Horizontal Whole Mount: un protocole de traitement et d'imagerie géniaux pour les sections transversales épaisses en tissu tridimensionnel

Résumé

Ce travail présente un nouveau protocole de traitement et d'imagerie pour une analyse transversale en tissu tridimensionnelle épaisse qui permet l'exploitation complète des modalités d'imagerie confocal. Ce protocole préserve l'antigénicité et représente un système robuste pour analyser l'histologie de la peau et potentiellement d'autres types de tissus.

Résumé

Traiter un tissu d'intérêt pour générer une image microscopique qui soutient un argument scientifique peut être difficile. L'acquisition d'images microscopiques de haute qualité ne dépend pas entièrement de la qualité du microscope, mais aussi des méthodes de traitement des tissus, qui impliquent souvent de multiples actions ou étapes critiques. En outre, les types de cellules mésenchymateuses dans la peau et d'autres tissus représentent un nouveau défi pour la préparation et l'imagerie des tissus. Ici, nous présentons un processus complet, de la récolte des tissus à la microscopie. Notre technique, appelée «montage horizontal entier», est celle dont les novices peuvent rapidement devenir compétents et qui permettent la préservation et la détection des antigènes dans des sections de 60 à 300 μm d'épaisseur coupées avec un cryostat. Les sections de cette épaisseur fournissent une visualisation améliorée de la microarchitecture tissulaire dans un environnement tridimensionnel. En outre, le protocole préserve les cellules mésenchymateuses d'une manière qui améliore la qualité de l'image lorsquePar rapport aux sections de cryostat ou de paraffine standard, augmentant ainsi l'efficacité et la fiabilité de l'immunocoloration. Nous croyons que ce protocole profitera à tous les laboratoires qui visualisent la peau et éventuellement d'autres tissus et organes.

Introduction

La révolution de l'équipement d'imagerie microscopique fournit des instruments d'imagerie sophistiqués et à haute résolution. Cependant, lors de l'acquisition d'une image microscopique d'une section transversale en tissu tridimensionnelle complète (3D), la préparation des échantillons présente des défis considérables et peut être le facteur limitant de la définition de la qualité de l'image. Chaque étape distincte mérite une attention particulière afin de préserver la morphologie des tissus et l'antigenité des protéines cibles, de minimiser les artefacts induits par le traitement et de maximiser la qualité de l'image finale. Par exemple, l'analyse traditionnelle de la peau nécessite une image avec une vue de l'épiderme et du derme, avec des follicules capillaires correctement orientés, permettant l'analyse anatomique des contributions des cellules souches à l'homéostasie de la peau ^{1 , 2} . Cela nécessite une concentration approfondie sur la façon dont la peau est intégrée et sectionnée. Fait important, les follicules capillaires peuvent être plus épaisQue 100 μm, ce qui surpasse largement l'épaisseur standard de la paraffine ou de la section congelée, ce qui se traduit par un niveau d'analyse inférieur par rapport aux supports entiers ou aux sections transversales épaisses ^{3 , 4 , 5} .

Ensemble, chaque étape de la préparation des échantillons pour l'analyse microscopique est un facteur déterminant qui affectera l'analyse d'image. Ici, un nouveau protocole de traitement pour l'épaisseur, l'analyse de la section transversale du tissu 3D, que nous appelons "montage horizontal entier", est présentée. Le protocole préserve hautement l'antigénicité et permet l'exploitation complète de couches épaisses de la peau en utilisant un équipement d'imagerie confocal standard. Il s'agit d'un guide complet pour l'utilisation de la peau pour un traitement et une image en coupe transversale des tissus épais, y compris la récolte de récolte de tissus et de paraformaldéhyde (PFA) (étape 1), la génération de sections de tissu de 100 μm d'épaisseur avec un cryostat (étape 2), Et l'étiquetage et le montage immunofluorescent (étapes 3 et 4). Les résultats représentatifs comparent les images confocales de deux techniques distinctes de préparation histologique: la cryosection classique et l'épaisseur, la coupe transversale de tissu 3D, mettant en évidence les avantages des «montures horizontales entières» pour l'utilisateur potentiel de ce protocole.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont fait l'objet d'une approbation éthique locale et ont été exécutées selon les termes d'une licence de gouvernement du gouvernement du Royaume-Uni.

1. Récolte de la peau et cryoconservation

1. Les préparatifs.
   1. Préparez un plat de culture de 100 mm avec 25 ml de PFA à 4% et deux plats de culture de 100 mm avec 25 ml de 1x solution salée tamponnée au phosphate (PBS).
   2. Remplir les cryomolds rectangulaires épluchés par deux tiers avec un composé de température de coupe optimal (OCT).
   3. Placez une plaque métallique, sur laquelle les cryoblocs peuvent être placés dans une étape ultérieure, dans le congélateur -80 ° C.
2. Récolte de la peau, fixation et cryoconservation.
   1. Accrochez la région dorsale du cadavre d'animal avec un rasoir électrique sec.
      NOTE: Dans cet exemple, on utilisait des souris de type sauvage du jour 21 postnatal.
   2. Récolte les zones d'intérêt sur la peau.
      NOTE: La région dorsomedial de la peau de souris ( Figure 1a) contient le pourcentage le plus élevé de follicules capillaires espacés et alignés, ce qui permet une orientation optimale pour la section. L'élimination du tissu non cutané sous-jacent n'est pas nécessaire mais peut être effectuée si nécessaire.
   3. Coupez la peau récoltée en morceaux rectangulaires de taille appropriée pour s'adapter au fond du cryomold, en tenant compte de la croissance directionnelle du grain de follicule capillaire.
      REMARQUE: Des tranches de peau plus petites peuvent être plus faciles à manipuler pour les novices, car elles sont moins susceptibles d'être enchevêtrées pendant le processus d'incubation et de montage. L'exemple montré ici est une surface de dorsale de ~ 1 cm ² , qui s'insère dans un cryomold de 22 x 30 x 20 mm ( Figure 2a ).
   4. Réparez la peau à température ambiante dans 25 mL de PFA à 4% pendant 10 à 30 minutes, selon l'épaisseur des échantillons de peau ( Figure 1b ).
   5. Lavez les échantillons de peau deux fois dans 25 ml de PBSPendant au moins 5 min chacun ( figure 1b ).
   6. Dab les échantillons de peau sur une serviette en papier pour égoutter soigneusement le tissu d'excès de PBS, ce qui peut entraîner une cristallisation pendant le processus de congélation et peut affecter les résultats de la cryostatation.
      REMARQUE: Un gradient de saccharose standard n'est pas nécessaire. Cependant, cela peut également être incorporé dans le protocole à la discrétion de l'utilisateur.
   7. Soyez conscient de l'orientation des follicules pileux pour chaque échantillon de peau. Utilisez un microscope de dissection pour une assistance visuelle (en particulier toute personne qui effectue le protocole pour la première fois). Insérez l'échantillon de peau dans le cryomold rempli d'OCT et équilibrez toutes les zones de la peau avec OCT en éliminant les bulles d'air attachées à la surface des cheveux coupés à l'aide de pinces ( figures 2a et 2b ).
   8. Poussez la peau vers le bas du bloc rempli OCT pour qu'il soit au ras du fond.
      REMARQUE: la peau peut être orientée dans n'importe quelle direction, uneTant que le grain du follicule capillaire est noté pour les procédures de coupe appropriées. Les cryomolds seront réorientés lorsque les blocs sont attachés au cryostat pour la cryotypie. Marquez l'orientation du follicule pileux sur le cryomold, car cette étape détermine l'orientation ultérieure de la coupe du cryostat.
   9. Transférer les cryoblocs sur la plaque métallique dans le congélateur à -80 ° C pour éviter la flottation et la dislocation du tissu.
   10. Surveillez le processus de congélation pour maintenir l'orientation de la peau au fond du cryomold, car les bulles d'air non visibles peuvent provoquer l'apparition de la peau à la surface de la cellule cryogénique.
       REMARQUE: Cryomolds avec des tissus congelés peuvent être stockés pendant plus d'un an à -80 ° C et peuvent être réutilisés pour des sections supplémentaires.

Figure 1. Récolte et fixation de la peau de la souris.
(A) les tissus de la peau a été récolté dans la région dorso du cadavre animal. Les follicules capillaires dans cette région sont uniformément espacés et alignés et permettent donc une orientation optimale lors de la coupe, comme l'indiquent les flèches. ( B ) Après avoir coupé des carrés d'une taille appropriée qui s'insère dans le cryomold, le tissu cutané a été fixé dans 4% de PFA pendant 15 min et a été lavé deux fois dans du PBS pendant 5 minutes chacun. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Tissus épais en coupe transversale

1. Préparation et orientation tissulaire à monter sur le cryostat.
   1. Préparer un plat de culture de 100 mm avec 15 ml de PBS. Placez-le sur une zone facilement accessible sur le cryostat. En outre, préparer une plaque de 12 puits avec 2,5 ml de PBS par puits; Étiquette selon les échantillons pour le stockage à long terme de la seCations à 4 ° C. Utilisez des pinces pour gérer les sections.
   2. Réglez la température du cryostat à -20 ° C.
      REMARQUE: La température peut affecter la section, mais un bon guide est de commencer à -20 ° C.
   3. Pour obtenir des sections d'environ deux follicules capillaires épais, ajustez le cryostat pour couper des sections de 150 μm d'épaisseur.
      REMARQUE: l'épaisseur de la section peut varier en fonction des besoins de l'utilisateur et des limites du microscope qui seront utilisées pour l'analyse.
      REMARQUE: L'orientation de l'échantillon est essentielle pour l'obtention de sections cutanées avec des follicules capillaires dans l'orientation appropriée. Ceci est réalisé en montant correctement sur le bloc cryostat. Assurez-vous que le plan de coupe est parallèle à l'orientation du follicule pileux ( Figure 2c ). Comme mentionné précédemment, l'orientation correcte du plan de coupe dans l'échantillon de peau est une étape cruciale pour déterminer la qualité des images qui seront acquises dansUne étape ultérieure.

Figure 2. Incorporation, cryoconservation et sectionnement.
(A) Le marquage de la direction du follicule pileux (HF) sur le cryomold, indiqué par les flèches noires, est important pour une orientation appropriée pendant la cryotypie. ( B ) Le plan de section doit être aligné avec l'orientation du follicule capillaire pour générer des sections dans lesquelles la longueur totale des follicules capillaires reste intacte. ( C ) Les sections ont été coupées selon l'orientation du follicule pileux qui a été indiqué par les flèches noires sur le Cryomold. ( D ) Les sections transversales épaisses de tissu ont été collectées avec des pinces métalliques et ( e ) transférées dans un plat de culture de 100 mm contenant 1x PBS. ( F ) À température ambiante, le PBS dissout l'OC.T. Composé qui entoure les sections transversales épaisses des tissus, comme l'indiquent les flèches blanches. Les sections flottent librement dans le PBS. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Cryosection.
   1. Couper une section à l'aide du cryostat. Utilisez une pince pour collecter l'OCT qui contient la peau intégrée ( Figure 2d ).
      REMARQUE: Utilisez un cryostat qui permet un mouvement et un réglage indépendants le long des axes X, Y et Z pour un positionnement optimal de l'échantillon. Cela permet de générer des sections transversales de tissu idéalement alignées.
   2. Transférer la section du cryostat dans le plat de culture de 100 mm rempli de PBS et continuer avec la prochaine tranche. Ne pas collecter les échantillons sur une glissière ( Figure 2e ).
      NOTE: À température ambiante, le PBS se dissoudraL'OCT, en laissant des tranches de peau faciles à manipuler avec des pinces ( figure 2f ).
      REMARQUE: Un PBS frais peut être nécessaire dans le plat de culture de 100 mm après avoir dissous de nombreuses sections de tissu de 100 μm d'épaisseur et peut être changé en conséquence.
   3. Utilisez une pince pour transférer les sections de peau flottante sur le puits correctement étiqueté dans une plaque de 12 puits remplie de 2,5 ml de PBS ( Figure 3a , à gauche).
      REMARQUE: à 4 ° C, les échantillons peuvent être conservés pendant au moins deux jours. Pour le stockage à long terme des blocs OCT contenant de la peau après séchage, sceller la surface de coupe avec une gouttelette d'OCT frais. Après la congélation de la goutte OCT, enveloppez le bloc OCT utilisé dans le parafilm et remettez-le dans le congélateur -80 ° C .

3. Étiquetage immunofluorescent.

1. Préparer le tampon PB (PBS additionné de 0,5% de lait écrémé en poudre, 0,25% de gélatine pour peau de poisson et 0,5% de Triton X-100) au moinsT 2 h à l'avance, comme décrit précédemment ⁵ .
   NOTE: L'azide de sodium peut être ajouté au tampon PB pour la conservation des anticorps pour l'utilisation répétée du tampon de coloration.
2. Étiquetez les tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL et ajoutez 500 μL de tampon PB par tube. Utilisez avec précaution des pinces pour transférer les tranches de peau du PBS dans des tubes séparés contenant le tampon PB pour le blocage ( Figure 3a , à droite). Assurez-vous que toutes les tranches de peau sont complètement immergées. Placez les tubes de microcentrifugeuse sur une bascule à scie à des vitesses supérieures à 10 oscillations par minute, ce qui ne doit pas perturber l'intégrité du tissu, pendant 1 h à température ambiante.
   REMARQUE: Il est essentiel que la vitesse ne dépasse pas 10 oscillations par minute sur le basculeur à scie, puisqu'elle induira l'enchevêtrement.
   1. Bien qu'il soit possible d'ajouter plus d'une tranche par tube de microcentrifugeuse, pour économiser les anticorps, ne collez qu'une seule tranche par tube. Pour diminuer l'utilisation des anticorps, utilisez un volumeDe 250 μL.
      REMARQUE: si nécessaire, remplacer les tubes à microcentrifugation par, par exemple, des plaques à 96 puits. Cependant, le placement des sections transversales des tissus épais dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml permet la pénétration d'anticorps plus efficace dans le tissu en raison de la perturbation du liquide améliorée.
3. Étiquetez séparément des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL pour chaque tranche de peau et ajoutez 500 μL de tampon de PB et la quantité appropriée d'anticorps primaire. Après 1 heure de blocage, transférer les tranches de peau dans les tubes fraîchement préparés contenant les anticorps. Incuber les tranches à 4 ° C pendant la nuit.
   NOTE: Dans cet exemple, on a utilisé les anticorps primaires suivants: CD49f anti-humain de rat FITC à une concentration de 1: 50 et une intégrine de souris / rat anti-intégrine alpha 8 à une concentration de 1: 100.
4. Le lendemain, préparez deux tubes séparés de microcentrifugeuse de 1,5 mL contenant 500 μL de PBS par échantillon. Laver les tranches de peau deux fois pendant 1 h à température ambianteE.
5. Préparez des tubes séparés de microcentrifugeuse de 1,5 mL contenant 500 μl de tampon PB avec la concentration appropriée d'anticorps secondaires applicables et 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
   NOTE: Les anticorps secondaires utilisés dans cet exemple sont Alexa Fluor 488 IgG anti-rat et Alexa Fluor 555 IgG anti-chèvre à une concentration de 1: 500. DAPI a été utilisé à une concentration de 1: 100.
6. Transférer soigneusement les échantillons de peau dans le tampon PB, qui contient l'anticorps secondaire et le DAPI, et incuber les tranches de peau à température ambiante pendant 1 h à faible vitesse sur un rotateur ou un agitateur.
7. Conservez les tranches à 4 ° C dans le tampon PB contenant l'anticorps secondaire et le DAPI pendant jusqu'à quatre jours, et peut-être plus longtemps si l'azide de sodium est ajouté au PBS.

Figure 3. ImmunofluorescEtiquetage et montage.
(A) les sections transversales du tissu flottant peuvent être stockées dans des plaques à 12 puits pendant au moins deux jours à 4 ° C. Avant l'étiquetage immunofluorescent (IF), transférez les sections de tissus intéressantes dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL contenant un tampon PB pour le blocage, comme indiqué par la flèche 1. Pour l'étiquetage IF, respecter la procédure multi-étapes élaborée à l'étape 3. Chacun Une partie de l'étape 3 nécessite le transfert minutieux des sections transversales des tissus dans des tubes de microcentrifugation fraîchement préparés contenant une solution d'anticorps primaire, une solution d'anticorps secondaire ou un tampon de lavage, ce qui est indiqué par la flèche 2. ( b ) Après l'étiquetage IF, Les sections sont débrouillées et aplaties dans une gouttelette de glycérol, en utilisant l'aide d'un microscope à dissection. ( C ) Une fois que la section transversale du tissu est entièrement aplatie sur le fond d'un patin de recouvrement, une glissière de microscope régulière sert à monter la section. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

4. Montage pour visualisation microscopique

1. Avant l'imagerie, transférez les tranches de peau pour séparer les tubes de microcentrifugation contenant 500 μL de PBS pour éliminer les anticorps secondaires et DAPI.
2. Utilisez une pipette de 1000 μL, mais coupez les premiers 0,5 cm de la pointe de la pipette pour permettre la bonne pipetage du glycérol très visqueux. Placez une lamelle de 22 x 50 mm sur un fond sombre sous un microscope de dissection ( figure 3b ).
3. Ajouter une gouttelette de glycérone à 100% sur la feuille de recouvrement ( Figure 3b ). Transférer la tranche de peau du tube de microcentrifugeuse sur la gouttelette de glycerol. Utilisez le microscope de dissection et la pince pointue pour décoller soigneusement les tranches de peau qui sont enroulées.
   REMARQUE: lorsque la tranche flotte dans le glyGouttelette de cérile, elle peut être démêlée en favorisant la propension naturelle du tissu à revenir à sa forme normale. Ne pas forcer le redressement non naturel de la tranche, car cela pourrait endommager le tissu.
4. Montez le tissu une fois que la longueur totale de la section de la peau est correctement orientée et aplatie sur le bordereau de couverture; Utilisez une lame de microscope régulière. Cette étape va encore redresser la tranche de peau.
   REMARQUE: Évitez le piégeage d'air ( Figure 3c ).
5. Image dans les sections de peau montées au glycérol au cours des deux prochains jours.
   REMARQUE: un stockage prolongé aura une influence négative sur la qualité des tissus et de l'imagerie. Dans cet exemple, toutes les images ont été acquises avec un microscope confocal vertical en utilisant un objectif 20x.

Résultats

Pour souligner les avantages de notre technique, nous avons comparé notre épaisseuse, la section transversale de tissu 3D, le «montage horizontal entier», aux sections classiques congelées. Les sections classiques congelées ont été coupées comme décrit précédemment ⁵ . Pour fournir une structure visuelle pour l'épiderme dans les images microscopiques, nous avons été immunostained pour l'intégrine alpha-6 (Itga6), qui est un composant qui ancre les cellules épidermiques à la membrane basale sous-jacente ⁶ . Nous avons également étiqueté le muscle pili (APM), qui est responsable de la piloération (également connu sous le nom de "peau de poule"), avec l'intégrine alpha-8 ⁷ . Dans les sections classiques congelées, la plupart des follicules capillaires visualisés avec Itga6 n'ont pas été sectionnés sur toute la longueur, générant des follicules capillaires à prédominance incomplète par section, par rapport aux supports horizontaux entiers ( Figure 4a -4d ). Les sections transversales en tissu épais permettent d'acquérir plus de couches d'empilement Z par rapport aux sections classiques de 10 μm, ce qui permet une image 3D plus complète. Cela devient encore plus apparent lors de l'étude de l'intégrité des APM, qui sont associés aux follicules capillaires et à la membrane basale sus-jacente. Dans les criosections classiques, la grande partie des APM a été fractionnée ( Figure 4a -4d ). De plus, l'intégrité tissulaire du compartiment hypodermal est conservée dans des supports horizontaux entiers, par rapport à la destruction des adipocytes lorsque des criosections sont attachées à des diapositives en verre chaud, ce qui est un artefact de congélation-décongélation bien connu ( Figure 4a -b , comparer hypoderme Régions) ⁸ .

Figure 4. Mo entier horizontalNt par rapport à une cryosection classique.
(A) la peau Classiquement obtenu cryosections 10 um d' épaisseur et (b) de 100 pm d'épaisseur de tissus 3D sections transversales ont été marquées avec de visualiser le compartiment épidermique et arrecteur muscles de pili intégrine alpha-6 (ITGA6) et l' intégrine alpha-8 (Itga8) , respectivement. Les images des sections transversales épaisses de tissu sont représentées comme projections maximales d'une grande pile Z. Les cadres blancs indiquent les zones agrandies, affichées dans ( c ) les sections classiques et ( d ) horizontales de montage complet. ( E ) les follicules capillaires intacts et ( f ) les muscles pili intact ont été quantifiés dans les sections classiques et horizontales de montage intégral. Les barres d'échelle indiquent 100 μm. Les données sont représentées par la moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Une section par réplication biologique ( n = 3) a été quantifiée. T-test non apparié * P <0,05, *** P <0,0005. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Here, we present the "horizontal whole mount" technique, which has several advantages over classical frozen sections. One advantage of our technique is that it can easily be performed with standard histology equipment and a confocal microscope. Second, the tissue integrity is preserved in a superior manner when compared to standard cryosections. For example, adipocytes within the hypodermal layer (i.e., dermal white adipocytes (DWAT))⁹ are severely disrupted in standard cryosections, which makes studying tissues that are adipose-laden impossible. Our technique allows for the full analysis of the adipocytes in this layer and may be adapted to other tissues with high adipocyte contents. Furthermore, this allows for the improved detection of mesenchymal cells in lineage-tracing studies ^2,10.

Standard cryosections, by their very nature, can never reveal the true 3D aspects of a tissue through confocal microscopy. This means that thicker sections are advantageous in the analysis of skin, since hair follicles, as well as their substructures, can traverse a depth that exceeds the standard thickness of 10 µm used in classical crysosections. We are intrigued that other tissues, such as the intestine and brain, for example, possess similar challenges with regard to viewing the tissue as a 3D structure^2,7,11,12,13. Intriguingly, our technique has already been shown to be beneficial for use in certain applications in the intestines¹⁴. We believe that our horizontal whole-mount protocol has the potential be applied to any other tissue requiring 3D analysis.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS			homemade
Gelatin, from cold water fish skin	Sigma	G7765	250ML
Glycerol	BDH Laboratory Supplies	444482V
O.C.T. compound	VWR chemicals	361603E
Peel-A-Way embedding molds	Sigma	E6032-1CS	Square S-22
Non-Fat Powdered Milk	Bio Basic Inc.	NB0669
Triton X-100	Sigma	T9284	500ML
4′,6-Diamidino-2-phenylindole, dilactate (DAPI)	Invitrogen	D3571
FITC Rat Anti-Human CD49f	BD Pharmingen	555735
Mouse/Rat Integrin alpha 8 Antibody	R&D Systems	AF4076
Alexa Fluor 488 donkey anti-rat IgG	Life Technologies	A21208
Alexa Fluor 555 donkey anti-goat IgG	Life Technologies	A21432
CryoStar NX70	Thermo Fisher Scientific
100mm Culture dishes
Disposable scalpels	Swann-Morton	Ref 0501
pointed metal forceps
1.5 ml microcentrifuge tubes	VWR	211-2130
12 Well plates	Sigma	CLS3513
Dissecting microscope	Nikon
20 ul and 1000 ul Pipette	Gilson
1000µl XL Graduated TipOne Filter Tip (Sterile)	Star Lab	S1122-1830
20µl Bevelled TipOne Filter Tip (Sterile)	Star Lab	S1120-1810
Rocking shaker plate
Microscope slides, menzel Glaeser	Thermos Scientific	631-9483	Superfrost Plus
Cover Glasses, Menzel Glaeser	Thermos Scientific	MENZBB024060AB	24 x 60 mm
Confocal microscope	Nikon