoppelten Assay, bestehend aus Glucoseoxidase, quantifiziert, der die Reduktion von Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid und die Oxidation von Glucose zu einer Lacton- und Peroxidase katalysiert, die einen rosafarbenen Chinoniminfarbstoff aus Wasserstoffperoxid, Eine phenolische Verbindung und 4-Aminoantipyrin 22 .

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Protokoll

1. Vorbereitung

  1. Cyanobakterielle Kulturen
    1. Wachsen Synechocystis sp. PCC 6803 bei 30 ° C in flüssigem BG11-Medium 8 , mit einer konstanten Luftzufuhr, ergänzt mit 1% (V / V) CO 2 . Beleuchten Sie die Kulturen kontinuierlich mit Licht bei einer photosynthetischen Photonenflussdichte von 50 μmol Photon / m 2 / s.
    2. Wachsen Synechococcus sp. PCC 7002 in flüssigem A + Medium 23 (BG11-Medium kann auch verwendet werden), mit einer konstanten Luftzufuhr, ergänzt mit 1% (V / V) CO 2 . Die Temperatur sollte 37 ° C betragen. Beleuchten Sie die Kulturen kontinuierlich mit Licht bei einer photosynthetischen Photonenflussdichte von 150 μmol Photon / m 2 / s.
    3. Messen Sie die optische Dichte (OD) der Kultur bei 730 nm mit einer Küvette mit einem Lichtweg von 1 cm. Wenn der OD-Wert über 0,8 liegt, machen Sie entsprechende Verdünnungen, um OD-Messungen zu erhalten, die proportional zu th sindE Zellkonzentration
      HINWEIS: Die unten dargestellten Protokolle sind für Flüssigkulturen geeignet, wobei eine Zelldichte einem OD 730nm- Wert von 2 oder höher entspricht. Wenn Kulturen in der exponentiellen Wachstumsphase erwünscht sind, die typischerweise einen OD 730nm- Wert unter 1 haben, konzentrieren sie die Zelldichte durch Zentrifugation und Resuspension in einem Puffer oder Medium, um einen OD 730nm- Wert von 2 oder höher zu erreichen.
  2. Puffer und Reagenzien
    1. Machen Sie 50 mM Tris-HCl-Puffer bei pH 8.
    2. Mischen Sie 50 mM Natriumacetatpuffer bei pH 5.
    3. Eine Stammlösung von 8 U / ml Amyloglucosidase in 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 5, herstellen.
    4. Eine Stammlösung von 2 U / ml α-Amylase in 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 5, herstellen.
    5. Unter Verwendung von destilliertem Wasser werden Glukose-Standardlösungen in Konzentrationen zwischen 0 und 100 μg / ml, hergestellt.
    6. GOD-POD-Reagenz aus dem D-Glucose-Assay-Kit (GODPOD-Format) vorbereiten, fDer Anweisung des Herstellers.

2. Bestimmung des Zell-Trockengewichts (optional)

  1. Übertragen Sie 2 ml einer Kultur oder einer Zellresuspension (siehe Schritt 1.1) auf ein 2,0 ml Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 6000 xg und 4 ° C für 5 min. Den Überstand verwerfen.
  2. Das Pellet in 1 ml Wasser resuspendieren und 5 min bei 6000 xg und 4 ° C zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 0,5 ml Wasser resuspendieren.
  3. Übertragen Sie die Aufhängung auf eine vorgewogene Aluminiumschale. Übertragen Sie das Tablett auf einen Trockenofen bei 105 ° C für Übernachttrocknung (ca. 18 h).
    KRITISCH: Es ist wichtig, dass das Tablett mit einer Pinzette gehandhabt wird, um die Übertragung von Material von den Fingern zu vermeiden. Trocknen Sie eine leere, vorgewogene Aluminium-Schale unter den gleichen Bedingungen, um jeden Gewichtsverlust aus den Schalen während des Trocknens zu bestimmen.
  4. Nach dem Trocknen entfernen Sie das Tablett aus dem Ofen und lassen Sie es bei Umgebungsbedingungen ausgleichenOns für 5 min vor dem Wiegen mit einer Genauigkeit von 0,0001 g.
    HINWEIS: Der Wert kann verwendet werden, um den Glykogengehalt auf einer Zell-Trockengewichtsbasis zu normalisieren.

3. Lyse von Cyanobakterienzellen

  1. 1 ml einer Kultur oder einer Zellresuspension (siehe Schritt 1.1) in ein 1,5 mL Röhrchen überführen und bei 6000 xg und 4 ° C für 10 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen.
  2. Das Pellet wird in 1 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8 resuspendiert und bei 6000 xg und 4 ° C für 10 min zentrifugiert. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml des Tris-HCl-Puffers. Wiederholen Sie den Vorgang.
  3. Das Pellet in 500 μl 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8, sorgfältig resuspendieren.
    CRITICAL: Das Pellet gut für eine effiziente Zelllyse resuspendieren. Halten Sie die Resuspension in Eis.
  4. Lyse die resuspendierten Zellen bei 4 ° C durch Durchführen von 30 Zyklen der Ultraschallbehandlung, wobei jeder Zyklus aus 30 s bei einer Frequenz von 20 kHz mit der maximalen Amplitude besteht,Gefolgt von 90 s ohne.
    HINWEIS: Diese Methode kann Synechococcus sp. PCC 7002
    1. Alternativ können Sie die Zelle Resuspension auf ein Schraubverschlussrohr übertragen und Zirkonoxidperlen dem Rohr nach den Anweisungen des Herstellers zugeben. Setzen Sie den Schlauch in einen Gewebehomogenisator und lysieren Sie die Zellen bei 4 ° C, indem Sie 2 Zyklen des Schlagens ausführen, wobei jeder Zyklus aus 5 min bei der Frequenzeinstellung von 5 besteht.
      HINWEIS: Diese Methode kann Synechocystis sp. PCC 6803 und Synechococcus sp. PCC 7002
  5. Das Röhrchen, das das Lysat enthält, für 10 min bei 6000 xg und 4 ° C zentrifugieren.
    HINWEIS: Das Pellet sollte hauptsächlich aus großen Zelltrümmer bestehen. Wenn es eine beträchtliche Anzahl von ununterbrochenen Zellen gibt, wiederholen Sie Schritt 3.4. Halten Sie den Überstand auf Eis.
  6. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration mit einem kommerziellen BCA Protein Assay Kit.
    HINWEIS: Der Wert kann verwendet werden, um den Glykogengehalt zu normalisierenAuf Proteininhaltsbasis.

4. Glykogen Niederschlag

  1. Entfernen Sie Chlorophyll a aus dem Zelllysat durch Mischen von 900 μl 96% (v / v) Ethanol und 100 μl des Überstandes aus Schritt 3.5 in einem 1,5 mL Schraubverschlussrohr. Nach dem Schließen der Kappe das Röhrchen bei 90 ° C für 10 min mit einem Standard-Laborheizblock erhitzen.
  2. Inkubieren Sie die Röhre auf Eis für 30 min.
  3. Das Röhrchen bei 20.000 xg und 4 ° C für 30 min zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen; Das Pellet enthält Glykogen. Das Pellet in der Luft trocknen, um überschüssiges Ethanol zu entfernen.
    KRITISCH: Eine übermäßige Trocknung des Pellets muss vermieden werden, sonst wird es in Schritt 5.1 schwer zu lösen.
  4. OPTIONAL: die Absorption des in Schritt 4.3 bei 664 nm erhaltene Überstand misst die Chlorophyll - a - Gehalt zu bestimmen. Verwenden Sie einen Absorptionskoeffizienten von 84,6 L / g / cm 24 .
    HINWEIS: Der Wert kann zum Normalisieren verwendet werdenE der Glykogengehalt

5. Enzymatische Hydrolyse und Glykogenbestimmung

  1. Das in Schritt 4.3 erhaltene Pellet in 100 & mgr; l 50 mM Natriumacetat, pH 5, löst und 50 & mgr; l 8 U / ml Amyloglucosidase und 50 & mgr; l 2 U / ml α-Amylase zugeben. Mischen Sie diese Materialien gut mit einem Wirbel.
    HINWEIS: Das Mischen durch Pipettieren wird nicht empfohlen, da das Glykogenpellet viskos ist.
  2. Inkubieren Sie die Mischung bei 60 ° C auf einem Heizblock für 2 h, um die Verdauung von Glykogen in Glukosemoleküle zu ermöglichen.
  3. Die Probe bei 10.000 xg für 5 min zentrifugieren und den Überstand in ein neues 1,5 ml Röhrchen überführen.

6. Bestimmung des Gesamtglukosegehalts unter Verwendung des GOD-POD-Reagens

  1. Messen Sie die Konzentration von Glukose in dem in Schritt 5.3 erhaltenen Überstand unter Verwendung des GOD-POD-Reagenzes. Übertragen Sie 100 & mgr; l des Überstandes von Schritt 5.3 zu einer Vertiefung in einer Platte mit 96 Vertiefungen. Als Negativkontrolle,100 μl 50 mM Natriumacetat, pH 5 verwenden. Zur Erzeugung einer Eichkurve werden auch die Glucose-Standardlösungen gemessen.
  2. Füge 150 μl GOD-POD-Reagenz zu jeder Probe hinzu und vermische mich schnell durch Pipettieren.
  3. Inkubieren Sie die Platte statisch bei 25 ° C für 30 min. Den Extinktionswert bei 510 nm mit einem Plattenleser aufzeichnen.
  4. Berechnen Sie die Konzentration von Glukose mit einer Eichkurve, die aus den Glukosestandards erhalten wird.
    HINWEIS: Die Glykogenkonzentration im Zelllysat wird als Konzentration von Glucose (μg / ml) ausgedrückt.

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Ergebnisse

10 ml Wildtyp- Synechocystis sp. PCC 6803 wurden unter photochotrophischen Bedingungen gezüchtet, bis der OD 730nm Wert etwa 0,8 erreichte. Die Zellen wurden geerntet und in 50 mM Tris-HCl, pH 8, resuspendiert. Der OD 730nm- Wert wurde auf 2-3 eingestellt. Der Glykogengehalt wurde nach dem oben beschriebenen Protokoll analysiert. Der Glykogengehalt pro OD 730 nm betrug 13 ± 1,8 μg / mL / OD 730 nm ( N = 12). Die Glykogen - ...

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Diskussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls sind Glykogenpräzipitation und Resuspension. Nach der Zentrifugation nach Ethanol-Präzipitation bildet Glykogen ein lichtdurchlässiges Pellet, das lose an den Wänden der Mikrozentrifugenröhrchen haftet. Daher muss beim Entfernen des Überstandes besondere Aufmerksamkeit gegeben werden, um das Pellet nicht zu entfernen. Das Glykogen-Pellet ist klebrig, und Solubilisierung kann schwierig sein, wenn es austrocknet. Man beachte, daß die vollständige Solubilisierung des Glyk...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren bestätigen die nordische Energieforschung (AquaFEED, Projekt Nr. 24), Innovationfonden Dänemark (Pant Power, Projekt Nr. 12-131844) und Villum Fonden (Projekt Nr. 13363)

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
QSonica Sonicators Q700Qsonica, LLCNAQSonica
SpectraMax 190 Microplate Reader Molecular DevicesNAEliza plate reader
Bullet Blender StormNext AdvanceBBY24M-CEBeads beater
Ultrospec 3100 pro UV/Visible SpectrophotometerAmersham BiosciencesNASpectrophotometer
Tris Sigma-AldrichT1503Buffer
HClMerck1-00317pH adjutment
Sodium acetateSigma-Aldrich32319Buffer
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.)MegazymeE-AMGPUEnzyme for glycogen depolymerization
α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis)Sigma-AldrichA3176Enzyme for glycogen depolymerization
D-GlucoseMerch8337Standard for the glucose assay
Pierce BCA Protein assay kit Thermo Fisher scientific23225For determination of protein concentrations
Aluminum drying trays, disposableVWR611-1362For determination of cell dry weights
D-Glucose assay kit (GODPOD format)MegazymeK-GLUCFor determination of glucose concentrations
Zirconium oxide breads, 0.15 mmNext AdvanceZrOB015Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm
RINO tubesNext AdvanceNATubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm

Referenzen

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