Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, Candida albicans biyofilm büyüme üzerine kırmızı ışık uygulama sonucu değerlendirmek için bir protokol mevcut. 635 nm dalga boyu ve enerji yoğunluğu 87.6 J·cm-2 , tutarlı olmayan kırmızı ışık aygıtla Candida albicans biyofilmler 48 h için büyüme boyunca uygulandı.

Özet

Burada, başına harcırah kırmızı ışık tedavi Candida albicans biyofilm büyüme üzerine sonuçlarını değerlendirmek için bir protokol mevcut. C. albicans SN425 planktonik büyüme artırmak için Maya azot Bankası medyada inoculums büyüdü. Biyofilm oluşumu için amino asit yüksek konsantrasyonda var, RPMI 1640 medya biyofilm büyüme yardımcı olmak için uygulandı. 48 h biyofilmler tutarlı olmayan bir ışık cihazı ile günde 1 dk süreyle tedavi (kırmızı ışık; dalga boyu 635 = nm; enerji yoğunluğu 87.6 J·cm-2=). Olumlu denetim (PC), % 0.12 klorheksidin (CHX) uygulandı ve bir negatif kontrol (NC), %0.89 NaCl biyofilmler için uygulandığı gibi. Birimleri (CFU), oluşturan colony kuru ağırlık, çözünür ve çözünmez exopolysaccharides tedaviler sonra sayısal. Kısaca, burada sunulan iletişim kuralı basit, tekrarlanabilir ve canlılığı, ilgili yanıtlar kırmızı ışık tedavisi. sonra kuru ağırlık ve ekstraselüler polisakkarit tutarları sağlar

Giriş

Diyabet, immünsüpresif tedavi uygulamaları, HIV enfeksiyonu, AIDS salgınının, invaziv klinik yordamlar ve son yıl içinde geniş spektrumlu antibiyotik tüketimi artan insidansı Candida albicans insidansı artmıştır hastalıkları1,2ilgili. C. albicans enfeksiyonları sık biyofilm geliştirilmesi için ilgili ve kandidiyazis veya candidemia1,2gibi sistemik bulgular gibi klinik bulgular neden olabilir. Bir biyofilm büyümenin en önemli virülans faktörlerin ekstraselüler polisakkarit matris olarak tanımlanmıştır. Biyofilm oluşumu için varolan antifungal ilaçlar, çevresel stres ve konak immün mekanizmalar3direncini artırmak için işbirliği yapmaktadır.

C. albicans biyofilm büyüme maya hücreleri substrat yüzey ve hyphal büyüme yoluyla yayılması ve ardından bir substrat erken bağlılığı planktonik hücre ile başlar. Son biyofilm büyüme neyin maya benzeri geliştirme bastırılır, hyphal geliştirme genişletir ve hücre dışı matriks biyofilm4içine alır olgunlaşma aşama aşamadır. C. albicans exopolysaccharides (EPS) matris mannan-glukan karmaşık5,6oluşturmak için etkileşim. Exopolysaccharides etkileşim biyofilmler uyuşturucu7karşı savunma için önemlidir. Bu nedenle, EPS C. albicans hücre dışı matriks gelen azalma oral kandidiyaz denetim için yeni antibiofilm protokolleri gelişimini desteklemek.

Fotodinamik antimikrobiyal kemoterapi (anlaşma) bir antimikrobiyal olarak uygulanmış ve ışık büyüme, gelişme ve çeşitli organizmalar8 davranışını düzenler. ANLAŞMA belirli bir dalga boyu ve bir ışık emici photosensitizer9görünür ışığında uygular. Ancak, dezenfeksiyon biyofilm Penetran zorlukları alt etkinlik10neden vardır. Terapötik ajanlar başarısızlığı tamamen biyofilmler sızmaya biyofilmler geleneksel antimikrobiyal tedavi3,5zaman zaman karşı koymak bir nedenidir. Kapalı mikrobiyal hücreleri devre dışı bırakmak hücre dışı matriks nüfuz antimicrobials gerekir; Yine de, EPS düzeylerini taşıma biyofilm içine isteyen veya matris kendisi ile antimikrobiyal yanıt11etkileyen böyle moleküller için diffusional bir engel karakterize.

ANLAŞMA dezavantajları göz önüne alındığında, ışık tek başına kullanımı değerli bir gelişme olarak ortaya çıkıyor. Tedavi günde iki kez mavi ışık ile önemli ölçüde üretiminde EPS çözünmez Streptococcus mutans çoğunlukla biyofilm inhibe ön veriler saptandı. EPS çözünmez azalma tarafından mavi ışık biyofilm büyüme azalmış. Yine de, kırmızı ışık C. albicans biyofilmler kullanarak fototerapi sonucunu azdır. Bu nedenle, bu soruşturmanın amacı büyüme ve C. albicans biyofilm düzenlenmesi kırmızı ışık kullanarak ne şekilde fototerapi etkiler değerlendirmek için oldu. İki kez günlük tedavi için biz canlılığı, ilgili yanıtları sağlayan bir kolay ve tekrarlanabilir biyofilm modeli sağlamak için bizim laboratuvar 's önceki iletişim kuralları9,12 adapte kuru ağırlık ve ekstraselüler polisakkaritler kırmızı ışık tedavisi. sonra tutarları Aynı iletişim kuralını diğer tedaviler test etmek için kullanılabilir.

Protokol

1. Kültür medya hazırlanması

  1. Sabouraud dekstroz agar (SDA) hazırlayın. 65 g kloramfenikol (50 mg/L) 1000 ml distile su ile SDA askıya alma. Orta tamamen erimesi için kaynatın. Tarafından 30 dk. serin ile 45-50 ° c 15 PSI (121 ° C), ısıyla sterilize Mix iyi ve SDA 20 mL steril Petri tabak içine dökün (Boyut: 100 x 15 mm).
  2. 6,7 g YNB ve 18 g dekstroz 1000 ml ultrasaf su karışımı ile 100 mM glikoz ile desteklenmiş Maya azot temel (YNB) orta hazırlayın. Bir karıştırıcı kullanarak karıştırın ve 0,22 µm vakum filtre sistemi kullanarak orta sterilize.
  3. 10.4 g RPMI 1640 ve 3-(N-morpholino) 34.32 gr karıştırılarak RPMI hazırlamak propanesulfonic asit (paspas) 1000 mL ultrasaf su için. Isı olmadan bir karıştırıcı karışımı ve pH 7'ye 1 N NaOH (Ekle 2 g NaOH ultrasaf su 50 ml) ekleyerek ayarlayın. 0,22 µm vakum filtre sistemi kullanarak orta sterilize.

2. ön inoculum ve inoculum

  1. C. albicans SN425 mikroorganizma −80 ° C dondurucudan kaldırmak ve ortam sıcaklığında erimek izin verin. Petri takıma kloramfenikol (50 mg/L) ile SDA içeren yemekleri hisse senedi kültürünün 10 µL tohum. Petri yemekler tükenmesiyle 37 ° C'de 48 h için kuluçkaya.
  2. Kuluçka 48 saat sonra temel (YNB) orta 100 mM glikoz ile desteklenmiş ve tükenmesiyle 37 ° C'de öncesi inoculum için 16 h için kuluçkaya Maya azot 10 mL 10 kolonileri C. albicans ekleyin.
  3. Bir 1:10 ile 100 mM glikoz takıma taze YNB orta içine starter kültürler sulandrarak inoculums 16 h, hazırlamak için kuluçka sonra (9 mL YNB seyreltilmiş starter kültür 1 mL) oranı. İlk optik yoğunluk (OD) 540 ölçmek nm.
  4. Suşları orta günlük büyüme aşaması ulaşmak ve 540, son OD ölçmek kadar inoculums tükenmesiyle 37 ° C'de 8 h için kuluçkaya nm. Orta günlük büyüme faz (8 h, şekil 1' deki büyüme eğrileri dayalı) inoculums OD olup olmadığını denetlemek için ilk OD dan son OD çıkarma.
  5. 107 hücreleri mL-1ile bir inoculum ulaşmak için inoculum 5500 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant atın ve tüpler hacmi yarısı inoculum konsantre ol.

3. biyofilm oluşumu ve fototerapi

  1. İnoculum 1 mL 24-şey polistiren tabakta wells için ekleyin. Tükenmesiyle 37 ° C'de hücre adezyon kuyu dibine izin vermek 90 dk için kuluçkaya.
  2. Tutarlı olmayan bir kırmızı kullanın (bkz. Tablo reçetesi) 635 ± 10 nm dalga boyu ve 1,460 mW cm−2bir sabit çıkış gücü ile ışık kaynağı olarak ışık.
  3. Bir güç ölçüm ışığı güç yoğunluğunu ölçmek için kullanın. Uygulanan parlak pozlama 87.6 J cm-2, pozlama yaklaşık 1 dakika için eşdeğer olduğunu. Enerji yoğunluğu (J/cm2) formülünü kullanın = güç yoğunluğu (W/cm2) x ışınlama zaman (s). Bir mesafe 5 mm arasında ışık kaynağı ve biyofilm örnek ısınma önlemek için geçerlidir.
  4. Pozitif kontrol biyofilmler % 0.12 klorheksidin 1 dakika ile ve negatif kontrol biyofilmler %0,89 ile tedavi NaCl 1 dk için.
  5. Seanslarınızdan sonra iki kez %0,89 NaCl çözeltisi ile tüm biyofilmler yıkayın.
  6. 1 mL RPMI 3 ile (N-morpholino) tamponlanmış 1640 ekleyin propanesulfonic asit (paspas) pH 7 biyofilmler için ve 37 ° C'de plakaları gecede kuluçkaya.
  7. Adımları için 3.6 3.2, yıkamak gibi biyofilmler %0,89 ile iki kez sabah aynı tedavileri uygulamak NaCl, yeni RPMI BEZLERİ (1 mL, pH 7) kuyu için arabelleğe alınmış ekleyin ve 37 ° C'de tükenmesiyle kuluçkaya
  8. 6 h sonra aynı gün biyofilmler kırmızı ışığa maruz bırakmayın. Pozitif kontrol biyofilmler % 0.12 klorheksidin 1 dakika ile ve negatif kontrol biyofilmler %0,89 ile tedavi NaCl 1 dk için. Seanslarınızdan sonra biyofilmler %0,89 NaCl çözeltisi ile iki kez yıkayın.
  9. Tekrarlamak belgili tanımlık merdiven 3.2-3,8 biyofilm gelişiminin 48 h ulaşmak kadar.
    Not: Temel olarak, bir tedavi sabah olacak ve diğeri öğleden sonra aynı gün (6 h apart) olacak.

4. işlem

  1. 1 mL steril %0,89 ekleyin NaCl kuyu için de bir pipet ucu kullanarak--dan tırmalamak tarafından biyofilm kaldırmak için. Kaldırılan biyofilm için steril bir tüp ekleyin.
  2. Başka bir 1 mL steril %0,89 ekleyin NaCl de. Bunu tekrar sıfırdan ve aynı tüp için toplam hacmi 2 mL süspansiyon ekleyin.
  3. Koloni oluşturan birimler (CFU)
    1. Şiddetle girdap biyofilm süspansiyon 1 dk için. Biyofilm süspansiyon, bir aliquot olarak 0.1 mL seri seyreltme için kullanın.
    2. 10-1 10-4 %0,89 NaCl çözeltisi içinde biyofilm süspansiyon sulandırmak.
    3. Her seyreltme SDA plakaları için 50 μL tohum ve plakaları için 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Kolonilerin sayımı ve formül CFU/mL uygulamak koloniler x 10n sayısı = / q (n = seyreltme; q numaralı seribaşı hacmi =).
  4. Kuru ağırlığı
    1. Tartmak ve microcentrifuge tüpler etiket.
    2. Biyofilm süspansiyon, 0.1 mL kuru ağırlığı (biyokütle) belirlenmesi için kullanın.
    3. Mutlak etanol 1 mL 0.1 mL biyofilmler bir aliquot için ekleyin ve 18 h için-20 ° C'de saklayın. 18 h sonra santrifüj kapasitesi 10.000 x g 10 min için de.
    4. Süpernatant atmak, tüpler örnekleri için bir hafta kuru ve microcentrifuge tüpleri tekrar tartmak için bir desiccator yerleştirin.
  5. Suda çözünen polisakkaritler (WSPs) ve alkali çözünür polisakkaritler (ASP)
    1. Biyofilm süspansiyon, şiddetle girdap birim (1,8 mL) 1 dk ve 4 ° C'de 10 dakika 5.500 × g , santrifüj için kalan üzerinden Süpernatant yeni bir tüp içinde depolamak ve çökelti steril ultrasaf su (5.500 × g, 10 min 4 ° C'de) ile hücre dışı matriks çözünmez bileşenleri içeren iki kez hücre ile yıkayın.
    2. Çözünmez içeriği yeniden 1,8 mL steril ultrasaf su askıya alma.
    3. Suda çözünen polisakkaritler (WSPs)
      Not: Bu deney bir duman Hood gerçekleştirin.
      1. Saklı süpernatant, 1 mL suda çözünen polisakkaritler (WSPs) miktar için saklıdır.
      2. 1 dk. için saklı süpernatant lunaparkçı. Sonra steril tüpler aktarmak ve %2.5 95 etanol hacimleri ekleyin. Tüpler-20 ° c WSPs yağış için 18 h için saklayın.
      3. 18 h sonra 9.500 x g 4 ° C'de 20 dk için de tüpler santrifüj kapasitesi Santrifüjü sonra supernatants atın.
      4. Üç kez ile % 75 etanol örnekleri yıkama ve granül kuruması. Pelet 1 mL steril ultrasaf su ile yeniden askıya alma ve fenol sülfürik asit yöntemini kullanarak WSP ölçmek.
      5. % 0.1 glikoz (0,01 g glikoz ultrasaf su 10 ml) için standart eğri'yi kullanın (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 ve 25 µL glikoz tüp başına).
      6. 200 µL % 5 fenol (% 90 fenol ultrasaf su 47.3 ml 2.7 mL) örnek 200 µL oluşan bir cam tüp ekleme veya standart eğri (örnek başına nüsha) nokta ve dikkatli bir şekilde karıştırın.
      7. Sülfürik asit 1 mL tüp ekleyip karıştırın. Reaksiyon için 20 dk bekleyin ve bir Spektrofotometre kullanarak örnekleri ölçmek (490 nm).
    4. Alkali çözünür polisakkaritler (ASP)
      Not: Bu deney bir duman mahallede gerçekleştirin.
      1. Çözünmez yeniden askıya alınmış tutarından ASP'lerin belirlenmesi için 1 mL ayırın. Her biyofilm süspansiyon (13.000 x g, 4 ° C'de 10 dakika) aliquots santrifüj kapasitesi.
      2. Dikkatli her tüpün süpernatant kaldırın. O zaman örnekleri granül kuru vakum yoğunlaştırıcı üzerinde yer.
      3. Granül tartmak ve NaOH 1 N (NaOH 2 g ultrasaf su 50 ml) kuru ağırlığının 1 mg başına 300 µL ekleyin. Onları 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya ve 13.000 × g 10 dk de santrifüj kapasitesi.
      4. İhtiyatlı bir pipet ve transfer supernatants Pelet Bakımı microcentrifuge tüpler için toplamak.
      5. Bir kez daha, granül oluşan tüpler 1 N NaOH eşit bir birim eklemek ve tekrarlamak ayni merdiven aynı derecede yukarıda ASP çıkış için.
      6. Kuluçka için 2 h sonra örnekleri (13.000 x g 10 dk) santrifüj kapasitesi, dikkatle supernatants toplamak ve daha önce toplanan supernatants ekleyin.
      7. Üçüncü çıkarılması için tekrarlamak ayni merdiven olarak yukarıda, ama bu sefer, örnekleri Santrifüjü önce 2 h için kuluçkaya değil.
      8. Daha sonra üç birim % 95 etanol her örnek için ekleyin. O zaman, örnekleri −20 ° C yağış ASP için 18 h için stok.
      9. Tüpler (9500 × g için 4 ° C'de 20 dk) santrifüj kapasitesi ve supernatants atın.
      10. Her Pelet üç kez % 75 etanol ile yıkama ve kuruması (aynı işlemleri yaptım WSP için). Granül eşit 1 N NaOH ile ilk çıkarma hacmi yeniden askıya.
      11. Örnekleri miktar fenol sülfürik kullanarak ASP için okumak (WSP analiz gelince aynı).

Sonuçlar

Şekil 2 görüntüler sonuçları günlük10 C. albicans CFU/mL kırmızı ışık ile başına yolculuğunu tedaviler sonra 1 dk. kırmızı ışık günlük10 CFU/mL NC karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaltılmış (p = 0,004). Şekil 3 günlük tedaviler sonra C. albicans biyofilmler biyokütle (mg) sonuçlarını sunar. Tüm gruplar için NC göre biyolojik kütle göst...

Tartışmalar

Başarılı C. albicans biyofilm kültürü için en kritik adımlar şunlardır: 1) öncesi inoculum ve inoculum ile 100 mM glikoz; tamamlanmaktadır YNB orta yapmak 2) 90 dk yapışma aşama için dikkatli bir şekilde iki kez wells %0,89 ile yıkayın için beklemek NaCl hücrelerin; non yapıştırılır kaldırmak için ve 3) RPMI orta RPMI hif büyüme teşvik edecek bu yana biyofilm oluşumu, başlatmak için yapıştırılan hücrelere eklemek için. Aneuploidies C. albicanskültür oluşabilir...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu çalışmada gelişimi için Dr Paula da Silveira, Dr Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr Malvin N. Janal ve Dr. Iriana Zanin teşekkür ederim. Ayrıca Dr Alexander ö. Johnson (UCSF) Bu çalışmada analiz zorlanma bağış için kabul.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Clorhexidine 20% Sigma-AldrichC9394
Dextrose (D-Glucose) AnhydroousFisher ChemicalD16-500
Ethanol 200 proofDecon LaboratoriesDSP-MD.43
LumaCare LC-122 A LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA 
NaCl Fisher ChemicalS641-500
NaOH Fisher Bioreagents BP 359-500
Phenol 5%Milipore Sigma843984
RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)SigmaR7755
Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicolAcumedia7306A
Sulfuric acid Fisher ChemicalSA200-1
Yeast nitrogen base DifcoDF0392-15-9
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPSSigma-AldrichM1254
 24-well polystyrene plate Falcon353935

Referanslar

  1. Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
  2. Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
  3. Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
  4. Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
  5. Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
  6. Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
  7. Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
  8. Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
  9. de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
  10. Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
  11. Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
  12. Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
  13. Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
  14. Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
  15. Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
  16. Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
  17. Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
  18. Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyofilmmm noloji ve enfeksiyonsay 146Candida albicansfototerapik rm z kh cre d Matrikspolyssacharides

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır