Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Özet

Bu çalışma, konfokal görüntüleme yöntemlerinin tam olarak kullanılmasını sağlayan kalın, üç boyutlu doku kesiti analizi için yeni bir işleme ve görüntüleme protokolü sunmaktadır. Bu protokol antijenliği korur ve cilt histolojisini ve potansiyel olarak diğer doku tiplerini analiz etmek için sağlam bir sistemi temsil eder.

Özet

Bilimsel bir argümanı destekleyen mikroskopik bir görüntü oluşturmak için bir ilgi dokusu işleme zorlu olabilir. Yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerin elde edilmesi tamamen mikroskop kalitesine değil aynı zamanda çoklu kritik eylem veya basamakları içeren doku işleme yöntemlerine de bağlıdır. Dahası, derideki ve diğer dokulardaki mezenkimal hücre türleri, doku hazırlama ve görüntüleme için yeni bir mücadeleyi temsil eder. Burada, doku hasatından mikroskobiye kadar eksiksiz bir süreç sunuyoruz. "Yatay tüm montaj" olarak adlandırılan tekniğimiz, acemilerin hızlı bir şekilde yetkinleşebildikleri ve bir kriyostatla kesilen 60-300 μm kalınlıktaki kesitlerde antijenlerin korunması ve algılanmasına izin veren tekniğidir. Bu kalınlığın kesitleri, üç boyutlu bir çevrede doku mikro mimarisinin gelişmiş görselleştirilmesini sağlar. Buna ek olarak, protokol, mezenkimal hücreleri, görüntü kalitesini arttıran bir şekilde korur.Standart kriyostat veya parafin kesitlerine kıyasla azaltılır, böylece immün boyamanın etkililiği ve güvenilirliği artar. Bu protokolün deri ve muhtemelen diğer doku ve organları görselleştiren tüm laboratuvarlara fayda sağlayacağına inanıyoruz.

Giriş

Mikroskobik görüntüleme ekipmanının devrimi sofistike, yüksek çözünürlüklü görüntüleme aletleri sağlar. Bununla birlikte, komple bir üç boyutlu (3D) doku kesitinin mikroskobik bir görüntüsünü elde ederken, numune hazırlama önemli zorluklar sunar ve görüntü kalitesini tanımlamada sınırlayıcı faktör olabilir. Her ayrı adım, doku morfolojisini ve hedef proteinlerin antijenikliğini korumak, işleme neden olan eserleri en aza indirgemek ve nihai görüntü kalitesini en üst düzeye çıkarmak için dikkatle düşünmeyi hak ediyor. Örneğin, cildin geleneksel analizi, kök hücre bölmesinin cilt homeostazına katkılarını anatomik olarak analiz etmeye olanak tanıyan saç folikülleri düzgün şekilde yönlendirilmiş epidermis ve dermis manzaralı bir görüntü gerektirir ^{1 , 2} . Bu, cildin gömülü ve kesit üzerine nasıl yoğunlaşıldığını gerektirir. Önemlisi, saç follikülleri daha kalın olabilirStandart parafin veya dondurulmuş kesit kalınlığını büyük ölçüde aşan 100 μm'den daha büyüktür ve tüm montaj parçaları veya kalın kesitler ^{3 , 4 , 5'e} kıyasla daha düşük bir analiz standardı sağlar.

Birlikte ele alındığında, mikroskopik analiz için numune hazırlamanın her bir adımı, görüntü analizini etkileyen kritik bir belirleyicidir. Burada, "yatay bütün montaj" olarak adlandırdığımız kalın, 3D doku kesit analizi için yeni bir işleme protokolü sunuldu. Protokol, antijenikliği oldukça korur ve standart konfokal görüntüleme ekipmanı kullanarak cildin kalın bölümlerinin tam olarak kullanılmasını sağlar. Bu, doku hasadı ve paraformaldehit (PFA) ile desteklenmiş kriyoprezervasyon (1. adım), bir kriyostatla 100 μm kalınlıkta doku kesitlerinin oluşturulması da dahil olmak üzere kalın doku kesiti işleme ve görüntüleme için cildi kullanmanın tam bir rehberidir (basamak 2) Ve immünofloresan etiketleme ve montaj (adım 3 ve 4). Temsilci sonuçlar, bu protokolün potansiyel kullanıcısı için "yatay tüm montajların" avantajlarını vurgulayan iki farklı histolojik hazırlama tekniğinin (klasik cryosectioning ve kalın, 3D doku kesit kesitleri) konfokal görüntülerini karşılaştırır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, yerel etik onaya tabi tutuldu ve Birleşik Krallık hükümeti Ev Ofisi lisansı koşulları altında gerçekleştirildi.

1. Deri Hasat ve Kriyoprezervasyon

1. Hazırlıklar.
   1. 25 mL% 4 PFA içeren 100 mm'lik bir kültür çanağı ve 25 mL'lik 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki adet 100 mm'lik kültür çanağı hazırlayın.
   2. En uygun kesme sıcaklığı bileşiğiyle (OCT) üçte ikisi kadar dikdörtgen soyulmuş kristal kutuları doldurun.
   3. Kriyokokarların sonraki adımına yerleştirilebileceği bir metal plakayı -80 ° C derin dondurucuya yerleştirin.
2. Cilt hasadı, fiksasyon ve kriyoprezervasyon.
   1. Hayvan kadavranın dorsal bölgesini kuru bir elektrikli tıraş makinesiyle kırpın.
      NOT: Bu örnekte, doğum sonrası gün 21 vahşi fareler kullanılmıştır.
   2. Cilt üzerinde ilgi alanları toplayın.
      NOT: Fare derisinin dorsomedial bölgesi (
   3. Hasat gören cildi, saç kökü tanesinin yönsel büyümesini hesaba katarak, kriyormoldun tabanına uyacak şekilde uygun boyutta dikdörtgen parçalara bölün.
      NOT: Küçük deri dilimleri, yeni başlayanlar için kuluçka ve montaj işlemi sırasında birbirine çarpma ihtimalleri daha düşük olduğu için işlenmesi daha kolay olabilir. Burada gösterilen örnek, bir 22 x 30 x 20 mm cryomold (Şekil 2a) içine uyan dorsal deri, bir yaklaşık 1 ^cm2 alandır.
   4. Deri numunelerinin kalınlığına bağlı olarak ( Şekil 1b ) 10-30 dakika, 25 mL% 4 PFA içinde oda sıcaklığında cildi düzeltin.
   5. Cilt örneklerini 25 mL PBS içinde iki kez yıkayınEn az 5 dakika boyunca ( Şekil 1b ).
   6. Dondurma işlemi sırasında kristalleşmeye neden olan ve cryosectioning sonuçlarını etkileyebilecek aşırı PBS dokusunu dikkatlice boşaltmak için cilt örneklerini kağıt havlu üzerine koyun.
      NOT: Standart bir sukroz gradyan gerekli değildir. Bununla birlikte, bu ayrıca kullanıcının takdirine bağlı olarak protokole dahil edilebilir.
   7. Her cilt örneği için saç köklerinin yöneliminin farkında olun. Görsel yardım için diseksiyon mikroskopu kullanın (özellikle ilk kez protokolü uygulayan herkes). Cilt örneğini OCT dolu dondurma ağzına yerleştirin ve forseps kullanarak kırpılmış saç yüzeyine yapışmış hava kabarcıkları çıkartarak cildin tüm alanlarını OCT ile dengeye getirin ( Şekil 2a ve 2b ).
   8. Cildi, OCT dolgulu bloğun altına iterek alt kısımyla aynı hizada olacak şekilde itin.
      NOT: Cilt herhangi bir yönde,Saç folikülü tanecikleri uygun kesim prosedürleri için belirtildiği sürece. Bloklar, kriyoterapi için kriyosataya tutturuldukça, cryomolds yeniden yönlendirilir. Bu adım, kriyostat kesiminin sonraki yönlendirmesini belirlediği için saç kökü yönlendirmesini cryomold üzerinde işaretleyin.
   9. Dondurucu blokları, dokunun yüzüp çıkmasını önlemek için -80 ° C derin dondurucunun metal plakasına aktarın.
   10. Görülmeyen hava kabarcığı cildin dondurucu yüzeyine yükselmesine neden olabileceğinden, cryomold'un altında cildin yönünü korumak için dondurma işlemini izleyin.
       NOT: Dondurulmuş dokuya sahip olan krison kapsülleri -80 ° C'de bir yıldan fazla saklanabilir ve ek bölümler için tekrar kullanılabilir.

Şekil 1. Fare derisinin hasat edilmesi ve fiksasyonu.
( A ) Deri dokusu, hayvan kadaverinin dorsomedial bölgesinden hasat edildi. Bu bölgedeki kıl folikülleri eşit aralıklarla hizalanır ve bu nedenle oklarla gösterildiği gibi bölümleme esnasında optimum yönlendirme sağlar. ( B ) Kriyomole uyan uygun bir boyuttaki kareleri kestikten sonra, cilt dokusu 15 dakika% 4 PFA içinde sabitlenmiş ve her biri 5 dakika PBS'de iki kez yıkanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

2. Kalın Doku Kesitleri

1. Kriyostat üzerine monte edilecek hazırlık ve doku yönlendirmesi.
   1. 15 mL PBS ile 100 mm'lik bir kültür çanağı hazırlayın. Kriyostatın üzerinde kolayca erişilebilen bir alana koyun. Buna ek olarak, oyuk başına 2.5 mL PBS ile 12 oyuklu bir plaka hazırlayın; S uzun süreli saklama için örneklere göre etiket4 ° C sıcaklıkta. Bölümleri tutmak için forseps kullanın.
   2. Kriyostatın sıcaklığını -20 ° C'ye ayarlayın.
      NOT: Sıcaklık kesitlemeyi etkileyebilir, ancak iyi bir kılavuz -20 ° C'de başlamaktır.
   3. Yaklaşık iki folikül kalınlığına sahip bölümler elde etmek için kriyostatın kesitlerini 150 μm kalınlığa ayarlayın.
      NOT: Kesitin kalınlığı, kullanıcının ihtiyaçlarına ve analiz için kullanılacak mikroskop sınırlamalarına bağlı olarak değişebilir.
      NOT: Örneğin yönü, saç follikülleri ile uygun yönde cilt bölümleri elde etmek için kritiktir. Bu, kriyostat bloğuna düzgün şekilde monte edilerek gerçekleştirilir. Kesit düzleminin saç follikülü yönüne paralel olduğundan emin olun ( Şekil 2c ). Daha önce de belirtildiği gibi, cilt örneğinde kesit düzleminin doğru yönlendirilmesi, elde edilen görüntülerin kalitesini belirlemek için çok önemli bir adımdır.Daha sonraki bir adım.

Şekil 2. Gömme, kriyoprezervasyon ve kesit alma.
( A ) Siyah oklarla belirtilen cryomold'da saç kökü (HF) yönünün işaretlenmesi, kriyoteksiyon sırasında doğru yönlendirme için önemlidir. ( B ) Kesit düzlemi, saç foliküllerinin tam uzunluğunun bozulmadığı bölümler oluşturmak için kıl folikül yönelimi ile hizalanmalıdır. ( C ) Kesitler, saç kökü yönünde siyah oklarla gösterilen kıl folikülü yönüne göre kesilmiştir. cryomold. ( D ) Kalın doku kesitleri metal forsepslerle toplandı ve ( e ) 1x PBS içeren 100 mm'lik bir kültür çanağına aktarıldı. ( F ) Oda sıcaklığında, PBS OC'yi uzaklaştırır.T. Beyaz oklarla gösterildiği gibi kalın doku kesitlerini çevreleyen bileşik. Bölümler daha sonra PBS'de serbestçe yüzerler. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

2. Cryosectioning.
   1. Kriyostatı kullanarak bir kesit kesin. Gömülü deriyi içeren OCT'yi toplamak için forseps kullanın ( Şekil 2d ).
      NOT: Optimum numune konumlandırması için X, Y ve Z eksenlerinde bağımsız hareket ve ayarlama olanağı sağlayan bir kriyostat kullanın. Bu, ideal hizalı doku kesitlerinin oluşturulmasını sağlar.
   2. Kriyostatın bölümünü PBS ile dolu 100 mm'lik kültür çanağına aktarın ve bir sonraki dilimle devam edin. Örnekleri bir slaytta toplamayın ( Şekil 2e ).
      NOT: Oda sıcaklığında, PBS çözülürForseps ile ele alınması kolay deri dilimleri bırakarak ( Şekil 2f ) OCT.
      NOT: 100 mm kalınlığındaki birçok doku kesitini çözdükten sonra 100 mm'lik kültür çanağında taze PBS gerekli olabilir ve buna göre değiştirilebilir.
   3. Yüzen cilt bölümlerini 2.5 mL'lik PBS ile dolu 12 çukurlu bir kâğıda doğru şekilde etiketlenmiş kuyuya aktarmak için forseps kullanın ( Şekil 3a , solda).
      NOT: 4 ° C'de, numuneler en az iki gün boyunca depolanabilir. Kesitten sonra deri içeren OCT bloklarının uzun süre depolanması için, kesme yüzeyini yeni OCT damlacıklarıyla sızdırmaz kılın OCT damlasının dondurulmasından sonra kullanılan OCT bloğunu parafilm içine sarın ve tekrar -80 ° C dondurucuya yerleştirin .

3. İmmünofloresan etiketleme.

1. PB tamponunu (% 0.5 yağsız süt tozu,% 0.25 balık cilt jelatin ve% 0.5 Triton X-100 ile takviye edilmiş PBS) leas'ta hazırlayınT 2 saat önce, daha önce tarif edildiği gibi ⁵ .
   NOT: Boyama tamponunun tekrar tekrar kullanılması için antikor koruması için PB tamponuna sodyum azid eklenebilir.
2. 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine etiketleyin ve tüp başına 500 PB'lik PB tampon ekleyin. Deri dilimlerini PBS'den bloke etmek için PB tamponu içeren ayrı tüplere aktarmak için dikkatle forseps kullanın ( Şekil 3a , sağ). Tüm deri dilimlerinin tamamen suya daldığından emin olun. Mikro santrifüj tüplerini oda sıcaklığında 1 saat süreyle doku bütünlüğünü bozmamak için dakikada 10 osilasyondan daha yüksek olmayan bir hızda bir testere kulakçığı üzerine yerleştirin.
   NOT: Hızın, testere kulakçığı üzerinde dakika başına 10 salınımı aşmaması kritiktir, çünkü sıkışma meydana getirecektir.
   1. Her ne kadar mikrosantrifüj tüpü başına birden fazla dilim eklemek, antikorları kurtarmak mümkün olsa da, tüp başına sadece bir dilim yerleştirin. Antikor kullanımını azaltmak için, bir hacim kullanın250 uL.
      NOT: Gerekirse, örneğin 96 oyuklu plakalar ile mikro santrifüj tüplerini değiştirin. Bununla birlikte, kalın doku kesitlerinin 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine yerleştirilmesi, sıvı pertürbasyonunun artması nedeniyle dokuda en etkili antikor penetrasyonuna olanak tanır.
3. Her bir cilt dilimi için ayrı 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve 500 uL PB tampon ve uygun birincil antikor miktarı ekleyin. 1 saatlik bloke olduktan sonra cilt dilimlerini, antikorları içeren taze hazırlanmış tüplere aktarın. Dilimleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Bu örnekte, aşağıdaki primer antikorlar kullanılmıştır: 1: 50'lik bir konsantrasyonda FITC sıçan anti-insan CD49f'si ve 1: 100'lük bir konsantrasyonda keçi anti-fare / sıçan integrin alfa 8.
4. Ertesi gün, örnek başına 500 μL PBS içeren iki ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. Cilt dilimleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca iki kez yıkanır.e.
5. Uygulanabilir sekonder antikorların ve 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolün (DAPI) uygun konsantrasyonu ile 500 uL PB tampon içeren ayrı 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın.
   NOT: Bu örnekte kullanılan sekonder antikorlar Alexa Fluor 488 eşek anti-sıçan IgG ve Alexa Fluor 555 eşek anti-keçi IgG'dir ve 1: 500'lük bir konsantrasyonda bulunur. DAPI, 1: 100 konsantrasyonda kullanıldı.
6. Cilt örneklerini, ikincil antikor ve DAPI içeren PB tamponuna dikkatlice aktarın ve cilt dilimleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca düşük bir hızda rotator veya çalkalayıcıda inkübe edin.
7. Dilimleri 4 ° C'de ikincil antikor ve DAPI içeren PB tamponuna dört güne kadar saklayın ve sodyum azid PBS'ye ilave edilirse muhtemelen daha uzun süre saklayın.

Şekil 3. İmmunofluoreskopEtiketleme ve montaj.
( A ) Yüzen doku kesitleri 12 yuvalı plakalarda en az iki gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir. İmmünoflöresan (IF) etiketlemeden önce, ilgilenilen doku kesitlerini, okla gösterildiği gibi bloke etmek için PB tamponu içeren 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. IF etiketi için, 3. adımda ayrıntılı olarak hazırlanan çok adımlı işleme dikkat edin. Basamak 3'ün bir kısmı, ok 2 ile gösterilen birincil antikor çözeltisi, ikincil antikor çözeltisi veya yıkama tamponu içeren yeni hazırlanmış mikrosantrifüj tüplerine doku kesitlerinin dikkatle aktarılmasını gerektirir. ( B ) IF etiketi sonrasında, doku çapraz kesitleri, Kesit mikroskop yardımı ile gliserol damlasında çözülür ve düzleştirilir. ( C ) Doku kesiti, bir kapak kaymasının tabanına tamamen düzleştirildiğinde, bölümün monte edilmesi için düzenli bir mikroskop lamı kullanılır. Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.

4. Mikroskopik Görselleştirme için Montaj

1. Görüntülemeden önce, cilt dilimlerini, ikincil antikorları ve DAPI'yı uzaklaştırmak için 500 μL PBS içeren ayrı mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
2. 1000 μL'lik bir pipet kullanın, ancak son derece yapışkan gliserolün uygun pipetlenmesini sağlamak için pipet ucunun ilk 0,5 cm'ini kesin. Bir diseksiyon mikroskop ( Şekil 3b ) altında koyu bir arka plan üzerine bir 22 x 50 mm lamel yerleştirin.
3. Kaplama kağıdına bir damla% 100 gliserol ekleyin ( Şekil 3b ). Cilt dilimini mikrosantrifüj tüpünden gliserol damla üzerine aktarın. Düzeltici mikroskopu kullanın ve kıvrılmış olan cilt dilimlerini özenle çözmek için forsepsleri işaretleyin.
   NOT: Dilim glifte yüzerkenSerum damlacıklarında dokunun doğal görünümünü normal şekline geri döndürerek dengelenebilir. Dilimin doğal olmayan düzleştirmesini zorlamayın çünkü bu dokuya zarar verebilir.
4. Deri bölümünün tüm uzunluğu kapak kayma düzeneğine uygun şekilde yönlendirilip düzleştirildiğinde dokuyu monte edin; Düzenli bir mikroskop slayt kullanın. Bu adım cilt dilimini daha da düzleştirir.
   NOT: Hava sızıntısından kaçının ( Şekil 3c ).
5. Önümüzdeki iki gün içinde gliserole monte cilt bölgelerindeki görüntüsünü alın.
   NOT: Uzun süreli saklama doku ve görüntüleme kalitesini olumsuz etkileyecektir. Bu örnekte, tüm görüntüler 20x'lik bir objektif kullanılarak dik bir konfokal mikroskop kullanılarak elde edildi.

Sonuçlar

Tekniğimizin avantajlarını vurgulamak için, kalın, 3D doku kesit tekniğini "yatay tüm montaj", klasik dondurulmuş kesitlerle karşılaştırdık. Klasik dondurulmuş kesitler daha önce tarif edildiği gibi kesildi ⁵ . Te mikroskobik görüntüleri epidermis için görsel bir yapı temin etmek için, temel bazal membran ⁶ epidermal hücreleri bağlayan bir bileşeni olan alfa-6 (Itga6), integrin immunohistokimyasal. Ayrıca piloerection (ayrıca "goosebumps" olarak da bilinir) sorumlu arrector pili kas (APM), integrin alfa-8 ⁷ ile etiketlendi. Klasik dondurulmuş kesitlerde, Itga6 ile görülen çoğu saç follikülü, tüm uzunluk boyunca kesitlendirilmedi ve kesit başına tam olarak eksik kıl follikülleri üretildi ( Şekil 4a- 4d) ). Kalın doku kesitleri, geleneksel 10 um kesitlere kıyasla daha Z-yığın katmanları elde etmeyi mümkün kılar ve daha eksiksiz bir 3D görüntüsünü sağlar. Bu, saç follikülleri ve üzerinde bulunan bazal membran ile bağlantılı olan APM'lerin bütünlüğünü incelerken daha belirgindir. Klasik kriyoteksiyonlarda APM'lerin büyük kısmı kesir ( Şekil 4a- 4d ). Ek olarak, hipodermal bölmenin doku bütünlüğü, dondurma bölmeleri, iyi bilinen bir dondurarak eriten eser olan ılık cam slaytlara tutturulduğunda adipositlerin tahrip edilmesine kıyasla yatay tüm montajlarda korunur ( Şekil 4a -b , hipodermal Bölgeler) ⁸ .

Şekil 4. Yatay bütün mouNt, klasik bir kriyoseksiyonla karşılaştırılmıştır.
( A ) Klasik olarak elde edilen 10 μm kalınlığındaki deri cryosections ve ( b ) 100 μm kalınlıkta 3D doku kesitleri, epidermal bölmeyi ve arrektör pili kaslarını görselleştirmek için integrin alfa-6 (Itga6) ve integrin alfa-8 (Itga8) ile etiketlendi , sırasıyla. Kalın doku kesitlerinin görüntüleri büyük bir Z istifinin maksimum projeksiyonları olarak gösterilir. Beyaz çerçeveler, ( c ) klasik ve ( d ) yatay tüm montaj bölümlerinde görüntülenen, büyütülen alanları göstermektedir. ( E ) Sağlam kıl follikülleri ve ( f ) bozulmamış arrector pilori kasları hem klasik hem de yatay tüm montaj bölümlerinde nicelendirildi. Ölçek çubukları 100 μm'yu gösterir. Veriler, Ortalama ± Ortalama Ortalama Hata Ortalaması (SEM) olarak gösterilir. Biyolojik çoğaltım başına bir bölüm ( n = 3) nicelendirildi. Eşlenmemiş t-testi * P <0.05, *** P <0.0005. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Here, we present the "horizontal whole mount" technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))⁹ are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies ^2,10.

Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 µm used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure^2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines¹⁴. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS			homemade
Gelatin, from cold water fish skin	Sigma	G7765	250ML
Glycerol	BDH Laboratory Supplies	444482V
O.C.T. compound	VWR chemicals	361603E
Peel-A-Way embedding molds	Sigma	E6032-1CS	Square S-22
Non-Fat Powdered Milk	Bio Basic Inc.	NB0669
Triton X-100	Sigma	T9284	500ML
4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)	Invitrogen	D3571
FITC Rat Anti-Human CD49f	BD Pharmingen	555735
Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody	R&D Systems	AF4076
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG	Life Technologies	A21208
Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG	Life Technologies	A21432
CryoStar NX70	Thermo Fisher Scientific
100mm Culture dishes
Disposable scalpels	Swann-Morton	Ref 0501
pointed metal forceps
1.5 ml microcentrifuge tubes	VWR	211-2130
12 Well plates	Sigma	CLS3513
Dissecting microscope	Nikon
20 ul and 1000 ul Pipette	Gilson
1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile)	Star Lab	S1122-1830
20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile)	Star Lab	S1120-1810
Rocking shaker plate
Microscope slides, menzel Glaeser	Thermos Scientific	631-9483	Superfrost Plus
Cover Glasses, Menzel Glaeser	Thermos Scientific	MENZBB024060AB	24 x 60 mm
Confocal microscope	Nikon