Ежедневные фототерапии с красный свет для регулирования Candida albicans биопленки роста

Резюме

Здесь мы представляем протокол для оценки результатов применения красный свет на рост Candida albicans биопленки. Устройство некогерентный красный свет с длиной волны 635 нм и плотность энергии 87,6 J·cm^-2 был применен во всем рост Candida albicans биопленки в течение 48 часов.

Аннотация

Здесь мы представляем протокол для оценки результатов лечения суточные красный свет на рост Candida albicans биопленки. Чтобы увеличить планктонных рост SN425 C. albicans , Инокулянты вырос на дрожжи азота базы СМИ. Для биопленки были применены RPMI 1640 СМИ, которые имеют высокие концентрации аминокислот, чтобы помочь росту биопленки. Биоплёнки 48 h относились два раза в день в течение 1 мин с устройством некогерентного света (красный свет, длина волны = 635 нм; плотность энергии = 87,6 J·cm^-2). Как положительный контроль (PC), 0,12% хлоргексидин (CHX) был применен и как отрицательный контроль (НК), 0,89% NaCl был применен к биопленки. Колонии, образуя единиц (CFU), сухой вес, растворимых и нерастворимых экзополисахаридов были количественно после лечения. Кратко протокол, представленные здесь прост, воспроизводимые и дает ответы относительно жизнеспособности, сухой вес и внеклеточный полисахарид суммы после лечения красный свет.

Введение

Увеличение заболеваемости диабетом, иммуносупрессивной терапии приложений, ВИЧ-инфекции, эпидемия СПИДа, инвазивных клинических процедур и широкого спектра действия антибиотиков потребления в последние годы увеличилось число Candida albicans связанные с заболеваниями^1,2. C. albicans инфекции обычно связаны с развитием биопленки и может вызвать клинических проявлений, таких как кандидоз, или системных проявлений, таких как кандидемия^1,2. Одним из наиболее значимых факторов вирулентности биопленки роста является создание матрицы внеклеточный полисахарид. Биопленки сотрудничает увеличить сопротивление существующих противогрибковых препаратов, экологический стресс и принимающих иммунные механизмы³.

Биопленки рост C. albicans начинается с раннего приверженность планктонных клеток подложки, следуют размножения дрожжевых клеток через поверхность субстрата и гиф роста. Последний этап биопленки роста является фаза созревания, которой дрожжеподобные развития подавляется, гиф развитие расширяет и внеклеточного матрикса заключает биопленки⁴. C. albicans экзополисахаридов (EPS) в матрице взаимодействуют сформировать Маннан глюкан комплекс^5,6. Взаимодействие между экзополисахаридов имеет решающее значение для обороны биоплёнки против наркотиков⁷. Следовательно уменьшение EPS от C. albicans внеклеточного матрикса могла бы поддержать разработку новых протоколов antibiofilm управление устный кандидоз.

Свет регулирует рост, развитие и поведение нескольких организмов⁸ и она применялась в качестве противомикробного средства в фотодинамической антимикробной химиотерапии (Пакт). Пакт применяется видимого света определенной длины волны и фотосенсибилизатора поглощая свет⁹. Однако фотосенсибилизаторов испытывают трудности в проникающего биопленки, вызывая ниже эффективность¹⁰. Терапевтических агентов неспособность полностью проникнуть биоплёнки причина что биоплёнки иногда противостоять традиционной антибактериальной терапии^3,5. Чтобы деактивировать закрытых микробной клетки, противомикробных препаратов должны проникать через внеклеточная матрица; Тем не менее EPS характеризует диффузионным препятствием для таких молекул, запрашивая их уровень перевозки в биопленки или влияя на ответ антимикробная с самой матрицы¹¹.

Учитывая недостатки Пакт использование света сама по себе выступает как ценный улучшения. Предварительные данные показали, что лечение с голубой свет дважды в день значительно препятствует производства EPS-нерастворимые Streptococcus mutans биопленки. Снижением EPS-нерастворимые синий свет уменьшилась биопленки роста. Тем не менее результаты фототерапии, используя красный свет в C. albicans биоплёнки являются скудными. Таким образом цель данного исследования заключалась в оценке в какой манере фототерапии, используя красный свет влияет на рост и расположение C. albicans биопленки. Два раза в день обращения, мы адаптировали наши лаборатории предыдущих протоколы^9,12 обеспечить легкий и воспроизводимые биопленки модель, которая обеспечивает ответы относительно жизнеспособности, сухой вес и внеклеточных полисахаридов суммы после лечения красный свет. Тот же протокол может использоваться для тестирования других терапий.

протокол

1. Подготовка культуры средств массовой информации

1. Подготовка sabouraud декстроза агар (ПДД). Приостановите 65 g ПДД, дополнена Хлорамфеникол (50 мг/Л) в 1000 мл дистиллированной воды. Варить до растворения среды. Стерилизация автоклавированием при 15 PSI (121° C) для 30 минут остыть до 45-50 ° C. Хорошо перемешать и залить 20 мл ПДД в стерильных пластин Петри (размер: 100 x 15 мм).
2. Подготовка дрожжей азота базы (YNB) среднего дополнена глюкозы 100 мм, смешивая 6.7 g YNB и 18 г декстрозы до 1000 мл ультрачистая вода. Смешать с мешалкой и стерилизовать среды с помощью системы вакуумного фильтра 0.22 мкм.
3. Подготовить RPMI, смешивая 10.4 г RPMI 1640 и 34.32 g 3-(N-Морфолино) propanesulfonic кислота (МОПЫ) до 1000 мл ультрачистая вода. Смешайте в мешалку без тепла и регулировка рН 7, добавив 1 N NaOH (добавить 2 г NaOH до 50 мл ультрачистая вода). Стерилизуйте среды с помощью системы вакуумного фильтра 0.22 мкм.

2. Предварительное посевным материалом и посевным материалом

1. Удалить SN425 C. albicans микроорганизма из морозильной камеры −80 ° C и пусть он разморозить при комнатной температуре. Семян 10 мкл фонда культуры на Петри, содержащие ПДД, дополнена Хлорамфеникол (50 мг/Л). Проинкубируйте чашки Петри высокоусвояемого при 37 ° C в течение 48 часов.
2. После 48 ч инкубации добавьте 10 колоний C. albicans 10 мл дрожжей азота базового среднего (YNB) дополняется 100 мм глюкозы и инкубировать высокоусвояемого при 37 ° C для 16 h для предварительной посевным материалом.
3. После инкубации для 16 h, готовят Инокулянты путем разбавления стартерных культур в свежие среднего YNB дополнена глюкозы 100 мм в 1:10 пропорции (1 мл разбавленной в 9 мл YNB закваски). Измерить первоначальный оптической плотности (OD) на 540 Нм.
4. Инкубировать Инокулянты высокоусвояемого при 37 ° C для 8 h до тех пор, пока штаммы достигают стадии роста среднего журнала и измерить окончательный ОД на 540 Нм. Вычтите последний ОД от первоначального ОД, чтобы проверить, если ОД Инокулянты находятся на стадии роста среднего журнала (8ч., на основе кривых роста на рис. 1).
5. Чтобы достичь посевным материалом с 10⁷ клеток мл^-1, центрифуга посевным материалом для 5 мин при 5500 x g, удалить супернатант и сконцентрировать посевным материалом до половины объема трубы.

3. биопленки и фототерапии

1. Добавьте 1 mL посевным материалом к скважинам 24-ну пенополистирольные плиты. Инкубируйте высокоусвояемого при 37 ° C 90 мин разрешать клеточной адгезии к нижней части скважины.
2. Используйте некогерентный красный свет (см. Таблицу материалы) как источник света с длиной волны 635 ± 10 Нм и фиксированной мощностью 1460 МВт см⁻².
3. Используйте измеритель мощности для измерения плотности мощности света. Экспозиции применяется — 87,6 J см^-2, эквивалентно около 1 мин воздействия. Использовать формулу плотность энергии (Дж/см²) = плотность мощности (W/cm²) x время облучения (s). Примените на расстоянии 5 мм между источником света и биопленки избежать потепления образца.
4. Лечить положительный контроль биоплёнки с 0,12% хлоргексидин за 1 мин и отрицательный контроль биоплёнки с 0,89% NaCl на 1 мин.
5. После лечения Вымойте все биоплёнки дважды с 0,89% раствор NaCl.
6. Добавьте 1 mL RPMI 1640 буферизации с 3-(N-Морфолино) propanesulfonic кислота (МОПЫ) при pH 7 в биопленке и инкубировать пластины при 37 ° C на ночь.
7. Утром, применять же лечение как шаги 3.2 до 3,6, мыть биоплёнки дважды с 0,89% NaCl, добавить новые RPMI буферизации с МОПЫ (1 мл, pH 7) к скважинам и инкубировать высокоусвояемого при 37 ° C.
8. В тот же день, после 6 часов разоблачить биопленке на красный свет. Лечить положительный контроль биоплёнки с 0,12% хлоргексидин за 1 мин и отрицательный контроль биоплёнки с 0,89% NaCl на 1 мин. После лечения Вымойте биоплёнки дважды с 0,89% раствор NaCl.
9. Повторите шаги 3.2-3.8 до достижения 48 h развития биопленки.
   Примечание: В основном, один лечения произойдет в первой половине дня и другой произойдет во второй половине дня в тот же день (кроме 6 h).

4. обработка

1. Добавить 1 мл стерильного 0,89% NaCl в колодец удаление биопленки, царапая его от хорошо с помощью кончика пипетки. Добавьте удаленные биопленки в стерильную пробирку.
2. Добавьте еще 1 мл стерильного 0,89% NaCl в колодец. Поцарапать его снова и добавьте подвеска же трубки для общего объема 2 мл.
3. Образуя колонии единиц (CFU)
   1. Энергично вихрь биопленки подвеска за 1 мин. От биопленки подвеска используйте Алиготе 0,1 мл для последовательного растворения.
   2. Разбавьте биопленки подвеска от 10^-1 до 10^-4 в 0,89% раствор NaCl.
   3. Семян 50 мкл каждого разведения в ПДД пластины и инкубировать пластины при 37 ° C в течение 48 часов.
   4. Подсчет колоний и применить формулу кое/мл = количество колоний x 10ⁿ / q (n = разрежения; q = тома в сеяный).
4. Сухой вес
   1. Взвешивание и метка microcentrifuge трубы.
   2. От биопленки подвеска используйте 0,1 мл для определения сухого веса (биомассы).
   3. Добавить 1 мл абсолютного этанола Алиготе 0,1 мл биопленки и храните его при 20 ° C для 18 h. После 18 часов центрифуги на g 10000 x 10 мин.
   4. Отбросить супернатанта, трубы на эксикатор для сухой образцы на одну неделю и весят microcentrifuge трубы снова.
5. Водорастворимых полисахаридов (ПОБВ) и щелочных растворимые полисахаридов (АМС)
   1. От биопленки подвеска, энергично вихревой оставшуюся часть тома (1,8 мл) за 1 мин и центрифуги на 5500 × g 10 мин при 4 ° C. Хранить супернатант в новой трубки и мыть преципитат дважды с клеток, которые содержат нерастворимых компонентов внеклеточного матрикса с стерильных ультрачистая вода (5500 × g, 10 мин при температуре 4 ° C).
   2. Вновь приостановите содержание нерастворимых в 1,8 мл стерильной сверхчистой воды.
   3. Водорастворимых полисахаридов (ПОБВ)
      Примечание: Выполните этот эксперимент на зонта.
      1. Из сохраненных супернатанта резерв 1 мл раствора для количественного определения водорастворимых полисахаридов (ПОБВ).
      2. Однородный хранимой супернатант за 1 мин. Передача в стерильные пробирки затем добавьте 2.5 тома этанола 95%. Храните трубы для 18 ч при-20 ° C для ПОБВ осадков.
      3. После 18 часов центрифуга трубы на 9500 x g 20 мин при 4 ° C. После центрифугирования отбросить supernatants.
      4. Вымойте образцы три раза с 75% этанола и просушите гранулы. Вновь приостановить лепешка с 1 мл стерильного ультрачистая вода и количественно ПОБВ, с помощью метода фенола серной кислоты.
      5. Использование 0,1% раствор глюкозы (0,01 г глюкозы до 10 мл ультрачистая вода) для стандартной кривой (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 и 25 мкл глюкозы в трубу).
      6. Добавить 200 мкл 5% фенола (2,7 мл 90% фенола 47.3 мл ультрачистая вода) в стеклянной трубки, состоящий из 200 мкл пример или калибровочной кривой точки (в трех экземплярах на сэмпл) и осторожно перемешать.
      7. Добавить 1 мл серной кислоты на трубу и перемешать. Подождите 20 минут для реакции и измерения образцов, используя спектрофотометр (490 Нм).
   4. Щелочно растворимые полисахаридов (АМС)
      Примечание: Выполните этот эксперимент в зонта.
      1. Из суммы нерастворимых вновь приостановлено отдельные 1 мл для определения осины. Центрифуга аликвоты каждого биопленки подвеска (13 000 x g, 10 минут при температуре 4 ° C).
      2. Осторожно удалите супернатант каждой трубы. Затем поместите образцы на вакуумные концентратор чтобы высушить гранулы.
      3. Взвешивания гранул и 300 мкл 1 N NaOH (2 г NaOH до 50 мл сверхчистой воды) на 1 мг сухого веса. Проинкубируйте 2 ч при 37 ° C и затем центрифуги на 13 000 × g за 10 мин.
      4. Осторожно Соберите supernatants с пипеткой и передачи microcentrifuge трубы, поддержание гранулы.
      5. Еще раз добавить равное количество 1 N NaOH в трубы, состоящий из гранул и повторите шаги выше для извлечения ASP.
      6. После инкубации в течение 2 ч Центрифугуйте образцы (13 000 x g 10 мин), тщательно собирать supernatants и добавить ранее собранные supernatants.
      7. Для извлечения третьего повторите те же шаги, что и выше, но на этот раз, не Проинкубируйте образцы за 2 ч до центрифугирования.
      8. После этого добавьте три тома этанола 95% для каждого образца. Затем фондовый образцы −20 ° C для 18 h для осадков ASP.
      9. Центрифуга для труб (9500 × g 20 мин при температуре 4 ° C) и отбросить supernatants.
      10. Мыть каждый Пелле три раза с 75% этанола и просушите (те же процедуры сделал для WSP). Вновь приостановите гранулы в равных общий объем добычи первой с 1 N NaOH.
      11. Прочитайте образцы для количественной оценки ASP с помощью фенола серной (то же, что касается анализа WSP).

Результаты

Рисунок 2 отображает результаты журнала₁₀ кое/мл C. albicans после суточных лечения с красный свет, красный свет 1 мин значительно уменьшена в журнал₁₀ кое/мл, по сравнению с NC (p = 0,004). Рисунок 3 представлены результаты биомассы (?...

Обсуждение

Наиболее важные шаги для успешного культивирования C. albicans биопленки являются: 1) сделать предварительно посевным материалом и посевным материалом в среде YNB дополнена глюкозы 100 мм; 2) чтобы подождать 90 мин для этапа адгезии и тщательно мыть дважды скважин с 0,89% NaCl для удаления непри?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clorhexidine 20%	Sigma-Aldrich	C9394
Dextrose (D-Glucose) Anhydroous	Fisher Chemical	D16-500
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories	DSP-MD.43
LumaCare LC-122 A	LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA
NaCl	Fisher Chemical	S641-500
NaOH	Fisher Bioreagents	BP 359-500
Phenol 5%	Milipore Sigma	843984
RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)	Sigma	R7755
Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol	Acumedia	7306A
Sulfuric acid	Fisher Chemical	SA200-1
Yeast nitrogen base	Difco	DF0392-15-9
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
24-well polystyrene plate	Falcon	353935