규제 Candida albicans Biofilm 성장에 붉은 빛으로 매일 광선 요법

요약

여기, 선물이 Candida albicans biofilm의 성장에 레드 빛 응용 프로그램의 결과 평가 하는 프로토콜. 635 nm의 파장 및 87.6 J·cm^-2 의 에너지 밀도와 비 코히어런트 레드 라이트 장치 48 h에 대 한 칸디 다 albicans biofilms의 성장에 걸쳐 적용 되었다.

초록

여기, 선물이 Candida albicans biofilm의 성장에 일당 빨간 불 치료의 결과 평가 하는 프로토콜. C. albicans SN425의 planktonic 성장, 증가 하는 inoculums 효 모 질소 기지 미디어에 성장 했다. Biofilm 형성에 대 한 아미노산의 높은 농도가지고 RPMI 1640 미디어 biofilm 성장 수 있도록 적용 되었다. 48 h의 Biofilms 비 코히어런트 빛 장치로 1 분 동안 하루에 두 번을 치료 했다 (붉은 빛, 파장 = 635 nm; 에너지 밀도 = 87.6 J·cm^-2). 긍정적인 통제 (PC), 0.12% 액체 (CHX) 적용, 그리고 부정적인 제어 (NC), 0.89 %NaCl biofilms에 적용 했다. 콜로 니 형성 단위 (CFU), 건조 중량, 가용성과 불용 성 exopolysaccharides 치료 후 계량 했다. 간단히, 여기에 제시 된 프로토콜 간단 하 고 재현성 및 빨간 불 치료. 후 드라이 무게와 세포 외 다 당 류 금액, 생존 능력에 대 한 답변을 제공 합니다.

서문

Candida albicans 의 발생률을 증가 하는 당뇨병, 면역 억제 치료 응용 프로그램, HIV 감염, 에이즈, 침략 적 임상 절차 및 과거 년에 있는 넓 스펙트럼 항생제 소비의 발생률이 증가 관련 질병^1,2. C. albicans 감염 biofilm 개발 관련 일반적으로 그리고 임상 발현, 칸디 다 증, 또는 candidemia^1,2등 조직 발현 등을 일으킬 수 있습니다. Biofilm 성장의 가장 주목할 만한 독성 요인 중 하나는 세포 외 다 당 류 매트릭스 설립 이다. Biofilm 형성 기존 항진균 약물, 환경 스트레스, 그리고 호스트 면역 메커니즘³에 저항을 증가 협력.

C. albicans 의 biofilm 성장을 planktonic 셀의 초기 부착 기판, 기판 표면, 및 hyphal 성장을 통해 효 모 세포의 전파에 의해 뒤에 시작 됩니다. Biofilm 성장의 마지막 단계 성숙 단계, 어떤 점에서 효 모와 같은 개발 억제, hyphal 개발 확장 되 고 세포 외 매트릭스 포함 biofilm⁴입니다. C. albicans exopolysaccharides (EPS) 행렬에서 mannan-글 루 칸 복잡 한^5,6를 상호 작용 합니다. Exopolysaccharides의 상호 작용은 약⁷에 biofilms의 방어에 대 한 중요 합니다. 따라서, C. albicans 기질에서 EPS의 감소는 구강 칸디 다 증 제어를 위한 새로운 antibiofilm 프로토콜의 개발을 지원할 수 있습니다.

빛 조절 성장, 개발, 및 여러 생물⁸ 의 행동 그리고 photodynamic 항균 화학요법 (협정)에 항균으로 적용 되었습니다. 협정에는 특정 파장의 빛을 흡수 photosensitizer⁹가시 광선 적용 됩니다. 그러나,는 photosensitizers 낮은 효능¹⁰를 일으키는 biofilm, 침투에 어려움이 있다. 완전히 침투 biofilms 치료제의 실패는 biofilms 때때로 전통적인 항균 치료^3,5저항 하는 이유입니다. 동봉 된 미생물 세포를 비활성화 하려면 제 기질; 통해 침투 필요 그럼에도 불구 하 고, EPS는 biofilm에 운송의 그들의 수준을 자극 하거나¹¹자체 매트릭스와 항균의 응답에 영향을 미치는 이러한 분자에 대 한 diffusional 장애물을 특징.

협정의 단점을 고려 하면 자체적으로 빛의 사용 가치 개선으로 나온다. 예비 데이터는 하루에 두 번 블루 빛으로 치료 크게 구 mutans biofilm에 EPS-불 용해성의 생산을 저해 밝혔다. EPS-불 용해성의 감소, 블루 빛 biofilm 성장을 저하. 그럼에도 불구 하 고, C. albicans biofilms에 붉은 빛을 사용 하 여 광선 요법의 결과 부족 한. 따라서,이 조사 목표는 붉은 빛을 사용 하 여 어떤 방식으로 광선 요법 성장과 C. albicans biofilm의 영향에 평가 했다. 매일 두 번 치료를 위해 우리는 우리 실험실의 이전 프로토콜^9,12 , 생존 능력에 대 한 답변을 제공 하는 간단 하 고 재현성 biofilm 모델을 제공 적응 드라이 무게와 세포 외 다 당 류 빨간 불 치료. 후 금액 다른 치료법을 테스트 하기 위해 동일한 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1입니다. 배양 기의 준비

1. Sabouraud 포도 당 한 천 (SDA)를 준비 합니다. SDA 페니 (50 mg/L) 1000 ml 증류수의 보충의 65 g을 일시 중단 합니다. 매체를 완전히 분해를 끓인 다. 30 분 쿨 45-50 ° c에 대 한 15 PSI (121 ° C)에 압력가 마로 소독 하 여 소독 잘 혼합 하 고 멸 균 페 트리 접시에 SDA의 20 mL를 붓고 (크기: 100 m m x 15 m m).
2. 준비 효 모 질소 기본 (YNB) 매체 100 mM 포도 당 6.7 g YNB 및 초순 물 1000 mL에 포도 당의 18 g을 혼합 하 여 보충 합니다. 교 반기를 사용 하 여 혼합 하 고 매체 0.22 μ m 진공 필터 시스템을 사용 하 여 소독.
3. RPMI RPMI 1640 그리고 34.32 g 3-(N-morpholino) 10.4 g을 혼합 하 여 준비 propanesulfonic 산 (MOPS) 초순 물 1000 mL. 열 없이 교 반기에서 혼합 하 고 1 N NaOH (초순 물 50 mL에 NaOH의 추가 2 g)를 추가 하 여 7 pH를 조정. 0.22 μ m 진공 필터 시스템을 사용 하 여 매체를 소독.

2. 사전 inoculum 및 inoculum

1. C. albicans SN425 미생물 −80 ° C 냉동 고에서 제거 하 고 주위 온도에 녹여 보자. SDA 페니 (50 mg/L) 보충을 포함 하는 배양 접시에 재고 문화 10 µ L 씨 48 h에 대 한 37 ° C에서 aerobically 페 트리 접시를 품 어.
2. 외피의 48 h 후 C. albicans 의 10 식민지 효 질소 기본 (YNB) 매체 100 mM 포도 당 보충 aerobically 사전 inoculum 16 h 37 ° C에서 품 어의 10 mL를 추가 합니다.
3. 16 h, 준비는 inoculums 1시 10분에서 100 mM 포도 당으로 보충 하는 신선한 YNB 매체에 스타터 문화를 diluting 하 여 대 한 잠복기 후 비례 (1 mL YNB 9 mL에 희석 시 동기 문화). 540에서 측정 하는 초기 광학 밀도 (OD) nm.
4. 긴장과 중간 로그 성장 단계에 도달 540에서 최종 OD를 측정 될 때까지 aerobically 8 h 37 ° C에서 inoculums를 품 어 nm. 중간 로그 성장 단계 ( 그림 1의 성장 곡선에 따라 8 h)에 inoculums의 세 인지 확인 하는 초기 OD에서 최종 OD를 뺍니다.
5. 10⁷ 셀 mL^-1와 inoculum 도달, 5500 x g에 5 분 동안 inoculum을 원심 하 고 삭제는 상쾌한 튜브의 볼륨의 절반을 inoculum을 집중.

3. Biofilm 형성 및 광선 요법

1. 24 잘 폴리스 티 렌 격판덮개의 우물에는 inoculum의 1 mL를 추가 합니다. Aerobically 우물의 바닥에 세포 접착 수 있도록 90 분 동안 37 ° C에서 품 어.
2. 비 일관 된 레드를 사용 하 여 ( 재료의 표참조) 635 ± 10 nm의 파장 및 1,460 mW cm⁻²의 고정된 출력 광원으로 빛.
3. 전력 측정기를 사용 하 여 빛의 전력 밀도 측정. 눈부신 노출 적용은 87.6 J c m^-2, 노출의 약 1 분에 해당입니다. 에너지 밀도 (J/c m²) 수식을 사용 하 여 = 조사 시간 (s) x 전력 밀도 (W/c m²). 광원 및 샘플 온난화 방지 하려면 biofilm 사이 5 밀리미터의 거리를 적용 합니다.
4. 치료 1 분 0.12% 액체와 긍정적인 제어 biofilms 부정적인 제어 biofilms 0.89% NaCl 1 분.
5. 치료 후 모든 biofilms 0.89 %NaCl 용액으로 두 번 씻는 다.
6. 3-(N-morpholino) 버퍼링 RPMI 1640의 1 mL을 추가 biofilms에 pH 7에서의 propanesulfonic 산 (MOPS) 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어 고.
7. 3.2에서 3.6 단계 세척 0.89%로 두 번 biofilms 동일한 치료 적용 아침에, NaCl, 새로운 RPMI 우물 MOPS (1 mL, pH 7)와 버퍼를 추가 하 고 aerobically 37 ° c.에 품 어
8. 같은 날, 6 h 후에 레드 빛 biofilms 노출. 치료 1 분 0.12% 액체와 긍정적인 제어 biofilms 부정적인 제어 biofilms 0.89% NaCl 1 분. 치료 후 biofilms 0.89 %NaCl 용액으로 두 번 씻는 다.
9. Biofilm 개발의 48 h 달성까지 3.2-3.8 단계를 반복 합니다.
   참고: 기본적으로, 1 개의 치료는 아침에 일어날 것 이다와 다른 하나 (떨어져 6 h) 같은 날 오후에 일어날 것 이다.

4입니다. 처리

1. 추가 1 mL 균 0.89%의 NaCl 잘 하는 biofilm는 잘 사용 하 여 피 펫 팁에서 그것을 긁어서 제거 하. 살 균 튜브를 제거 biofilm를 추가 합니다.
2. 살 균 0.89%의 또 다른 1 mL을 추가 잘 NaCl. 다시 긁 고 2 mL의 전체 볼륨에 대 한 같은 튜브에 정지를 추가 합니다.
3. 콜로 니 형성 단위 (CFU)
   1. 적극적으로 소용돌이 1 분 biofilm 정지입니다. Biofilm 정지에서 0.1 mL의 약 수를 사용 하 여 직렬 희석에 대 한.
   2. 0.89 %NaCl 용액에 10^-4 10^-1 에서 biofilm 정지 희석.
   3. SDA 번호판 각 희석의 50 μ 씨 하 고 48 h에 대 한 37 ° C에서 번호판을 품 어.
   4. 식민지를 계산 하 고 적용 하는 수식 CFU/mL = 식민지 x 10ⁿ 의 수 / q (n = 희석; q = 시드 볼륨).
4. 건조 중량
   1. 무게 및 레이블 microcentrifuge 튜브입니다.
   2. Biofilm 정지에서 0.1 mL를 사용 하 여 건조 중량 (바이오 매스) 결정에 대 한.
   3. 절대 에타 놀의 1 mL는 biofilms의 0.1 mL의 약 수를 추가 하 고 18 h-20 ° C에서 그것을 저장. 후 18 h 10 분에 대 한 10000 x g 에서 원심.
   4. 상쾌한, 튜브를 1 주일에 대 한 샘플을 건조 하 고 다시 microcentrifuge 튜브 무게 desiccator에 장소.
5. 수용 성 다 당 류 (WSPs)와 알칼리 수용 성 다 당 류 (Asp)
   1. Biofilm 서 스 펜 션, 적극적으로 소용돌이 1 분 및 4 ° c.에서 10 분 동안 5500 × g 에서 원심 분리기 (1.8 mL) 볼륨의 나머지에서 새로운 튜브에는 상쾌한을 저장 하 고 두 번 불 임 초순 (5500 × g, 4 ° C에서 10 분)와 세포 외 매트릭스의 불용 성 성분 포함 하는 셀으로 침전을 세척.
   2. 다시 살 균 초순의 1.8 mL에 불용 성 콘텐츠를 일시 중단 합니다.
   3. 수용 성 다 당 류 (WSPs)
      참고: 증기 두건에서이 실험을 수행 합니다.
      1. 저장 된 상쾌한에서 수용 성 다 당 류 (WSPs)의 정량화에 대 한 1 mL를 보유 합니다.
      2. 1 분 동안 저장된 상쾌한 균질 다음, 무 균 튜브에 전송 하 고 95% 에탄올의 2.5 볼륨을 추가 합니다. WSPs 강 수를 위해-20 ° C에 18 h에 대 한 튜브를 저장 합니다.
      3. 18 h 후 4 ° c.에 20 분 9500 x g 에서 튜브 원심 원심, 후는 supernatants 삭제 합니다.
      4. 세 번 75% 에탄올과 샘플을 세척 하 고 알 약을 건조. 다시 살 균 초순 물의 1 mL와 펠 릿을 일시 중단 하 고 페 놀 황산 산 메서드를 사용 하 여 WSP 계량.
      5. 0.1% 포도 당 (포도 당 초순의 10 mL를의 0.01 g)을 사용 하 여 표준 곡선 (0, 2.5, 5, 10, 15, 20, 및 25 µ L 튜브 당 포도 당의).
      6. 구성 된 샘플의 200 µ L 유리 튜브에 5% 페 놀 (초순의 47.3 mL에 페 놀 90%의 2.7 mL)의 200 µ L를 추가 또는 표준 곡선 (샘플 당 3 중)에서 조심 스럽게 섞는다.
      7. 관에 황산 1 mL를 추가 하 고 섞으십시오. 반응에 대 일 분 기를 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플을 측정 (490 nm).
   4. 알칼리 수용 성 다 당 류 (Asp)
      참고: 증기 두건에서이 실험을 수행 합니다.
      1. 불용 성 다시 일시 중단 된 금액에서 Asp의 결정에 대 한 1 mL을 구분 합니다. 각 biofilm 정지 (13000 x g, 4 ° C에서 10 분)의 aliquots 원심
      2. 각 튜브의 상쾌한을 조심 스럽게 제거 합니다. 다음 건조 한 펠 릿을 진공 집중 장치에 샘플을 놓습니다.
      3. 알 약을 무게 고 건조 중량의 1 밀리 그램 당 1 N NaOH 초순 물 50 mL에 NaOH (2 세대)의 300 µ L를 추가 합니다. 37 ° C에서 2 시간에 대 한 그들을 품 어 그리고 10 분 13000 × g 에서 원심.
      4. 신중 하 게 microcentrifuge 튜브, 펠 릿을 유지 하는 피 펫 및 전송 supernatants를 수집 합니다.
      5. 다시 한번, 펠 릿, 구성 된 튜브에 1 N NaOH의 동일한 볼륨을 추가 하 고 ASP의 추출에 대 한 동일한 단계를 위의 반복.
      6. 2 h에 대 한 보육, 후 원심 샘플 (13000 x g 10 분 동안) 신중 하 게는 supernatants 수집 하 고 이전에 수집한 supernatants에 추가.
      7. 세 번째 추출에 대 한 하지만이 시간, 위에 같은 단계를 반복, 원심 분리 하기 전에 2 시간에 대 한 샘플을 품 어 하지 마십시오.
      8. 나중에, 각 샘플에 95% 에탄올의 3 개의 볼륨을 추가 합니다. 그런 다음 −20 ° C 18 h ASP의 강수량에 대 한 샘플 재고.
      9. Centrifuge 튜브 (9500 × g 4 ° C에서 20 분) 하 고는 supernatants 삭제.
      10. 각 펠 릿 75% 에탄올으로 세 번 세척 하 고 건조 (동일한 절차는 WSP 위해 했다). 다시 1 N NaOH와 함께 첫 번째 추출의 동등한 총 볼륨에 펠 릿을 일시 중단 합니다.
      11. 페 놀 황산을 사용 하 여 ASP의 정량화에 대 한 샘플을 읽고 (WSP 분석에 관해서는 같은).

결과

그림 2 1 분 빨간 불 로그₁₀ CFU/mL는 NC에 비해 감소에 대 한 레드 빛 당 일당 치료 후 로그₁₀ CFU/mL C. albicans 의 결과 표시 (p = 0.004). 그림 3 은 매일 처리 후 C. albicans biofilms의 바이오 매스 (mg)의 결과 제공합니다. 모든 처리 그룹은 NC에 비해 바이오 매스의 감소를 보였다 (p = 0.000) 붉은 빛 처리는 PC에서 ?...

토론

C. albicans biofilm의 성공적인 경작을 위해 가장 중요 한 단계는: 1) 사전 inoculum YNB 중 포도 당 100 mM;와 보완 inoculum을 할 2)를 접착 단계에 대 일 분을 기다려야 하 고 신중 하 게 씻어 두 번 0.89% 우물 NaCl 준수 비 세포;를 제거 하 그리고 3) RPMI 매체 RPMI 균 성장 자극 것 이후 biofilm 형성을 시작 하는 준수 셀에 추가 하려면. Aneuploidies C. albicans를 경작 하는 경우 발생할 수 있습니다. 따라서, 7 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clorhexidine 20%	Sigma-Aldrich	C9394
Dextrose (D-Glucose) Anhydroous	Fisher Chemical	D16-500
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories	DSP-MD.43
LumaCare LC-122 A	LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA
NaCl	Fisher Chemical	S641-500
NaOH	Fisher Bioreagents	BP 359-500
Phenol 5%	Milipore Sigma	843984
RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino)	Sigma	R7755
Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol	Acumedia	7306A
Sulfuric acid	Fisher Chemical	SA200-1
Yeast nitrogen base	Difco	DF0392-15-9
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS	Sigma-Aldrich	M1254
24-well polystyrene plate	Falcon	353935