Β-Arrestin2 Ligand Tarama için PRESTO-Tango Tetkik ini Kullanarak GPCR-Geniş Ölçekte İşe Alımın Paralel Sorgulaması

Özet

GPCR'lerin cazip ilaçlanabilir hedefler olduğu göz önüne alındığında, GPCR ligand taraması böylece kurşun bileşiklerinin belirlenmesi ve yetimleşme çalışmaları için vazgeçilmezdir. Bu çalışmalara yönelik olarak, TEV tabanlı bir muhabir tsay'ı kullanarak yaklaşık 300 KPCR'de geçici β-arrestin2 alımının eşzamanlı olarak profilini çıkarmak için kullanılan açık kaynak kaynak platformu PRESTO-Tango'u tanımlıyoruz.

Özet

Hücresel sinyal yollarının en büyük ve en çok yönlü gen superfamily ve arabulucuları olarak, G-protein-coupled reseptörleri (GPCR) ilaç endüstrisi için en umut verici hedeflerinden birini temsil eder. Ergo, gpcr ligand tarama testlerinin tasarımı, uygulanması ve optimizasyonu çok önemlidir, çünkü ilaç keşfi ve GPCR farmakolojisi ve sonuçlarını manipüle etmek için uzaktan kumanda araçlarını temsil etmektedirler. Geçmişte, G-protein bağımlı tahliller, ligand kaynaklı olayları tespit ve ikincil habercilerin nesil ölçme, araştırma bu alanda tiplenmiş. Ancak, fonksiyonel seçicilik gelişiyle, yanı sıra diğer birçok G protein-bağımsız yollar ve G-protein bağımlı tahliller ile ilişkili sınırlamalar artan bir farkındalık bu yana, alternatif oluşturulması yönünde daha büyük bir itme var GPCR ligand tarama tahlilleri. Bu çabaya doğru, böyle bir kaynağın uygulanmasını, PRESTO-Tango platformunun, insan GPCR-ome'nin paralel ve eşzamanlı sorgulamasını sağlayan, daha önce düşünülen bir başarıolan, teknik ve ekonomik açıdan mümkün değildir. G-protein bağımsız β-arrestin2 işe alım testini temel alan, GPCR'lerde β-arrestin2 aracılı insan ticaretinin ve sinyalizasyonunun evrenselliği, PRESTO-TANGO'yu yaklaşık 100'ü dahil olmak üzere yaklaşık 300 omalımsız insan KPCR'ı incelemek için uygun bir araç haline getirir. yetim reseptörleri. PRESTO-Tango'nun duyarlılığı ve sağlamlığı, bilinen ilaçlar için yeni GPCR hedeflerini ortaya çıkarmak veya yetim reseptörleri için yeni ligandlar keşfetmek için kullanılan bileşik kütüphaneleri kullanarak birincil yüksek iş yapma ekranları için uygun hale getirir.

Giriş

G-protein-coupled reseptörleri (GpPCR) transmembran proteinlerin en büyük ve en çeşitli aile oluşturmaktadır, bir hücre ve çevresi arasında iletişim arabirimleri olarak faaliyet^1. GPCR çok yönlülük ligands çeşitli bir dizi tespit yeteneği ile vurgulanır-nörotransmitterlerden nükleotitler için, peptidler fotonlara, ve daha birçok-yanı sıra çok sayıda aşağı sinyal çağlayanlar hücresel büyüme, göç, farklılaşma, apoptosis, hücre ateş, vb^2,3. Fizyolojik süreçlerin çok sayıda onların her yerde ve katılımı göz önüne alındığında, bu reseptör ailesi son derece terapötik öneme sahiptir, şu anda mevcut reçete li ilaçların üçte birinden fazla hedef GPCRs⁴gerçeği ile vitrine . Ancak, bu mevcut terapötikler sadece süper ailenin küçük bir alt kümesini hedeflemektedir (%10) ve birçok GPCR'nin farmakolojisi henüz aydınlatılmamıştır. Ayrıca, 100'den fazla PcPCR yetim reseptörleri olarak var, onlar endojen ligand⁵ile eşleşen olmamıştır gibi. Bu nedenle, GPCR ligand taraması deorphanization ve ilaç gelişiminde kritik, kurşun bulma ve optimizasyon yolunda yol açar gibi, ve muhtemelen klinik deneme aşamasına.

GPCR ligand tarama yöntemleri geleneksel olarak g-protein bağımlı veya G-protein bağımsız fonksiyonel tahliller⁶olmak üzere iki kategoriden birine düşmüştür. GPCR sinyalizasyonu heterotrimerik G proteinleri (Gαβγ) tarafından düzenlenir ve Gα alt birimi^7'yebağlı GSYİh için GTP değişimi ile aktive edilir. Aktif reseptörden gelen sinyaller, cAMP, Kalsiyum, DAG ve IP3 gibi ikincil haberciler aracılığıyla G-proteinleri tarafından transeyoluyla downstream efektörleri^8'deaşağı sinyalizasyona aracılık eder. G-protein sinyalinin fonksiyonel sonuçlarının doğası, reseptör aktivasyonunu yansıtan hücre bazlı tahliller oluşturmak için kullanılmıştır. G-protein sinyalizasyonunda proksimal (doğrudan) veya distal (dolaylı) olayları ölçen bu yöntemler en sık GPCR ligand taraması nda kullanılırve esas olarak deorphanization çalışmalarında 6. GPCR aracılı G-protein aktivasyonunu doğrudan ölçen tahlil örnekleri arasında [35S]GTPγS bağlayıcı tahlil, gα alt ünitesine radyoetiketli ve hidrolize edilemeyen GTP analogunun ve Förster/biyolüminesans rezonans enerji transferinin (FRET/BRET, sırasıyla) gpcr-Gα ve Gα/Gγ etkileşimlerini izlemek için 9^,10yıliçinde daha fazla çekiş elde eden probların bağlanmasını ölçen. Distal olayları izlemek GPCR profilleme için en yaygın olarak kullanılan araçlar olduğunu tahliller; örneğin, cAMP ve IP1/3 tahlilleri G-proteinbağımlı ikincil habercilerin hücre içi birikimini ölçerken, [Ca²⁺] akı ve G-protein aktivasyonuna karışan spesifik yanıt öğelerini içeren muhabir tahlilleri (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) sinyalleri veren basamak^11'indaha aşağısındaki olayları inceler. Söz konusu tahlillerin çoğu yüksek iş seviyesi düzeyinde gerçekleştirilebilse de, oldukça hassas, ve bazı tasmaya özgü avantajları övünme (örneğin, gtpγs bağlama durumunda tam / kısmi agonistler, nötr antagonistler ve ters agonistler arasında ayrımcılık, ya da [Ca^{2 +}] ve IP1/3 gibi canlı hücrelerde gut işlevselliği)⁶, ne yazık ki tüm ilaç GPCR-ome sorgulama uygun mevcut G-protein bağımlı yöntemler vardır. Bu büyük ölçüde birden fazla G-protein alt ailelerin In GPCR yerli kaplin kaynaklanmaktadır, birkaç basamaklı ve yetim G-protein kaplin de bilinmeyen G-protein kaplin sinyal sonuçlanan. Bu sorunu azaltmak için, tahliller promiscuous G-protein kaplin cAMP gibi tek bir ortak sinyal okuma yoluyla zorlamak için geliştirilmiştir, ve Ca^{2 +}, çoğu düşük iş gücü¹²olsa .

GPCR yaşam döngüsünün önemli bir yönü G-proteinbağımlı sinyalizasyon sona erdirilmesi, büyük ölçüde G-protein ayrıştırma neden β-arrestins işe yoluyla oluşur, ve sonuçta reseptör duyarsızlaştırma, hangi clathrin kaplı internalization için hedeflenen¹³. Β-arrestinin en yaygın olarak ifade edilen isoformları görsel olmayan β-arrestin1 ve β-arrestin2'dir, ayrıca sırasıyla arrestin-2 ve arrestin-3 olarak da belirtilir,^{sırasıyla 14}. GPCR ligand taramasına yeni bir boyut katan G-protein bağımsız hücre bazlı tahliller girin; reseptör ticareti, etiketsiz tüm hücre ve β-arrestin işe alım tahlilleri dikkate değer örneklerdir. GPCR kaçakçılık tahlilleri reseptör¹⁵hedefleyen florofor etiketli ligands veya ko-internalize antikorlar istihdam ederken, etiketsiz tüm hücre tahlilleri ligand tarafından indüklenen hücresel değişiklikleri çevirmek biyosensörler kullanın ölçülebilir çıkışlar, elektrik veya optik sinyaller gibi¹⁶. Özellikle, quintessential GPCR- β-arrestin etkileşimleri, fonksiyonel tahlillerin repertoiresinde çekici bir araç olarak β-arrestin işe alım tahlillerini moda eder¹⁷. İlk olarak Barnea ve ark. tarafından sadece on yıl önce geliştirilen Tango sistemi, üç eksojen genetik elementin tanıtılmasını içerir: β-arrestin2'den oluşan bir protein füzyonu tütün etch virüs proteazı (TEVp), bir tetrasiklin transaktivator (tTA) tütün etch ile GPCR'ye bağlanır. virüs proteaz dekolte sitesi (TEVcs) ve V2 vazopressin reseptörünün C-terminus bir dizi öncesinde (V2 kuyruk) işe tutuklama teşvik etmek, ve transkripsiyon tarafından tetiklenen bir muhabir luciferase gen β-arrestin2 işe alımını takiben membran demirlemeden serbest bırakılan çekirdeğe tTA transkripsiyon faktörü translokasyonu (Şekil 1)¹⁸. GPCR aktivasyonu ve β-arrestin2 işe kantitatif okumalar daha sonra lüminesans için okuma ile belirlenebilir. Önemli bir ayrım reseptör ticareti ve etiketsiz tüm hücre yöntemleri nispeten düşük iş akışı iken, Tango çeşitli avantajları vardır, hedef reseptör ve sinyal entegrasyonu nedeniyle duyarlılık özgü seçici okuma dahil olmak üzere, hangi daha büyük bir ölçekte ligand tarama için uygun bir aday yapmak¹⁸.

Kroeze ve ark. bu stratejik özellikler göz önüne alındığında, PRESTO-Tango (Transkripsiyonel Çıktı-Tango ile Paralel Reseptör-ome İfade ve Tarama), paralel ve eşzamanlı bir şekilde ilaçlanabilir GPCR-ome profili tango yaklaşımını kullanan bir yüksek verim açık kaynak platformu¹⁹geliştirdi. Neredeyse tüm GPCR'lere β-arrestin2'nin "promiscuous" işe alımını kullanan PRESTO-Tango, hücre bazlı fonksiyonel tahliller açısından türünün ilk türünün ilk günüdür ve yetimler de dahil olmak üzere, G-protein alt familya bağlantısından bağımsız olarak küçük molekül bileşiklerinin hemen hemen tüm koku dışı KPCR'larda hızlı "ilk tur" taranmasını sağlar.

Protokol

1. Birincil tarama: hücre kültürü ve plaka tohumlama

1. Poli-L-lizin (PLL) kaplamalı plakalar hazırlamak için, elektronik çok kanallı pipet veya reaktif dispenser kullanarak beyaz veya siyah 384 kuyulu optik alt plakalarda 25 μG/mL pll pll stok çözeltisi dağıtın. Plakaları oda sıcaklığında 0,5-2 saat kuluçkaya yatırın.
   NOT: Siyah 384-kuyu plakaları kullanıyorsanız, arka plan sinyalinin beyaz plakalara göre daha düşük olmasını bekleyin. Siyah plakalar bitişik kuyular arasında parlaklık kanamasını azaltmak için tavsiye edilir.
2. Kaplamalı plakaları korumak ve fazla PLL'yi yıkamak için PLL'yi lavabonun üzerine itiştirerek çıkarın, kağıt havlunun üzerine kuru dokunun ve elektronik çok kanallı pipet veya reaktif dağıtıcıkullanarak 40 μL/iyi seyreltilmiş 1x antibiyotik-antimikotik çözelti ekleyin. PLL kaplı tabakları 4 °C'de tabak tohumlama için hazır olana kadar saklayın.
3. HTLA hücrelerini (dr. Richard Axel tarafından sağlanmaktadır)–β-arrestin2-TEV ve tTA güdümlü luciferase'i tam olarak ifade eden bir insan embriyonik böbrek hücre hattı (HEK293T) -Dulbecco'nun modifiye kartal ortamının (DMEM) Fetal Sığır Serumunun %5'i ile desteklenmiş, %5'i Büyükbaş Buzağı Serumu, 2,5 μg/mL puromisin, 50 g/mL higromisin, 100 U/mL penisilin ve %5 CO₂içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de 100 μg/mL streptomisin .
4. Kültür HTLA hücreleri 150 mm tabaklarda ve 5-25 optimal hücre geçiş sayısı ile, 1:10 bir seyreltme faktörü haftada iki kez hücreleri geçmek. Birincil ekranın ölçeğine bağlı olarak 384 kuyulu tabak tohumlama gününde yeterli sayıda 150 mm'lik tabakların etkili olduğundan emin olun.
   NOT: 25 no'dan büyük HTLA hücrelerinin kullanımı canlılığın azalmasına ve optimal olmayan sonuçlara yol açabilir.
5. Birincil ekran için HTLA hücrelerini tohumlamak için, 150 mm'lik kabı (es) 1x fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 ile hafifçe durulayın. Yaklaşık 6 mL trypsin/0,53 mM EDTA olan hücreleri ayırın ve tripsini nötralize etmek için en az eşit miktarda tam Dulbecco modifiye Kartal ortamı (DMEM) içeren bir santrifüj tüpüne aktarın.
6. HTLA hücrelerini 500 x g'de 3 dk'da döndürün ve hücre peletini tam DMEM'de 0,22 x 10⁶ hücre/mL yoğunlukta yeniden askıya alın, 2,5 g/mL puromisin ve 50 g/mL higromisin ilavesini atlayın, transfeksiyon etkinliğini azaltabilirler.
7. Hücreleri tohumlamadan önce ısıtmak için gerekli 384 kuyulu PLL kaplı plakaları 37 °C'de kuluçkaya yatırın. 384 kuyulu PLL kaplı plaka(lar)dan 1x antibiyotik antimikotik depolama çözeltisini lavabonun üzerine sallama ve kuruması için kağıt havlunun üzerine bantlayarak çıkarın.
8. 0,22 x 10⁶ hücre/mL HTLA süspansiyonun 45 μL'sini elektronik çok kanallı pipet kullanarak 45 μL'lik bir şekilde 10.000 hücre/kuyu luk son yoğunlukta 384 kuyulu PLL kaplı plakalara yerleştirin. Bir gecede 37 °C'de kuluçka plakaları. Aynı gün transfeksiyon tercih edilirse, 16.000 hücre/kuyu yoğunluğundaki tohum hücreleri ve transfeksiyon4 saat sonra yapılır.
   NOT: Yüksek transfeksiyon verimliliği için hücre birleşimi %50-70 en uygun uymaktadır.

2. Birincil tarama: DNA plakası hazırlama ve transfeksiyonlar

1. Şekil 2'degösterildiği gibi 384 kuyulu DNA kaynak plakasını transfeksiyon için hazırlamak için, GPCR-Tango'yu kodlayan plazmid cDNA'larını 96 kuyulu bir plakada farklı bir GPCR/kuyuile dağıtın. Plazmid DNA 50 ng/μL konsantrasyonda 0.1x Tris-EDTA (TE) tamponunda askıya alınmalıdır.
   NOT: 96 kuyulu DNA plakaları -20 °C'de mühürlenebilir ve saklanabilir ve birden fazla tarama deneyi için yeniden kullanılabilir. Tüm cDNA kodlama GPCR-Tango yapıları ticari olarak mevcuttur (Malzemeler Tablosubakınız) ve pcDNA3.1 neomisin plazmid klonlanır. PRESTO-Tango GPCR Kiti, her biri 80 GPCR, negatif kontroller olarak boş vektörlü bir çift kuyu ve dopamin reseptörü D2 'yi (DRD2) tutan pozitif kontrol kuyuları ve transfeksiyon verimliliğini izlemek için floresan protein (YFP) kodlayan bir plazmid taşıyan kuyuları içeren dört adet 96 kuyuluk plakadan oluşur.
2. Çok kanallı bir pipet kullanarak, DNA çözeltisini 96 kuyudan 384 kuyulu DNA kaynak plakasına manuel olarak aktarın ve 384 kuyubaşına 10°L ilave edin. Deneyin her koşulunun dörtlü olarak incelendiğinden emin olmak için, 96 kuyulu DNA plakasının (A-D veya E-H satırları) yarısı, her GPCR'yi iki kadranda (ilk kadranda = - bileşik, ikinci kadranda = + bileşik) dağıtarak tam 384 kuyulu bir plakayı kapsayacaktır, böylece aynı GPCR 384-kuyulu kılavuz (bkz. 2 Şekil) 8 kuyuda çevrilecektir.
3. Ürdün ve ark.^20:0.1x TE tampon (1 mM Tris-HCl ve 0.1 mM EDTA) tarafından açıklandığı gibi, kalsiyum fosfat yağış yöntemi için gerekli transfeksiyon reaktiflerini bir araya getirin; 2,5 M CaCl₂ çözeltisi; 2x Hepes tampon, pH 7.05 (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na₂HPO₄). Tüm çözeltileri filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın. Transfeksiyon günü, reaktifler kullanmadan önce oda sıcaklığına ulaşmak için izin verin.
4. 2,5 M CaCl₂ stok çözeltisini 0,1x TE (1:8 seyreltme) ile 0,313 M CaCl₂ ve girdap son konsantrasyonuna seyreltin. 0,313 M CaCl_2'nin 40 μL'sini 384 kuyulu DNA kaynak plakasına aktarın ve elle tutulan çok kanallı pipet veya otomatik tezgah 384 kanallı pipettor ile yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.
5. 384 kuyulu DNA kaynak plakasına 50°L 2x Hepes tampon ekleyin, yukarı ve aşağı borular oluşturarak tekrar karıştırın ve 1 dakika bekletin; Her 384-iyi dokuz 384-iyi plakatransfection için DNA / transfection karışımı yeterli miktarda olacak, test edilmesi gereken bileşiklerin sayısına bağlı olarak. 384 kuyudaki DNA kaynak plakasından DNA/transfeksiyon karışımının 10 μL'sini tohumlu HTLA hücrelerine aktarın ve plakaları bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.

3. Birincil tarama: Hücre stimülasyonu

1. Yirmi dört saat sonra, 384 kuyulu plakayı yavaşça lavabonun üzerine vurarak veya bir kağıt havlunun üzerine veya aspiratör kafasıyla hafifçe kaydırarak transfected hücre ortamını decantın. Yavaş yavaş 40 μL açlık medya ekleyin (DMEM ile birlikte 1% diyaliz sığır serumu (dFBS) ve 1x antibiyotik / antimikotik), doğrudan hücrelere dokunmaktan kaçınmak için dikkatli olmak.
2. Pipet 20 μL 3x konsantrasyonda faiz bileşiğinin (hücre plakasındaki ilacın nihai konsantrasyonu 1x olacaktır) (+) stimülasyonlu alternatif sıralara ve (-) bileşiği olmayan alternatif sıralar için 20 μL araç tamponu. Hücre plakasını %5 CO_2'de 37 °C'de döndürün ve en az 16 saat kuluçkaya yatırın.

4. Birincil tarama: Lüminesans okuma

1. Baker ve Boyce^21'denmodifiye edilmiş Glo reaktifini hazırlayın: 108 mM Tris-HCl; 42 mM Tris-Base, 75 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 5 mM Dithiothrei-tol (DTT), 0.2 mM Koenzim A, 0.14 mg/ml D-Luciferin, 1.1 mM ATP, 0.25% v/v Triton X-100, 2 mM Sodyum hidrofit.
   NOT: Reaktiflerin stok çözümleri, glo reaktifine toz halinde her zaman taze olarak eklenen D-Luciferin hariç önceden yapılabilir. Siyah plakalar kullanılırsa, D-Luciferin miktarı 0.25 mg/mL'ye kadar arttırılabilir.
2. 16-24 saat sonra stimülasyon, yavaşça lavabo üzerinde 384-iyi plaka flicking ve bir kağıt havlu üzerine bantlama tarafından transfected hücre medya decant. 20 μL/well Glo reaktif ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 5-20 dakika kuluçkaya yatırın.

5. Birincil tarama: Veri analizi

1. Kaydedilen dosyaları lüminesans sayacından elektronik tablo olarak dışa aktarma; sonuçlar bağıl lüminesans birimlerine (RLU) kaydedilir. 384 kuyulu plakanın düzenine bağlı olarak, aşağıdaki formülü kullanarak her reseptörün aktivasyonunu (kat değişimini) hesaplayın:
   
   NOT: Burada Örnek RLU uyarılmış (+ bileşik) kadranda dört çoğaltma kuyularının her birinin değerini ifade eder, Ortalama arka plan RLU plaka üzerindeki negatif kontrollerin ortalamasıdır ve Ortalama bazal RLU aynı reseptörün işlenmemiş kadranda ortalamasıanlamına gelir (- bileşik). Ayrıca, sonuçların kalitesini doğrulamak için 4 veri noktasının standart sapmasını hesaplayın. Herhangi bir heteroskedastisite düzeltmek için kıvrım değişiklikleri ortalama bir log2 dönüşüm gerçekleştirmek için tavsiye edilir; log2 tabanı pozitif isabetleri belirlemeye yardımcı olmak için pratik bir seçimdir. Ampirik olarak pozitif isabet eşikleri ayarlayın; bazı reseptörlerin 2 kat artış ve tam agonist olan diğerleri için 40 kata kadar artış kadar düşük olabilir unutulmamalıdır.
2. Sonuçlara göre, ikincil tarama için potansiyel pozitif isabet olan GPCR'leri seçin.

6. Sekonder tarama: Hücre tohumlama ve transfeksiyonlar

1. Alt kültür HTLA hücreleri 100 mm'lik hücrelerde toplam hücre yoğunluğunda 11 mL tam ortam (4,55 x 10⁵/mL) ve 37 °C'de 24 saat boyunca kuluçkaya yatırılatır. Aynı gün transfeksiyon tercih edilirse, 7.5 x 10⁶ hücre yoğunluğundaki tohum hücreleri ve transfeksiyon4 saat sonra gerçekleştirin.
2. Oda sıcaklığında kalsiyum fosfat yağışı için gerekli reaktifleri önceden ısıtın. 450 μL 0.1x TE tamponunu 50 μL 2,5 M CaCl₂ ile birleştirin ve hızlı bir şekilde girdap; bu miktarlar, sahip olduğu büyüme ortamının hacmine bağlı olarak 100 mm'lik bir çanak için özeldir.
3. Bir tüpe, 10 μg GPCR cDNA ve girdap için TE/CaCl₂ çözeltisinin 500 μL'sini ekleyin. Tüpe 500°L 2x Hepes tampon çözeltisi ekleyin, şiddetle çalkalayın (girdap yapmayın) ve 1 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: Floresan proteini (örneğin YFP, mCherry, vb.) kodlayan plazmidin 1 μg'ı toplam 10 g için 9 g GPCR cDNA ile eş-transfect olabilir. Floresan protein transfeksiyon verimliliğini izlemek için kullanılır, ve bu minimal miktarda tetkik ile müdahale etmez.
4. Kısa kuluçkadan hemen sonra, 1 mL çözeltiyi hücrelere damla şeklinde dağıtın. Yavaşça eşit çökelti dağıtmak için plaka ileri geri sallayın, plaka girdap değil dikkat, ve 24 saat için 37 °C'de kuluçka.
5. Ertesi gün, floresan hücre görüntüleyici altında floresan protein ekspresyonuna bakarak transfeksiyon verimliliği gözlemlemek; %50'den fazla transfeksiyon idealdir.
6. Gerekli 384 kuyulu PLL kaplı plakayı(lar) 37 °C'de kuvözde kuluçkaya yatırArak hücreleri tohumlamadan önce ısıtın. 384 kuyulu PLL kaplı plaka(lar)dan 1x antibiyotik antimikotik depolama çözeltisini lavabonun üzerine sallama ve kuruması için kağıt havlunun üzerine bantlayarak çıkarın.
7. Transfected hücreleri Versene çözeltisi (1X PBS, pH 7.4; 0,53 mM EDTA) ile hafifçe durulayın ve 3 mL 0,05 tripsin/0,53 mM EDTA ekleyerek ayırın. Tripsini nötralize etmek için içindekileri en az eşit miktarda tam DMEM içeren bir santrifüj tüpüne aktarın.
8. Hücreleri 500 x g'de 3 dk'da döndürün ve aç ortamlarda 0,4 x 10⁶ hücre/mL yoğunlukta hücreleri yeniden askıya alın. 384-iyi PLL kaplı plaka (lar) içine tohum hücreleri 25.000 hücre / iyi son yoğunluğu nda bir elektronik çok kanallı pipet kullanarak hücre süspansiyon 45 μL dağıtarak. Plakaları en az 4 saat boyunca 37 °C'ye geri döndürün ve uyarıma geçmeden önce hücrelerin kuyulara düzgün bir şekilde bağlanmasını bekleyin.

7. Sekonder tarama: 16 noktalı (yarım günlük) doz eğrisi için ilaç plakası hazırlama

1. 96-iyi bir plaka, 1XHBSS ilaç tampon (1x Hank's Balanced Salt Solution [HBSS], 20 mM HEPES pH 7.4, 1x antibiyotik-antimikotik) hariç, 270 μL eklemek plaka nın son satır (satır H) hariç, Şekil 4 gösterildiği gibi .
   NOT: Peptidler, kolloidal moleküller ve suda çözünen kötü bileşikler için %0.1-1 BSA eklenmesi önerilmektedir. İlaç oksidasyonunu önlemek için %0,01'e kadar askorbik asit de eklenebilir.
2. Uyuşturucu stokundan, son 3x konsantrasyonu hesaplayarak bir ilaç çözeltisi ("Yüksek" konsantrasyonu olarak anılacaktır) hazırlayın (hücre plakasındaki ilacın son konsantrasyonu 1x olacaktır). Örnek olarak, en yüksek konsantrasyonolarak 10 μM'lik bir doz-yanıt eğrisi için 30 μM'de "Yüksek" konsantrasyonu hazırlayın. Pipet 300 μL "Yüksek" konsantrasyonu H satırındaki kuyulara.
3. Başka bir tüpte, 3,16 (yarım günlük) ile bölünmüş "Yüksek" konsantrasyonu temsil eden "Düşük" konsantrasyonu hazırlayın. Önceki örneğe göre ,"Düşük" konsantrasyonu 9,49 μM olacaktır. Pipet 300 μL "Düşük" konsantrasyonu H satırındaki kuyulara, "Yüksek" kuyulara bitişik.
   NOT: H satırında ihtiyaç duyulan toplam 96 kuyu sayısı hücre sayısına ve stimülasyon koşullarına bağlıdır. Dört kuyu (iki "Yüksek" ve iki "Düşük") bütün bir 384 iyi plaka uyarmak için yeterli ilaç çözeltisi olacak.
4. "Yüksek" ve "Düşük" h satırının "Yüksek" ve "Düşük" kuyularından bir önceki satıra (G sırası) kadar 30°L uyuşturucu çözeltisini pipetleyerek seri seyreltme gerçekleştirin ve "Pipet ve Mix" işlevine sahip elektronik çok kanallı bir pipet kullanarak el ile yukarı ve aşağı boru lar kullanarak veya tavsiye edilen şekilde karıştırın. Seyreltmeler arasındaki ipuçlarını atarken, ilk ve en seyreltilmiş satıra (A satırı) kadar bu adımı tekrarlayın.
   NOT: İstenirse, seri seyreltmeler a satırından önce durdurulabilir ve ilaç sızbir iç kontrolü, başka bir deyişle "gerçek sıfır"ı temsil edebilir.
5. Şekil 4'ü referans olarak kullanarak, 96 kuyulu plakadan "Düşük" sütun seyreltmelerinin 20 μL'ini daha önce tohumlanmış 384 kuyuplakanın A-O satırlarına ve "Yüksek" sütun seyreltmelerinin 20 μL'sini B-P kuyularına 37 °C'de en az 16 saat kuluçkaya yatırarak transfected hücreleri uyarın.

8. Sekonder tarama: Lüminesans okuma ve veri analizi

1. 16-24 saat sonra stimülasyon, yavaşça lavabo üzerinde 384-iyi plaka flicking ve bir kağıt havlu üzerine bantlama tarafından transfected hücre medya decant. 20 μL/well Glo reaktif ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 5-20 dakika kuluçkaya yatırın.
2. Kaydedilen dosyaları lüminesans sayacından elektronik tablo olarak dışa aktarma; sonuçlar bağıl lüminesans birimlerine (RLU) kaydedilir. Doğrusal olmayan regresyon eğrisi sığması için yerleşik XY analizini kullanarak sonuçları analiz etmek için 384 kuyulu plakanın verilerini bir istatistik yazılımına aktarın. Dahili 3-parametre doz-yanıt stimülasyon fonksiyonu "Log(agonist) vs yanıt (üç parametre)" seçin,
   
   NOT: Burada Üst ve Alt y ekseninin birimlerinde platolar, sırasıyla maksimal tepki ve bazal seviye, EC50 Üst ve Alt arasında% 50 yanıt üreten agonist konsantrasyonu ve X agonist günlük konsantrasyonu anlamına gelir. Bu model doz-yanıt eğrisi 1 standart bir Hill eğim olduğunu varsayar.

Sonuçlar

Burada sunulan PRESTO-Tango protokolü kullanılarak, bir kromofin granül (CG) ekstresi 168 koku vermeyen GPCR hedeflerine karşı tarandı ve çoğunluğu yetim reseptörleri. Barnea ve ark.¹⁸ tarafından tasarlanan ilkeye göre seçilen reseptörlerde β-arrestin2 mobilizasyonu incelenerek bu özün profillenmesi gerçekleştirilmiştir (Şekil 1). İlgi çekici GPCR'lerin plazmid cDNA'sı PRESTO-Tango GPCR Kiti'nden alınmış ve istenilen düzende iki adet 96 iyi...

Tartışmalar

Konformasyonel dinamik GPCR sinyal iletiminin güç merkezleridir. Bu heptahelical reseptörlerin bağlayıcı ceplerinin fizyokimyasal özellikleri ve fizyolojik önemi GPCR ligand tarama araçlarına duyulan ihtiyacın altını çizer. Yukarıda sunulduğu gibi, PRESTO-Tango testi hızlı, hassas ve kullanıcı dostudur ve kendini uyuşturucu gelişimine ödünç vetir. Sadece bu taht agonist kaynaklı aktivasyon ölçmek yok, ama aynı zamanda antagonistlerve allosteric modülatörlerin etkinliğini ölçmek için kul...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile	NUNC	12-566
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile	NUNC	12-566-1
384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid	ThermoFisher	12-565-390
Antibiotic-Antimycotic	Wisent	450-115-EL
D-Luciferin, sodium salt	GoldBio	LUCNA
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10-013-CV
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL	Eppendorf	4861000155
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL	Eppendorf	4861000139
Matrix Platemate 2x3	ThermoFisher	801-10001
MicroBeta 1450 Wallac	Perkin Elmer
Penicilin-Streptomycin	Wisent	450-201-EL
Poly-L-Lysine hydrobromide	Millipore-Sigma	P2636-500MG
Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit	Addgene	Kit #1000000068