Horizontale Ganze Mount: Ein neuartiges Verarbeitungs- und Imaging-Protokoll für dickes, dreidimensionales Gewebequerschnitt der Haut

Zusammenfassung

Diese Arbeit stellt ein neuartiges Verarbeitungs- und Abbildungsprotokoll für eine dicke, dreidimensionale Gewebequerschnittsanalyse dar, die die vollständige Ausnutzung konfokaler Bildgebungsmodalitäten ermöglicht. Dieses Protokoll bewahrt die Antigenität und stellt ein robustes System zur Analyse der Hauthistologie und potenziell anderer Gewebetypen dar.

Zusammenfassung

Die Verarbeitung eines Gewebes von Interesse, um ein mikroskopisches Bild zu erzeugen, das ein wissenschaftliches Argument unterstützt, kann eine Herausforderung sein. Der Erwerb qualitativ hochwertiger mikroskopischer Bilder hängt nicht ganz von der Qualität des Mikroskops ab, sondern auch von den Methoden der Gewebeverarbeitung, die oftmals mehrere kritische Handlungen oder Schritte beinhalten. Darüber hinaus stellen mesenchymale Zelltypen in der Haut und anderen Geweben eine neue Herausforderung für die Gewebepräparation und die Bildgebung dar. Hier präsentieren wir einen kompletten Prozess von der Gewebeernte bis zur Mikroskopie. Unsere Technik, die so genannte "horizontale Vollmontage", ist eine, die Anfänger schnell beherrschen können und die Antigenkonservierung und -detektion in 60-300 μm-dicken Abschnitten mit einem Kryostaten abschneiden lassen. Abschnitte dieser Dicke bieten eine verbesserte Visualisierung der Gewebe-Mikroarchitektur in einer dreidimensionalen Umgebung. Darüber hinaus bewahrt das Protokoll mesenchymale Zellen in einer Weise, die die Bildqualität erhöht, wennVerglichen mit Standard-Kryostaten oder Paraffin-Abschnitten, wodurch die Wirksamkeit und Zuverlässigkeit der Immunfärbung erhöht wird. Wir glauben, dass dieses Protokoll allen Laboratorien zugute kommen wird, die die Haut und möglicherweise andere Gewebe und Organe visualisieren.

Einleitung

Die revolution von mikroskopischen Bildgebungsgeräten sorgt für anspruchsvolle, hochauflösende Bildgebungsinstrumente. Bei der Erfassung eines mikroskopischen Bildes eines kompletten dreidimensionalen (3D) Gewebequerschnitts stellt das Probenpräparat jedoch erhebliche Herausforderungen dar und kann der begrenzende Faktor bei der Definition der Bildqualität sein. Jeder einzelne Schritt verdient eine sorgfältige Betrachtung, um die Gewebemorphologie und die Antigenität von Zielproteinen zu bewahren, um verarbeitungsbedingte Artefakte zu minimieren und die endgültige Bildqualität zu maximieren. Zum Beispiel erfordert die traditionelle Hautanalyse ein Bild mit Blick auf die Epidermis und Dermis, mit Haarfollikeln, die richtig orientiert sind und die anatomische Analyse der Stammzellkompartimentbeiträge zur Hauthomöostase ^{1 , 2 ermöglichen} . Dies erfordert eine gründliche Konzentration, wie die Haut eingebettet und geschnitten ist. Wichtig, Haarfollikel können dicker seinAls 100 μm, was die Standard-Paraffin- oder gefrorene Schnittdicke stark übersteigt, was zu einem niedrigeren Analysengrad im Vergleich zu ganzen Montierungen oder dicken Querschnitten ^{3 , 4 , 5 führt} .

Zusammengenommen ist jeder Schritt der Probenvorbereitung für die mikroskopische Analyse eine kritische Determinante, die die Bildanalyse beeinflussen wird. Hier wird ein neuartiges Verarbeitungsprotokoll für eine dicke 3D-Gewebequerschnittsanalyse vorgestellt, die wir als "horizontale Vollmontage" bezeichnen. Das Protokoll bewahrt die Antigenität hoch und ermöglicht die volle Ausnutzung von dicken Abschnitten der Haut durch die Verwendung von konfokalen bildgebenden Geräten. Dies ist ein vollständiger Leitfaden zur Verwendung von Haut für die Verarbeitung und Bildgebung von Gewebequerschnitten, einschließlich Gewebeernte und Paraformaldehyd (PFA) -assistierte Kryokonservierung (Schritt 1), die Erzeugung von 100 μm dicken Gewebequerschnitten mit einem Kryostat (Schritt 2) Und immunfluoreszierende Markierung und Montage (Schritte 3 und 4). Die repräsentativen Ergebnisse vergleichen konfokale Bilder von zwei verschiedenen histologischen Präparationstechniken - klassische Kryosektionierung und dickes 3D-Gewebequerschnitt - Hervorhebung der Vorteile von "horizontalen Gesamtbefestigungen" für den potentiellen Benutzer dieses Protokolls.

Protokoll

Alle Tierversuche unterlagen einer örtlichen ethischen Zustimmung und wurden unter den Bedingungen einer britischen Regierung Home Office Lizenz durchgeführt.

1. Hauternte und Kryokonservierung

1. Vorbereitungen
   1. Bereiten Sie eine 100-mm-Kulturschale mit 25 ml 4% PFA und zwei 100-mm-Kulturschalen mit 25 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vor.
   2. Füllen Sie rechteckige abziehbare Kryomaten um zwei Drittel mit optimaler Schnitttemperatur-Verbindung (OCT).
   3. Legen Sie eine Metallplatte, auf der die Kryoblöcke in einem späteren Schritt platziert werden können, in die -80 ° C Gefrierschrank.
2. Hauternte, Fixierung und Kryokonservierung.
   1. Clip die dorsale Region der Tier-Leiche mit einem trockenen elektrischen Rasierer.
      ANMERKUNG: In diesem Beispiel wurden postnatale Tag 21 Wildtyp-Mäuse verwendet.
   2. Ernten Sie die interessanten Bereiche auf der Haut.
      HINWEIS: Die dorsomediale Region der Maushaut ( Abbildung 1a) enthält den höchsten Prozentsatz der Haarfollikel, die gleichmäßig beabstandet und ausgerichtet sind, was eine optimale Ausrichtung für das Schneiden ermöglicht. Die Entfernung des zugrunde liegenden nicht-dermalen Gewebes ist nicht erforderlich, kann aber bei Bedarf durchgeführt werden.
   3. Schneiden Sie die geerntete Haut in rechteckige Stücke von passender Größe, um in den Boden der Kryomold passen, wobei das Richtungswachstum der Haarfollikel Getreide zu berücksichtigen.
      HINWEIS: Kleinere Hautscheiben sind für Anfänger einfacher zu handhaben, da sie sich während der Inkubations- und Montageprozesse weniger verwickeln. Das hier gezeigte Beispiel ist ein ~ 1 cm ² Bereich der dorsalen Haut, der in eine 22 x 30 x 20 mm Kryomold passt ( Abbildung 2a ).
   4. Fixieren Sie die Haut bei Raumtemperatur in 25 ml 4% PFA für 10-30 min, abhängig von der Dicke der Hautproben ( Abbildung 1b ).
   5. Die Hautproben zweimal in 25 ml PBS waschenFür mindestens 5 min ( Abbildung 1b ).
   6. Tauchen Sie die Hautproben auf ein Papiertuch, um das Gewebe von überschüssigem PBS sorgfältig abzulassen, was zu einer Kristallisation während des Gefrierprozesses führen kann und die Ergebnisse der Kryosektion beeinflussen kann.
      HINWEIS: Ein Standard-Saccharose-Gradient ist nicht erforderlich. Dies kann aber auch nach eigenem Ermessen in das Protokoll aufgenommen werden.
   7. Achten Sie auf die Orientierung der Haarfollikel für jede Hautprobe. Verwenden Sie ein Seziermikroskop für visuelle Hilfe (vor allem jemand, der das Protokoll zum ersten Mal durchführt). Setzen Sie die Hautprobe in die OCT-gefüllte Kryomille ein und entbinden Sie alle Bereiche der Haut mit OCT, indem Sie Luftblasen entfernen, die an der Oberfläche des abgeschnittenen Haares mit einer Pinzette befestigt sind ( Abb. 2a und 2b ).
   8. Schieben Sie die Haut auf den Boden des OCT gefüllten Blocks, so dass es bündig mit dem Boden liegt.
      HINWEIS: Die Haut kann in jede Richtung ausgerichtet werdenS lang wie das Korn der Haarfollikel für richtige Schneidverfahren bekannt ist. Die Kryomillen werden neu ausgerichtet, wenn die Blöcke an den Kryostaten zum Kryoschweißen angeschlossen sind. Markiere die Haarfollikelorientierung auf der Kryomold, da dieser Schritt die nachfolgende Orientierung des Kryostatschnittes bestimmt.
   9. Übertragen Sie die Kryoblöcke auf die Metallplatte in der Gefrierschrank -80 ° C, um das Schwimmen und die Verlagerung des Gewebes zu vermeiden.
   10. Überwachen Sie den Einfrierprozess, um die Ausrichtung der Haut an der Unterseite der Kryomold aufrechtzuerhalten, da unsichtbare Luftblasen dazu führen können, dass die Haut auf die Oberfläche der Kryomille aufsteigt.
       HINWEIS: Kryomaten mit gefrorenem Gewebe können für mehr als ein Jahr bei -80 ° C gelagert werden und können für weitere Abschnitte wiederverwendet werden.

Abbildung 1. Ernte und Fixierung der Maushaut.
( A ) Das Hautgewebe wurde aus der dorsomedialen Region des Tierkadaveres geerntet. Haarfollikel in diesem Bereich sind gleichmäßig beabstandet und ausgerichtet und erlauben somit eine optimale Orientierung während des Schnittes, wie durch die Pfeile angedeutet. ( B ) Nach dem Schneiden von Quadraten einer geeigneten Grße, die in die Kryomille passt, wurde das Hautgewebe für 15 min in 4% PFA fixiert und zweimal in PBS für jeweils 5 min gewaschen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Dickes Gewebe Querschnitt

1. Vorbereitung und Gewebeorientierung auf den Kryostaten aufzubauen.
   1. Bereiten Sie eine 100-mm-Kulturschale mit 15 ml PBS vor. Legen Sie es auf einen leicht zugänglichen Bereich auf dem Kryostat. Zusätzlich wird eine 12-Well-Platte mit 2,5 ml PBS pro Well hergestellt; Etikett nach den Proben für die Langzeitlagerung der SeBei 4 ° C. Verwenden Sie Pinzette, um die Abschnitte zu behandeln.
   2. Stellen Sie die Temperatur des Kryostaten auf -20 ° C ein.
      HINWEIS: Die Temperatur kann den Schnitt beeinflussen, aber eine gute Anleitung ist bei -20 ° C zu starten.
   3. Um Abschnitte zu erhalten, die etwa zwei Haarfollikel dick sind, stellen Sie den Kryostaten so ein, dass er 150 μm dick ist.
      HINWEIS: Die Dicke des Abschnitts kann je nach Bedarf des Benutzers und den Einschränkungen des Mikroskops variiert werden, die für die Analyse verwendet werden.
      HINWEIS: Die Orientierung der Probe ist entscheidend für die Erzielung von Hautabschnitten mit Haarfollikeln in der entsprechenden Orientierung. Dies wird durch eine ordnungsgemäße Montage am Kryostatblock erreicht. Vergewissern Sie sich, dass die Schnittebene parallel zur Haarfollikelausrichtung ist ( Abbildung 2c ). Wie bereits erwähnt, ist die korrekte Ausrichtung der Sektionsebene in der Hautprobe ein entscheidender Schritt zur Bestimmung der Qualität der Bilder, die in der Haut aufgenommen werdenEinen späteren Schritt

Abbildung 2. Einbettung, Kryokonservierung und Schnitt.
( A ) Die Markierung der Haarfollikel (HF) Richtung auf der Kryomold, die durch die schwarzen Pfeile angedeutet ist, ist für die richtige Orientierung während der Kryoschaltung wichtig. ( B ) Die Schnittebene muss mit der Haarfollikelorientierung ausgerichtet werden, um Abschnitte zu erzeugen, in denen die gesamte Länge der Haarfollikel intakt bleibt. ( C ) Abschnitte wurden pro Haarfollikelorientierung geschnitten, die durch die schwarzen Pfeile auf der Kryomold ( D ) Die dicken Gewebequerschnitte wurden mit Metallzangen gesammelt und ( e ) in eine 100 mm Kulturschale mit 1x PBS überführt. ( F ) Bei Raumtemperatur löst sich der PBS den OC ab.T. Die die dicken Gewebequerschnitte umgibt, wie durch die weißen Pfeile angedeutet. Die Abschnitte schweben dann frei im PBS. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Kryoschweißen
   1. Schneide einen Abschnitt mit dem Kryostaten. Verwenden Sie Pinzette, um den OCT zu sammeln, der das eingebettete Stück der Haut enthält ( Abbildung 2d ).
      HINWEIS: Verwenden Sie einen Kryostaten, der eine unabhängige Bewegung und Einstellung entlang der X-, Y- und Z-Achsen ermöglicht, um eine optimale Probenpositionierung zu ermöglichen. Dies ermöglicht die Erzeugung von optimal ausgerichteten Gewebequerschnitten.
   2. Übertragen Sie den Abschnitt aus dem Kryostat in die 100 mm Kulturschale, die mit PBS gefüllt ist, und fahren Sie mit der nächsten Scheibe fort. Sammeln Sie die Proben nicht auf einer Folie ( Abbildung 2e ).
      HINWEIS: Bei Raumtemperatur löst sich der PBS abDie OCT, verlassen Hautscheiben, die einfach zu handhaben mit Pinzette ( Abbildung 2f ).
      HINWEIS: Frische PBS kann in der 100 mm Kulturschale nach dem Auflösen vieler Gewebeabschnitte von 100 μm Dicke benötigt werden und kann entsprechend geändert werden.
   3. Verwenden Sie Pinzette, um die schwimmenden Hautabschnitte auf die korrekt markierte Vertiefung in einer 12-Well-Platte zu übertragen, die mit 2,5 ml PBS gefüllt ist ( Abbildung 3a , links).
      HINWEIS: Bei 4 ° C können die Proben für mindestens zwei Tage gelagert werden. Zur Langzeitlagerung von hauthaltigen OCT-Blöcken nach dem Schneiden die Schneidfläche mit einem Tropfen frischen OCT abdichten. Nach dem Einfrieren des OCT-Tröpfchens den gebrauchten OCT-Block in Parafilm einwickeln und in den Gefrierschrank von -80 ° C zurücklegen .

3. Immunfluoreszente Kennzeichnung.

1. Bereiten Sie den PB-Puffer (PBS, ergänzt mit 0,5% Magermilchpulver, 0,25% Fischhautgelatine und 0,5% Triton X-100) bei leas vorT 2 h im voraus, wie zuvor beschrieben ⁵ .
   HINWEIS: Natriumazid kann dem PB-Puffer zur Antikörper-Konservierung für die wiederholte Verwendung des Färbepuffers zugesetzt werden.
2. Etikettieren Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 500 μl PB-Puffer pro Röhrchen hinzu. Verwenden Sie vorsichtig Pinzetten, um die Hautscheiben aus dem PBS in separate Röhrchen zu bringen, die den PB-Puffer zum Blockieren enthalten ( Abbildung 3a , rechts). Stellen Sie sicher, dass alle Hautscheiben vollständig untergetaucht sind. Legen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Geschwindigkeit von nicht mehr als 10 Oszillationen pro Minute auf eine Wippe, die die Gewebeintegrität nicht stören sollte, für 1 h bei Raumtemperatur.
   HINWEIS: Es ist entscheidend, dass die Geschwindigkeit nicht mehr als 10 Schwingungen pro Minute auf der Wippe übersteigt, da es zu Verwicklungen führen wird.
   1. Während es möglich ist, mehr als eine Scheibe pro Mikrozentrifugenröhrchen hinzuzufügen, um Antikörper zu sparen, legen Sie nur eine Scheibe pro Röhrchen. Um den Antikörperverbrauch zu verringern, verwenden Sie ein VolumeVon 250 & mgr; l
      HINWEIS: Falls erforderlich, ersetzen Sie Mikrozentrifugenröhrchen mit z. B. 96-Well-Platten. Die Platzierung der dicken Gewebequerschnitte in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ermöglicht jedoch die effektivste Antikörperpenetration in das Gewebe aufgrund der erhöhten Flüssigkeitsstörung.
3. Etikettieren Sie 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für jede Hautscheibe und fügen Sie 500 μl PB-Puffer und die entsprechende Menge an primärem Antikörper hinzu. Nach 1 h Blockierung die Hautscheiben in die frisch zubereiteten Röhrchen überführen, die die Antikörper enthalten. Die Scheiben bei 4 ° C über Nacht inkubieren.
   HINWEIS: In diesem Beispiel wurden die folgenden primären Antikörper verwendet: FITC-Ratten-Anti-Human-CD49f bei einer Konzentration von 1:50 und Ziegen-anti-Maus / Rattenintegrin alpha 8 bei einer Konzentration von 1: 100.
4. Am nächsten Tag werden zwei getrennte 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen hergestellt, die 500 μl PBS pro Probe enthalten. Die Hautscheiben zweimal für 1 h bei Raumtemperatur waschenE.
5. Bereiten Sie getrennte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor, die 500 μl PB-Puffer mit der entsprechenden Konzentration an anwendbaren sekundären Antikörpern und 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthalten.
   ANMERKUNG: Die in diesem Beispiel verwendeten sekundären Antikörper sind Alexa Fluor 488 Esel Anti-Ratten-IgG und Alexa Fluor 555 Esel Anti-Ziegen-IgG in einer Konzentration von 1: 500. DAPI wurde in einer Konzentration von 1: 100 verwendet.
6. Sorgfältig die Hautproben in den PB-Puffer überführen, der den sekundären Antikörper und DAPI enthält und die Hautscheiben bei Raumtemperatur für 1 h bei niedriger Geschwindigkeit auf einem Rotator oder Schüttler inkubieren.
7. Die Scheiben bei 4 ° C im PB-Puffer, der den sekundären Antikörper und DAPI enthält, für bis zu vier Tage aufbewahren und eventuell länger, wenn Natriumazid dem PBS zugesetzt wird.

Abbildung 3. ImmunfluoreszenzEtikettierung und Montage.
( A ) Die schwimmenden Gewebequerschnitte können in 12-Well-Platten für mindestens zwei Tage bei 4 ° C gelagert werden. Vor der Immunfluoreszenz-Markierung (IF) können die interessierenden Gewebequerschnitte in 1,5 mL-Mikrozentrifugenröhrchen, die PB-Puffer zum Blockieren enthalten, übertragen, wie durch Pfeil 1 angedeutet. Für die IF-Markierung haften Sie an dem in Schritt 3 ausgearbeiteten mehrstufigen Verfahren Teil von Schritt 3 erfordert die sorgfältige Übertragung der Gewebequerschnitte in frisch präparierte Mikrozentrifugenröhrchen, die primäre Antikörperlösung, sekundäre Antikörperlösung oder Waschpuffer enthalten, was durch Pfeil 2 angedeutet ist. ( B ) Nach der IF-Markierung wird die Gewebe- Abschnitte werden in einem Tröpfchen von Glycerin unter Verwendung eines Sektionsmikroskops aufgehoben und abgeflacht. ( C ) Sobald der Gewebequerschnitt vollständig auf den Boden eines Deckglases abgeflacht ist, wird ein regelmäßiger Mikroskop-Objektträger zur Befestigung des Abschnitts verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Montage für mikroskopische Visualisierung

1. Vor der Bildgebung werden die Hautscheiben auf getrennte Mikrozentrifugenröhrchen übertragen, die 500 μl PBS enthalten, um die sekundären Antikörper und DAPI zu waschen.
2. Verwenden Sie eine 1000 μl Pipette, aber schneiden Sie die ersten 0,5 cm der Pipettenspitze ab, um das richtige Pipettieren des hochviskosen Glycerins zu ermöglichen. Legen Sie ein 22 x 50 mm Deckglas auf einen dunklen Hintergrund unter einem Sektionsmikroskop ( Abbildung 3b ).
3. Füge ein Tröpfchen von 100% Glycerin auf den Deckzettel hinzu ( Abbildung 3b ). Übertragen Sie die Hautscheibe aus dem Mikrozentrifugenröhrchen auf das Glycerintröpfchen. Verwenden Sie das Seziermikroskop und spitzen Pinzette, um sorgfältig die Haut Scheiben, die zusammengerollt sind, abwickeln.
   HINWEIS: Als die Scheibe im Gly schwimmtCerol Tröpfchen, kann es entwirrt werden, indem die natürliche Neigung des Gewebes, um seine normale Form zurückzukehren. Die unnatürliche Begradigung der Scheibe nicht zwingen, da dies das Gewebe beschädigen könnte.
4. Montieren Sie das Gewebe, sobald die gesamte Länge des Hautabschnitts richtig ausgerichtet und auf dem Deckel abgeflacht ist; Verwenden Sie eine regelmäßige Mikroskop-Folie. Dieser Schritt wird die Hautscheibe weiter begradigen.
   HINWEIS: Vermeiden Sie Lufteinschlüsse ( Abbildung 3c ).
5. Bild die in Glycerin-montierten Hautabschnitte innerhalb der nächsten zwei Tage.
   HINWEIS: Eine längere Lagerung wird die Gewebe- und Abbildungsqualität negativ beeinflussen. In diesem Beispiel wurden alle Bilder mit einem aufrechten konfokalen Mikroskop unter Verwendung eines 20x Objektivs erworben.

Ergebnisse

Um die Vorteile unserer Technik zu unterstreichen, verglichen wir unsere dicke 3D-Gewebe-Querschnittstechnik, "horizontale Ganzmontage", zu klassischen gefrorenen Abschnitten. Klassische gefrorene Schnitte wurden geschnitten , wie zuvor ⁵ beschrieben. Um eine visuelle Struktur für die Epidermis in mikroskopischen Bildern zu schaffen, immunostained für Integrin alpha-6 (Itga6), die eine Komponente ist, die epidermale Zellen an die darunterliegende Basalmembran ⁶ verankert. Wir haben auch den arrector pili muscle (APM) bezeichnet, der für die Piloerektion verantwortlich ist (auch bekannt als "goosebumps"), mit integrin alpha-8 ⁷ . In den klassischen, gefrorenen Abschnitten wurden die meisten Haarfollikel, die mit Itga6 visualisiert wurden, nicht über die gesamte Länge geschnitten und erzeugten überwiegend unvollständige Haarfollikel pro Sektion, verglichen mit horizontalen ganzen Montierungen ( Abbildung 4a -4d ). Durch dicke Gewebequerschnitte können im Vergleich zu herkömmlichen 10-μm-Abschnitten mehr Z-Stack-Schichten gewonnen werden, was ein vollständigeres 3D-Bild ermöglicht. Dies wird noch deutlicher, wenn man die Integrität von APMs studiert, die mit den Haarfollikeln und der darüber liegenden Basalmembran assoziiert sind. In klassischen Kryosierungen wurde der große Teil der APMs fraktioniert ( Abbildung 4a -4d ). Zusätzlich wird die Gewebeintegrität des hypodermalen Kompartiments in horizontalen Gesamtbehältern bewahrt, verglichen mit der Zerstörung von Adipozyten, wenn Kryoschen an warme Glasscheiben angebracht sind, was ein wohlbekanntes Gefrier-Auftauen-Artefakt ist ( Abbildung 4a -b , vergleiche hypodermale Regionen) ⁸ .

Abbildung 4. Horizontale ganze mouIm Vergleich zu einer klassischen Kryosektion.
( A ) Klassisch erhaltene Hautkryosäuren 10 μm dick und ( b ) 100 μm dicke 3D-Gewebequerschnitte wurden mit Integrin alpha-6 (Itga6) und Integrin alpha-8 (Itga8) markiert, um die epidermalen Kompartiment- und Arrektor-Pili-Muskeln zu visualisieren , beziehungsweise. Die Bilder der dicken Gewebequerschnitte sind als maximale Projektionen eines großen Z-Stapels dargestellt. Die weißen Rahmen zeigen die vergrößerten Bereiche an, die in ( c ) den klassischen und ( d ) horizontalen Vollmontageabschnitten angezeigt werden. ( E ) Intakte Haarfollikel und ( f ) intakte Arrektor-Pili-Muskeln wurden sowohl im klassischen als auch im horizontalen Ganzteil-Abschnitt quantifiziert. Maßstäbe zeigen 100 μm an. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM) dargestellt. Ein Abschnitt pro biologischer Replikat ( n = 3) wurde quantifiziert. Ungepaartes t-Test * P <0,05, P & lt; 0,0005. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Here, we present the "horizontal whole mount" technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))⁹ are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies ^2,10.

Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 µm used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure^2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines¹⁴. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS			homemade
Gelatin, from cold water fish skin	Sigma	G7765	250ML
Glycerol	BDH Laboratory Supplies	444482V
O.C.T. compound	VWR chemicals	361603E
Peel-A-Way embedding molds	Sigma	E6032-1CS	Square S-22
Non-Fat Powdered Milk	Bio Basic Inc.	NB0669
Triton X-100	Sigma	T9284	500ML
4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)	Invitrogen	D3571
FITC Rat Anti-Human CD49f	BD Pharmingen	555735
Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody	R&D Systems	AF4076
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG	Life Technologies	A21208
Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG	Life Technologies	A21432
CryoStar NX70	Thermo Fisher Scientific
100mm Culture dishes
Disposable scalpels	Swann-Morton	Ref 0501
pointed metal forceps
1.5 ml microcentrifuge tubes	VWR	211-2130
12 Well plates	Sigma	CLS3513
Dissecting microscope	Nikon
20 ul and 1000 ul Pipette	Gilson
1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile)	Star Lab	S1122-1830
20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile)	Star Lab	S1120-1810
Rocking shaker plate
Microscope slides, menzel Glaeser	Thermos Scientific	631-9483	Superfrost Plus
Cover Glasses, Menzel Glaeser	Thermos Scientific	MENZBB024060AB	24 x 60 mm
Confocal microscope	Nikon