Tägliche Phototherapie mit rotem Licht zu regulieren Candida Albicans Biofilm Wachstum

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bewertung der Ergebnisse der Rotlicht-Anwendung auf das Wachstum von Candida Albicans Biofilm. Eine nicht-kohärente Rotlicht-Gerät mit der Wellenlänge von 635 nm und Energiedichte von 87,6 J·cm^-2 wurde in das Wachstum von Candida Albicans Biofilmen für 48 h angewandt.

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Ergebnisse der Verpflegungspauschale Rotlicht Behandlung auf das Wachstum von Candida Albicans Biofilm zu beurteilen. Zur Steigerung der planktonischen Wachstums von C. Albicans SN425 wuchs der Befallsdruck auf Hefe Stickstoff Base Medien. Für Biofilmbildung waren RPMI 1640 Medien, die hohe Konzentrationen von Aminosäuren haben, angewandt, um Biofilm Wachstum zu helfen. Biofilmen von 48 h wurden zweimal täglich über einen Zeitraum von 1 min mit einem nicht-kohärente Licht Gerät behandelt (Rotlicht; Wellenlänge = 635 nm; Energiedichte = 87,6 J·cm^-2). Als Positivkontrolle (PC), 0,12 % Chlorhexidin (CHX) angewendet wurde, und als Negativkontrolle (NC), 0,89 % NaCl auf die Biofilme angewendet wurde. Koloniebildenden Einheiten (KBE), trocken-Gewicht, löslichen und unlöslichen Exopolysaccharide wurden nach Behandlungen quantifiziert. Kurz, das Protokoll hier vorgestellte einfache, reproduzierbare und bietet Antworten zur Lebensfähigkeit, trocken-Gewicht und extrazelluläre Polysaccharid Beträge nach der Rotlicht-Behandlung.

Einleitung

Die erhöhte Inzidenz von Diabetes, immunsuppressive Therapieanwendungen, HIV-Infektion, AIDS-Epidemie, invasive klinische Verfahren und Ausgedehntspektrum Antibiotika-Verbrauch in den letzten Jahren haben die Inzidenz von Candida Albicans erhöht im Zusammenhang mit Krankheiten^1,2. C. Albicans -Infektionen sind häufig im Zusammenhang mit Biofilm Entwicklung und klinische Manifestationen, z. B. Candidose oder systemischen Manifestationen, z. B. geschwächtes^1,2verursachen. Eines der bemerkenswertesten Virulenzfaktoren von Biofilm Wachstum ist die extrazelluläre Polysaccharid-Matrix-Einrichtung. Biofilmbildung arbeitet, um den Widerstand gegen bestehende Antimykotika, Umweltbelastungen und Wirt Abwehrmechanismen³zu erhöhen.

Der Biofilm-Wachstum von C. Albicans beginnt mit der frühen Einhaltung von planktonischen Zellen auf einem Substrat, gefolgt von der Vermehrung der Hefezellen durch die Substratoberfläche und Bodenaggregaten Wachstum. Die letzte Phase der Biofilm Wachstum ist die Reifungsphase, wobei hefeartigen Entwicklung wird unterdrückt, die Bodenaggregaten Entwicklung erweitert und die extrazelluläre Matrix umschließt den Biofilm-⁴. C. Albicans Exopolysaccharide (EPS) in der Matrix interagieren, um die Mannan-Glucan Komplex^5,6bilden. Das Zusammenspiel von Exopolysaccharide ist von entscheidender Bedeutung für die Verteidigung von Biofilmen gegen Drogen-⁷. Daher konnte die Verringerung der EPS von C. Albicans extrazellulären Matrix die Entwicklung neuer Antibiofilm Protokolle für orale Candidiasis Steuerung unterstützen.

Licht reguliert das Wachstum, die Entwicklung und das Verhalten der verschiedenen Organismen⁸ und es wurde als eine antimikrobielle photodynamische antimikrobielle Chemotherapie ("Pakt") angewandt. Pakt gilt ein sichtbares Licht einer bestimmten Wellenlänge und eine Licht-absorbierenden Photosensitizer⁹. Die Photosensibilisatoren haben jedoch Schwierigkeiten bei der Durchdringung des Biofilms verursacht geringere Wirksamkeit¹⁰. Das Scheitern von Therapeutika, Biofilme vollständig zu infiltrieren ist ein Grund, dass Biofilme gelegentlich traditionelle antimikrobielle Therapie^3,5widerstehen. Um den geschlossenen mikrobiellen Zellen zu deaktivieren, müssen Antibiotika durch die extrazelluläre Matrix zu durchdringen; Dennoch charakterisiert die EPS ein Diffusionsprozess Hindernis für solche Moleküle durch Eingebung dem Grad ihrer Beförderung in den Biofilm oder durch Einflussnahme auf die Reaktion der antimikrobiellen mit der Matrix selbst¹¹.

In Anbetracht der Nachteile des PAKTES erweist sich der Einsatz von Licht selbst als eine wertvolle Verbesserung. Vorläufige Daten ergab, dass die Behandlung mit Blaulicht zweimal täglich deutlich die Produktion von EPS-unlöslich in Streptococcus Mutans Biofilm gehemmt. Durch den Rückgang des EPS-unlösliche reduziertes Blaulicht Biofilm Wachstum. Die Ergebnisse der Phototherapie mit Rotlicht in C. Albicans Biofilme sind jedoch rar. Daher war das Ziel dieser Untersuchung, in welcher Weise Phototherapie mit rotem Licht das Wachstum und die Anordnung von C. Albicans Biofilm beeinflusst zu bewerten. Für die Behandlung zweimal täglich angepasst wir unser Labor vorherigen Protokolle^9,12 um eine einfache und reproduzierbare Biofilm-Modell zur Verfügung zu stellen, die Antworten zur Lebensfähigkeit, liefert trocken-Gewicht und extrazelluläre Polysaccharide Beträge nach der Rotlicht-Behandlung. Das gleiche Protokoll kann andere Therapien zu Testzwecken verwendet werden.

Protokoll

1. Vorbereitung von Nährmedien

1. Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) vorzubereiten. Aussetzen Sie, 65 g SDA mit Chloramphenicol (50 mg/L) in 1.000 mL destilliertem Wasser ergänzt. Kochen das Medium vollständig auflösen. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren bei 15 PSI (121° C) für 30 min. kühlen, 45-50 ° C. Gut mischen und gießen Sie 20 mL der SDA in sterilen Petri Platten (Größe: 100 x 15 mm).
2. Bereiten Sie Hefe Stickstoff Basis (YNB) Medium mit 100 mM Glukose durch das Mischen von 6,7 g YNB und 18 g Dextrose zu 1.000 mL Reinstwasser ergänzt. Mischen mit einem Rührer und sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22 µm-Vakuum-Filter-System.
3. Bereiten Sie RPMI durch Mischen 10,4 g RPMI 1640 und 34,32 g 3-(N-Morpholino) Propanesulfonic Säure (MOPS) auf 1.000 mL Reinstwasser. Ein Rührer ohne Hitze unterrühren Sie und passen Sie den pH-Wert auf 7 durch Zugabe von 1 N NaOH (Add 2 g NaOH auf 50 mL Reinstwasser). Sterilisieren Sie das Medium mit einem 0,22 µm-Vakuum-Filter-System.

2. Pre-Inokulum und Inokulum

1. Entfernen der Mikroorganismus C. Albicans SN425 aus der Tiefkühltruhe −80 ° C und bei Raumtemperatur auftauen lassen. Samen Sie 10 µL der Lager Kultur in Petrischalen mit SDA mit Chloramphenicol (50 mg/L) ergänzt. Inkubieren Sie die Petrischalen aerob bei 37 ° C für 48 h.
2. Fügen Sie nach 48 h Inkubation 10 Kolonien von C. Albicans zu 10 mL Hefe Stickstoff Basis (YNB) Medium ergänzt mit 100 mM Glukose und inkubieren Sie aerob bei 37 ° C 16 h für das Pre-Inokulum hinzu.
3. Nach Inkubation für 16 h, bereiten den Befallsdruck durch Verdünnung der Starterkulturen in frischen YNB Medium ergänzt mit 100 mM Glukose in einem 01:10 Verhältnis (1 mL verdünnt in 9 mL YNB Starter-Kultur). Die erste optische Dichte (OD) zu messen, bei 540 nm.
4. Der Befallsdruck aerob bei 37 ° C für 8 h inkubieren, bis die Stämme die Mitte Log Wachstumsphase erreichen und die endgültige OD bei 540 messen nm. Subtrahieren Sie die endgültige OD aus der anfänglichen OD zu überprüfen, ob die OD der Befallsdruck sind auf die Mitte des Log Wachstumsphase (8 h, basierend auf der Wachstumskurven in Abbildung 1).
5. Um eine Inokulum mit 10⁷ Zellen mL^-1zu erreichen, das Inokulum für 5 min bei 5.500 X gZentrifugieren, überstand verwerfen und das Inokulum auf die Hälfte des Volumens der Rohre zu konzentrieren.

3. die Biofilmbildung und Phototherapie

1. Fügen Sie 1 mL des Inokulums in die Vertiefungen einer 24-Well Polystyrol Platte. Inkubieren Sie aerob bei 37 ° C für 90 min Zelladhäsion an der Unterseite der Brunnen zu ermöglichen.
2. Verwenden Sie ein nicht-kohärente rotes Licht (siehe Tabelle der Materialien) als Lichtquelle mit Wellenlänge von 635 ± 10 nm und eine feste Ausgangsleistung von 1.460 mW cm⁻².
3. Verwenden Sie einen Leistungsmesser, um die Leistungsdichte des Lichtes zu messen. Die strahlende Belichtung angewendet ist 87,6 J cm^-2, entspricht ca. 1 min. Belichtung. Verwenden Sie die Formel Energiedichte (J/cm²) = Leistungsdichte (W/cm²) x Bestrahlungszeit (s). Gilt einen Abstand von 5 mm zwischen der Lichtquelle und der Biofilm, Erwärmung der Probenmaterials zu vermeiden.
4. Behandeln Sie die Positivkontrolle Biofilme mit 0,12 % Chlorhexidin für 1 min und Negativkontrolle Biofilme mit 0,89 % NaCl für 1 min.
5. Waschen Sie nach Behandlungen die Biofilme zweimal mit 0,89 % NaCl-Lösung.
6. Fügen Sie 1 mL RPMI 1640 gepuffert mit 3-(N-Morpholino) Propanesulfonic Säure (MOPS) bei pH 7, den Biofilmen und über Nacht die Platten bei 37 ° C inkubieren.
7. Am Morgen, gelten die gleichen Behandlungen wie Schritte 3,2 bis 3,6, waschen die Biofilme zweimal mit 0,89 % NaCl, fügen Sie neue RPMI gepuffert mit MOPS (1 mL, pH 7) in die Vertiefungen und aerob bei 37 ° c inkubieren
8. Am selben Tag, nach 6 h aussetzen der Biofilme auf rotes Licht. Behandeln Sie die Positivkontrolle Biofilme mit 0,12 % Chlorhexidin für 1 min und Negativkontrolle Biofilme mit 0,89 % NaCl für 1 min. Waschen Sie nach Behandlungen die Biofilme zweimal mit 0,89 % NaCl-Lösung.
9. Wiederholen Sie die Schritte 3.2-3.8 bis 48 h der Biofilm-Entwicklung zu erreichen.
   Hinweis: Grundsätzlich einer Behandlung geschieht am Morgen und eine am Nachmittag am selben Tag (6 h auseinander) passieren wird.

4. Verarbeitung

1. Fügen Sie 1 mL sterile 0,89 % NaCl zum Brunnen zu den Biofilm zu entfernen, indem Sie aus dem nun mit einer Pipettenspitze kratzen. Hinzu kommt ein steriles Röhrchen entfernt Biofilm.
2. Fügen Sie ein weiteres 1 mL sterile 0,89 % NaCl zum Brunnen. Kratzen sie wieder und das gleiche Rohr für ein Gesamtvolumen von 2 mL fügen Sie die Suspension hinzu.
3. Koloniebildenden Einheiten (KBE)
   1. Kräftig die Biofilm-Aussetzung für 1 min Wirbel. Verwenden Sie aus der Biofilm-Suspension eine Aliquote von 0,1 mL für die serielle Verdünnung.
   2. Verdünnen Sie die Biofilm-Aussetzung von 10^-1 bis 10^-4 in 0,89 % NaCl-Lösung.
   3. Samen Sie 50 μL jeder Verdünnung auf SDA-Platten und inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C für 48 h.
   4. Zählen der Kolonien und anwenden die Formel KBE/mL = Anzahl der Kolonien X 10ⁿ / Q (n = Verdünnung; Q = ausgesät Volumen).
4. Trockengewicht
   1. Wiegen Sie und Etikettieren Sie Mikrozentrifugenröhrchen.
   2. Verwenden Sie aus der Biofilm-Suspension 0,1 mL für trockene Gewichtsermittlung (Biomasse).
   3. Ein Aliquot von 0,1 mL der Biofilme 1 mL absolutes Ethanol hinzu und speichern sie bei-20 ° C für 18 h. Nach 18 h bei 10.000 X g für 10 min zentrifugieren.
   4. Verwerfen Sie den Überstand, legen Sie die Röhren auf ein Exsikkator trocknen die Proben eine Woche lang und wiegen die Mikrozentrifugenröhrchen wieder.
5. Wasserlösliche Polysaccharide (Wassersicherheitsplänen) und Alkali-lösliche Polysaccharide (ASPs)
   1. Aus der Biofilm-Suspension, kräftig Wirbel der Rest des Bandes (1,8 mL) für 1 min und Zentrifuge bei 5.500 × g für 10 min bei 4 ° C. Speichern des Überstands in einen neuen Schlauch und waschen das Präzipitat zweimal mit den Zellen, die die unlöslichen Bestandteile der extrazellulären Matrix mit sterilen Reinstwasser (5.500 × g, 10 min bei 4 ° C) enthalten.
   2. Wieder aussetzen des unlöslichen Inhalts bei 1,8 mL sterile Reinstwasser.
   3. Wasserlösliche Polysaccharide (Wassersicherheitsplänen)
      Hinweis: Führen Sie das Experiment in einer Dampfhaube.
      1. Reservieren Sie von der gespeicherten Überstand 1 mL für die Quantifizierung der wasserlösliche Polysaccharide (Wassersicherheitsplänen).
      2. Den gespeicherte überstand für 1 min zu homogenisieren. Dann transfer zum sterilen Röhrchen und fügen 2,5 Mengen von 95 % Ethanol. Speichern Sie die Rohre für 18 h bei-20 ° C für Wassersicherheitsplänen Niederschlag.
      3. Nach 18 h Zentrifugieren der Rohre bei 9.500 X g für 20 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie nach Zentrifugation die Überstände.
      4. Waschen Sie die Proben dreimal mit 75 % Ethanol zu und trocknen Sie die Pellets. Wieder aussetzen Sie das Pellet mit 1 mL sterile Reinstwasser und quantifizieren Sie die WSP mit Phenol-schweflige Säure Methode.
      5. 0,1 % Glukose (0,01 g Glukose zu 10 mL Reinstwasser) für die Standardkurve verwenden (0, 2,5, 5, 10, 15, 20 und 25 µL Glukose pro Röhre).
      6. Ein Glasrohr, bestehend aus 200 µL der Probe 200 µL 5 % Phenol (2,7 mL 90 % Phenol auf 47,3 mL Reinstwasser) hinzufügen oder Standardkurve zeigen (in dreifacher Ausfertigung je Probe) und vorsichtig mischen.
      7. Das Rohr 1 mL Schwefelsäure hinzu und mischen. Warten Sie 20 Minuten für die Reaktion und die Proben mit einem Spektralphotometer messen (490 nm).
   4. Alkali-lösliche Polysaccharide (ASPs)
      Hinweis: Führen Sie das Experiment in einer Dampfhaube.
      1. Trennen Sie die unlöslichen neu suspendierten Menge 1 mL zur Bestimmung der ASPs. Zentrifugieren der Aliquote jedes Biofilm-Suspension (13.000 X g, 10 min bei 4 ° C).
      2. Überstand jede Röhre vorsichtig zu entfernen. Dann legen Sie die Proben auf ein Vakuum Konzentrator die Pellets zu trocknen.
      3. Wiegen Sie die Pellets und fügen Sie 300 µL 1 N NaOH (2 g NaOH auf 50 mL Reinstwasser) pro 1 mg Trockengewicht hinzu. Diese 2 h bei 37 ° C inkubieren und dann bei 13.000 × g für 10 min zentrifugieren.
      4. Sammeln Sie vorsichtig die Überstände mit einer Pipette und Transfer Mikrozentrifugenröhrchen, Aufrechterhaltung der Pellets.
      5. Wieder einmal die Rohre bestehend aus Pellets ein gleiches Volumen von 1 N NaOH hinzu, und wiederholen Sie die gleichen Schritte wie oben für die Gewinnung von ASP.
      6. Zentrifugieren Sie nach der Inkubation für 2 h Proben (13.000 X g für 10 min.), sorgfältig sammeln Sie die Überstände und fügen Sie der zuvor gesammelten Überstände hinzu.
      7. Wiederholen Sie für die dritte Extraktion die gleichen Schritte wie oben, aber dieses Mal, inkubieren Sie die Proben für 2 h vor Zentrifugation nicht.
      8. Danach fügen Sie drei Bände von 95 % Ethanol zu jeder Probe. Dann führen Sie die Proben bei −20 ° C für 18 h zur Fällung von ASP.
      9. Zentrifugieren Sie die Rohre (9.500 × g für 20 min bei 4 ° C) und verwerfen Sie die Überstände zu.
      10. Jedes Pellet dreimal mit 75 % Ethanol zu waschen und trocknen (gleiche Verfahren habe für WSP). Wieder aussetzen Sie, die Pellets gleich Gesamtvolumen der ersten Extraktion mit 1 N NaOH.
      11. Lesen Sie die Proben für die Quantifizierung von ASP mit Phenol-Schwefelsäure (gleiche wie für die WSP-Analyse).

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der Log₁₀ KBE/mL von C. Albicans nach Tagessatz Behandlungen mit rotem Licht für 1 min. Rotlicht Log₁₀ KBE/mL im Vergleich zu den NC signifikant reduziert (p = 0,004). Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der Biomasse (mg) von C. Albicans Biofilmen nach täglichen Behandlungen. Alle Gruppen zeigten Reduktion der Biomasse im Vergleich zu den NC behandelt (p = 0....

Diskussion

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Kultivierung von C. Albicans Biofilm sind: 1) zu tun, das Pre-Inokulum und das Inokulum YNB Medium ergänzt mit 100 mM Glucose; (2) auf die Adhäsion Phase 90 min warten und sorgfältig waschen zweimal die Brunnen mit 0,89 % NaCl, entfernen von Zellen nicht eingehalten; und 3) eingehalten Zellen Biofilmbildung, starten, da RPMI Hyphen Wachstum anregen wird RPMI Medium hinzufügen. Aneuploidien können auftreten, wenn C. AlbicansKultivierung. Infolgedessen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clorhexidine 20%	Sigma-Aldrich	C9394
Dextrose (D-Glucose) Anhydroous	Fisher Chemical	D16-500
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories	DSP-MD.43
LumaCare LC-122 A	LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA
NaCl	Fisher Chemical	S641-500
NaOH	Fisher Bioreagents	BP 359-500
Phenol 5%	Milipore Sigma	843984
RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)	Sigma	R7755
Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol	Acumedia	7306A
Sulfuric acid	Fisher Chemical	SA200-1
Yeast nitrogen base	Difco	DF0392-15-9
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
24-well polystyrene plate	Falcon	353935