Diária fototerapia com luz vermelha para regular crescimento de biofilme de Candida albicans

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar o resultado da aplicação de luz vermelha sobre o crescimento de biofilmes de Candida albicans . Um dispositivo não-coerente de luz vermelha com comprimento de onda de 635 nm e densidade de energia de 87,6 J·cm^-2 foi aplicado durante todo o crescimento de biofilmes de Candida albicans por 48 h.

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar os resultados das diárias de luz vermelha tratamento sobre o crescimento de biofilmes de Candida albicans . Para aumentar o crescimento planctônico de SN425 de c. albicans , o inoculo cresceu na mídia de levedura Base de nitrogênio. Para a formação de biofilme, mídia RPMI 1640, que têm altas concentrações de aminoácidos, foram aplicadas para ajudar o crescimento do biofilme. Biofilmes de 48 h foram tratadas duas vezes por dia por um período de 1 min com um dispositivo de luz não-coerente (luz vermelha; comprimento de onda = 635 nm; densidade de energia = 87,6 J·cm^-2). Como um controle positivo (PC), clorexidina 0,12% (CHX) foi aplicado e como um controle negativo (NC), 0,89% NaCl foi aplicado para os biofilmes. Formadoras de colónias (UFC), unidades de peso seco, solúveis e insolúveis exopolissacarídeo foram quantificados depois dos tratamentos. Resumidamente, o protocolo aqui apresentado é simples, Reproduzível e fornece respostas sobre viabilidade, montantes de polissacarídeo extracelular e de peso seco após o tratamento de luz vermelha.

Introdução

O aumento da incidência de diabetes, aplicações de terapia imunossupressora, infecção pelo HIV, a epidemia de AIDS, procedimentos clínicos invasivos e consumo antibiótico de largo espectro nos últimos anos tem aumentado a incidência de Candida albicans relacionados com doenças^1,2. Infecções de c. albicans são comumente relacionadas ao desenvolvimento de biofilme e podem causar manifestações clínicas, tais como candidíase, ou manifestações sistêmicas, tais como candidemia^1,2. Dentre os fatores de virulência, mais notáveis do crescimento do biofilme é o estabelecimento de matriz de polissacarídeo extracelular. Formação de biofilmes coopera para aumentar a resistência a drogas antifúngicas existentes, estresse ambiental e de mecanismos imunes do hospedeiro³.

O crescimento de biofilmes de c. albicans começa com a adesão inicial de células planctônicas a um substrato, seguido pela propagação de células de levedura através da superfície do substrato e o crescimento das hifas. A última fase do crescimento do biofilme é a fase de maturação, no qual desenvolvimento de leveduras, como é suprimido, o desenvolvimento das hifas expande e a matriz extracelular inclui o biofilme⁴. C. albicans exopolissacarídeo (EPS) na matriz interage para formar o complexo^5,de Medeiros-glucan⁶. A interação de exopolissacarídeo é fundamental para a defesa dos biofilmes contra drogas⁷. Daí, a redução dos EPS da matriz extracelular de c. albicans pode apoiar o desenvolvimento de novos protocolos de antibiofilm para controle da candidíase oral.

Luz regula o crescimento, desenvolvimento e comportamento de vários organismos⁸ e foi aplicado como um antimicrobiano da quimioterapia fotodinâmica antimicrobiana (Pacto). Pacto aplica-se uma luz visível de um comprimento de onda específico e uma absorção de luz fotossensibilizador⁹. No entanto, os fotossensibilizadores têm dificuldades em penetrar o biofilme, causando menor eficácia¹⁰. O fracasso de agentes terapêuticos para infiltrar totalmente biofilmes é uma razão que biofilmes ocasionalmente resistem tradicional terapia antimicrobiana^3,5. Para desactivar as células microbianas fechadas, antimicrobianos precisam permear através da matriz extracelular; Não obstante, o EPS caracteriza um obstáculo de difusão para tais moléculas alertando o seu nível de transporte para o biofilme ou influenciando a resposta do antimicrobiano com a própria matrix¹¹.

Tendo em conta as desvantagens do Pacto, o uso da luz por si só emerge como uma melhoria valiosa. Dados preliminares revelaram que o tratamento com luz azul duas vezes por dia inibiu significativamente a produção de EPS-insolúvel em biofilmes de Streptococcus mutans . Pela diminuição de EPS-insolúvel, luz azul diminuiu o crescimento do biofilme. No entanto, os resultados da fototerapia usando luz vermelha em biofilmes de c. albicans são escassos. Portanto, o objetivo desta investigação foi avaliar em que fototerapia de maneira usando luz vermelha influencia o crescimento e o arranjo de biofilmes de c. albicans . Para o tratamento duas vezes por dia, adaptamos anterior protocolos^9,12 para fornecer um modelo de biofilme fácil e reprodutíveis que fornece respostas sobre viabilidade, do nosso laboratório peso seco e extracelulares polissacarídeos quantidades após o tratamento de luz vermelha. O mesmo protocolo pode ser usado para testar outras terapias.

Protocolo

1. preparação de meios de cultura

1. Prepare ágar de sabouraud dextrose (ASD). Suspenda 65g de SDA suplementado com cloranfenicol (50 mg/L) em 1.000 mL de água destilada. Ferva até para dissolver o meio completamente. Esterilizar em autoclave a 15 PSI (121° C) por 30 min. esfriar a 45-50 ° C. Misture bem e despeje a 20 mL de SDA em placas de Petri estéril (tamanho: 100 x 15 mm).
2. Prepare o fermento nitrogênio base (YNB) suplementado com glicose de 100 mM, misturando 6,7 g de YNB e 18 g de dextrose a 1.000 mL de água ultrapura. Misture utilizando um agitador e esterilizar o meio usando um sistema de vácuo filtro de 0,22 µm.
3. Prepare RPMI misturando 10,4 g de RPMI 1640 e 34,32 g de 3-(N-Morpholinos) ácido (MOPS) a 1.000 mL de água ultrapura. Misture em um agitador sem calor e ajustar o pH a 7, adicionando 1 N NaOH (adicionar 2 g de NaOH a 50 mL de água ultrapura). Esterilize o meio usando um sistema de vácuo filtro de 0,22 µm.

2. pré-inóculo e inóculo

1. Retire o microorganismo SN425 de c. albicans do −80 ° C freezer e deixe descongelar à temperatura ambiente. Semear 10 µ l da cultura estoque em placas de Petri contendo SDA suplementado com cloranfenicol (50 mg/L). Incube as placas de Petri por via aeróbia a 37 ° C, por 48 h.
2. Após 48 h de incubação, adicione 10 colônias de c. albicans a 10 mL de nitrogênio levedura base (YNB) meio suplementado com glicose de 100 mM e incubar por via aeróbia, a 37 ° C, durante 16 h para o pre inóculo.
3. Após a incubação para 16 h, preparar o inoculo diluindo os fermentos em fresco YNB suplementado com glicose de 100 milímetros em um 01:10 proporção (1 mL da cultura starter diluída em 9 mL de YNB). Medir a densidade óptica inicial (OD) a 540 nm.
4. Incubar o inoculo aeróbia em 37 ° C, durante 8 h até as estirpes de alcançar a fase de crescimento log de mid e medem o OD final a 540 nm. Subtrai o OD final partir do OD inicial para verificar se o OD do inoculo estão em fase de crescimento do log de mid (8h, baseado sobre as curvas de crescimento na Figura 1).
5. Para alcançar um inóculo com 10⁷ células mL^-1, centrifugar o inóculo por 5 min a 5.500 x g, desprezar o sobrenadante e concentrar o inóculo para metade do volume dos tubos.

3. fototerapia e formação de biofilmes

1. Adicione 1 mL do inóculo para os poços de uma placa de poliestireno 24-bem. Incube por via aeróbia a 37 ° C por 90 min permitir a aderência de célula para o fundo dos poços.
2. Use um vermelho não coerente de luz (ver Tabela de materiais) como a fonte de luz com comprimento de onda de 635 nm ± 10 e uma potência de saída fixa de 1.460 mW cm^{− 2}.
3. Use um medidor de potência para medir a densidade de potência da luz. A exposição radiante aplicada é 87,6 J cm^-2, equivalente a cerca de 1 minuto de exposição. Use a fórmula de densidade de energia (J/cm²) = densidade de potência (W/cm²) x tempo de irradiação (s). Aplica a uma distância de 5 mm entre a fonte luminosa e o biofilme para evitar o aquecimento da amostra.
4. Tratar os biofilmes de controle positivo com clorexidina 0,12% por 1 min e biofilmes de controlo negativo com 0,89% NaCl por 1 min.
5. Depois dos tratamentos, lave todos os biofilmes duas vezes com solução de NaCl de 0,89%.
6. Adicionar 1 mL de RPMI 1640 tamponado com 3-(N-Morpholinos) ácido (MOPS) com pH de 7 para os biofilmes e incubar as placas a 37 ° C durante a noite.
7. Pela manhã, aplicar os mesmos tratamentos como etapas 3.2 a 3.6, lavar os biofilmes duas vezes com 0,89% NaCl, adicionar novo RPMI tamponado com MOPS (1 mL, pH 7) aos poços e incubar por via aeróbia, a 37 ° C.
8. No mesmo dia, depois de 6 h, expor os biofilmes de luz vermelha. Tratar os biofilmes de controle positivo com clorexidina 0,12% por 1 min e biofilmes de controlo negativo com 0,89% NaCl por 1 min. Depois dos tratamentos, lave os biofilmes duas vezes com solução de NaCl de 0,89%.
9. Repita as etapas de 3.2-3.8 até alcançar 48 h de desenvolvimento de biofilme.
   Nota: Basicamente, um tratamento acontecerá pela manhã e o outro vai acontecer à tarde, no mesmo dia (6h separado).

4. processamento

1. Adicionar 1 mL de estéril 0,89% NaCl ao poço para remover o biofilme riscando-a partir do bem usando uma ponta da pipeta. Adicione o biofilme removido a um tubo estéril.
2. Adicionar outro 1 mL de estéril 0,89% NaCl para o poço. Riscá-lo novamente e adicione a suspensão para o mesmo tubo para um volume total de 2 mL.
3. Unidades formadoras de Colônia (UFC)
   1. Vigorosamente o vórtice a suspensão de biofilme por 1 min. Da suspensão do biofilme, use uma alíquota de 0,1 mL para a diluição de série.
   2. Dilua a suspensão de biofilme de 10^-1 a 10^-4 em solução de NaCl de 0,89%.
   3. Sementes de 50 μL de cada diluição para placas SDA e incubar as placas a 37 ° C por 48 h.
   4. Contar as colônias e aplicar a fórmula UFC/mL = número de colônias x 10ⁿ / q (n = diluição; q = volume semeado).
4. Peso seco
   1. Tubos de microcentrifuga de pesar e rótulo.
   2. Da suspensão do biofilme, use 0,1 mL para determinação do peso seco (biomassa).
   3. Adicionar 1 mL de etanol absoluto a uma alíquota de 0,1 mL dos biofilmes e armazená-lo a-20 ° C durante 18 h. Após 18 h, centrifugar a 10.000 x g durante 10 minutos.
   4. Desprezar o sobrenadante, coloque os tubos no exsicador até secar as amostras durante uma semana e pese os tubos microcentrifuga novamente.
5. Polissacarídeos solúveis em água (WSPs) e polissacarídeos álcali-solúvel (ASPs)
   1. Da suspensão do biofilme, vigorosamente vórtice o restante do volume (1,8 mL) para 1 min e centrifugar 5.500 × g por 10 min a 4 ° C. Armazenar o sobrenadante em um novo tubo e lavar o precipitado duas vezes com as células, que contêm os componentes insolúveis da matriz extracelular com água ultrapura esterilizada (5.500 × g, 10 min a 4 ° C).
   2. Ressuspender o teor de insolúvel em 1,8 mL de água ultrapura esterilizada.
   3. Polissacarídeos solúveis em água (WSPs)
      Nota: Realize este experimento em uma coifa.
      1. Partir do sobrenadante armazenado, reserve 1 mL para a quantificação de polissacarídeos solúveis em água (WSPs).
      2. Homogeneizar o sobrenadante armazenado por 1 min. Em seguida, transferir para tubos estéreis e adicione 2,5 volumes de etanol a 95%. Armazene os tubos para 18 h a-20 ° C para WSPs precipitação.
      3. Após 18 h, centrifugar os tubos a 9.500 x g por 20 min a 4 ° C. Após a centrifugação, descarte os sobrenadantes.
      4. Lavar as amostras três vezes com 75% de etanol e secar as pelotas. Ressuspender o sedimento com 1 mL de água ultrapura esterilizada e quantificar o WSP usando o método de ácido sulfúrico de fenol.
      5. Use 0,1% de glicose (0,01 g de glicose a 10 mL de água ultrapura) para a curva padrão (0, 2,5, 5, 10, 15, 20 e 25 µ l de glicose por tubo).
      6. Adicionar 200 µ l de fenol a 5% (2,7 mL de fenol 90% a 47,3 mL de água ultrapura) para um tubo de vidro que compreende 200 µ l da amostra ou curva padrão ponto (em triplicado, por exemplo) e misture com cautela.
      7. Adicione 1 mL de ácido sulfúrico ao tubo e misture. Espere 20 min para a reação e medir as amostras usando um espectrofotômetro (490 nm).
   4. Álcali-solúvel polissacarídeos (ASPs)
      Nota: Realize este experimento em uma coifa.
      1. Pela quantidade de re-suspensão insolúvel, separe 1 mL para a determinação de víbora. Centrifugar as alíquotas de cada suspensão de biofilme (13.000 x g, durante 10 minutos a 4 ° C).
      2. Cautelosamente, remova o sobrenadante de cada tubo. Em seguida, coloque as amostras em um vácuo concentrador para secar as bolinhas.
      3. Pesar as bolinhas e adicionar 300 µ l de 1 N NaOH (2 g de NaOH a 50 mL de água ultrapura) por 1 mg de peso seco. Incube-os durante 2 h a 37 ° C e em seguida centrifugar a 13.000 × g por 10 min.
      4. Cautelosamente, colete os sobrenadantes com uma pipeta e transferência para tubos microcentrifuga, mantendo a pelota.
      5. Mais uma vez, adicionar um volume igual de 1 N de NaOH para os tubos que compreende as pelotas e repita as mesmas etapas acima para a extração do ASP.
      6. Após a incubação por 2 h, Centrifugar as amostras (13.000 x g durante 10 minutos), cuidadosamente coletar os sobrenadantes e adicionar os sobrenadantes coletados anteriormente.
      7. Para a extração de terceira, repita as mesmas etapas acima, mas desta vez, não incubar as amostras para 2 h antes da centrifugação.
      8. Depois, adicione três volumes de etanol a 95% para cada amostra. Então, o estoque das amostras −20 ° C por 18 h para a precipitação do ASP.
      9. Centrifugar os tubos (9.500 × g por 20 min a 4 ° C) e descartar os sobrenadantes.
      10. Cada pellet três vezes com 75% de etanol de lavar e secar ao ar (mesmos procedimentos fizeram por WSP). Ressuspender as pelotas no volume total igual da primeira extração com 1 N de NaOH.
      11. Leia as amostras para quantificação do ASP usando o fenol-ácido sulfúrico (mesmo quanto a análise WSP).

Resultados

Figura 2 exibe os resultados de Log₁₀ UFC/mL de c. albicans após tratamentos diários com luz vermelha para luz vermelha de 1 min. reduziu significativamente o Log₁₀ UFC/mL em comparação com o NC (p = 0,004). A Figura 3 apresenta os resultados da biomassa (mg) de biofilmes de c. albicans após tratamentos diários. Todos tratados grupos apresentaram redução da biomassa em comparação ...

Discussão

Os passos mais críticos para um cultivo bem sucedido de biofilmes de c. albicans são: 1) para fazer o pre- inóculo de e o inóculo em meio YNB complementado com glicose de 100 mM; 2) para esperar 90 min para a fase de adesão e cuidadosamente lavar duas vezes os poços com 0,89% NaCl para remover as células não-aderido; e 3) para adicionar meio RPMI às células aderidas para iniciar a formação de biofilmes, desde RPMI estimulará o crescimento de hifas. Aneuploidies pode ocorrer quando o cultivo de ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clorhexidine 20%	Sigma-Aldrich	C9394
Dextrose (D-Glucose) Anhydroous	Fisher Chemical	D16-500
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories	DSP-MD.43
LumaCare LC-122 A	LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA
NaCl	Fisher Chemical	S641-500
NaOH	Fisher Bioreagents	BP 359-500
Phenol 5%	Milipore Sigma	843984
RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)	Sigma	R7755
Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol	Acumedia	7306A
Sulfuric acid	Fisher Chemical	SA200-1
Yeast nitrogen base	Difco	DF0392-15-9
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
24-well polystyrene plate	Falcon	353935