Parallele Vernehmung der Rekrutierung von '-Arrestin2 für Ligand Screening auf einer GPCR-weiten Skala mit PRESTO-Tango Assay

Zusammenfassung

Da GPCRs attraktive arzneimittelfähige Ziele sind, ist das GPCR-Ligandenscreening daher für die Identifizierung von Bleiverbindungen und für Deorphanisierungsstudien unerlässlich. Im Rahmen dieser Bemühungen beschreiben wir PRESTO-Tango, eine Open-Source-Ressourcenplattform, die für die gleichzeitige Profilierung der vorübergehenden Rekrutierung von "Arrestin2" bei ca. 300 GPCRs mit einem TEV-basierten Reportertest verwendet wird.

Zusammenfassung

Als größte und vielseitigste Gen-Superfamilie und Vermittler einer Bandbreite zellulärer Signalwege stellen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eines der vielversprechendsten Ziele für die pharmazeutische Industrie dar. Ergo, das Design, die Implementierung und die Optimierung von GPCR-Liganden-Screening-Assays, ist von entscheidender Bedeutung, da sie Fernsteuerungstools für die Arzneimittelentdeckung und die Manipulation der GPCR-Pharmakologie und -Ergebnisse darstellen. In der Vergangenheit haben G-Protein-abhängige Assays diesen Forschungsbereich typisiert, Liganden-induzierte Ereignisse erkannt und die Erzeugung von sekundären Botenstoffen quantifiziert. Seit dem Aufkommen der funktionellen Selektivität sowie einem erhöhten Bewusstsein für mehrere andere G-proteinunabhängige Pfade und die Einschränkungen im Zusammenhang mit G-proteinabhängigen Assays gibt es jedoch einen größeren Schub für die Schaffung alternativer GPCR Liganden-Screening-Assays. Zu diesem Unterfangen beschreiben wir die Anwendung einer solchen Ressource, der PRESTO-Tango-Plattform, einem luziferase-Reporter-basierten System, das die parallele und gleichzeitige Abfrage des menschlichen GPCR-Omeermöglicht, eine Leistung, die zuvor in Betracht gezogen wurde technisch und wirtschaftlich nicht machbar. Basierend auf einem G-Protein-unabhängigen Rekrutierungstest für die Rekrutierung von G-Protein-Arrestin2 macht die Universalität des von der GPCR vermittelten Handels und der Signalisierung von '-arrestin2- und Signalisierungs-Atier-Medien PRESTO-TANGO zu einem geeigneten Werkzeug für die Untersuchung von ca. 300 nicht-olfaktorischen menschlichen GPCRs, darunter etwa 100 Orphan-Rezeptoren. Die Empfindlichkeit und Robustheit von PRESTO-Tango machen es für primäre Hochdurchsatzbildschirme geeignet, die zusammengesetzte Bibliotheken verwenden, um neue GPCR-Ziele für bekannte Medikamente aufzudecken oder neue Liganden für Orphan-Rezeptoren zu entdecken.

Einleitung

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte und vielfältigste Familie von Transmembranproteinen, die als Kommunikationsschnittstellen zwischen einer Zelle und ihrer^Umgebung1 funktionieren. Die Vielseitigkeit von GPCRs wird durch ihre Fähigkeit, eine Vielzahl von Liganden zu erkennen – von Neurotransmittern bis zu Nukleotiden, Peptide bis hin zu Photonen und vielem mehr – sowie ihre Fähigkeit, zahlreiche nachgeschaltete Signalkaskaden zu regulieren, die an Zellwachstum, Migration, Differenzierung, Apoptose, Zellabschuss^usw.beteiligt sind, sowie ihre Fähigkeit, zahlreiche nachgeschaltete Signalkaskaden zu regulieren, die an Zellwachstum, Migration, Differenzierung, Apoptose, Zellabschuss usw. beteiligt sind,^werden. Angesichts ihrer Allgegenwart und Beteiligung an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen ist diese Rezeptorfamilie von größter therapeutischer Bedeutung, was durch die Tatsache belegt wird, dass mehr als ein Drittel der derzeit verfügbaren verordneten Medikamente auf GPCRs⁴abzielen. Diese bestehenden Therapeutika zielen jedoch nur auf eine kleine Teilmenge der Überfamilie ab (schätzungsweise 10 %), und die Pharmakologie vieler GPCRs bleibt ungeklärt. Darüber hinaus existieren mehr als 100 GPCRs als Orphan-Rezeptoren, da sie nicht mit einem endogenen Ligand⁵abgeglichen wurden. Daher ist das GPCR-Ligand-Screening entscheidend für die Entwaistisierung und Arzneimittelentwicklung, da es den Weg zur Lead-Entdeckung und -Optimierung und möglicherweise zur klinischen Testphase ebnet.

Methoden für das GPCR-Ligand-Screening sind traditionell in eine von zwei Kategorien gefallen, G-Protein-abhängige oder G-Protein-unabhängige funktionelle Assays⁶. Die GPCR-Signalisierung wird durch heterotrimere G-Proteine (G- und -Proteine) reguliert, die durch den Austausch von GTP gegen BIP aktiviert werden, die an die Untereinheit⁷gebunden sind. Signale des aktivierten Rezeptors werden von G-Proteinen über sekundäre Botenstoffe wie cAMP, Calcium, DAG und IP3 transduziert, um nachgeschaltete Signalisierung an downstreameffekten⁸zu vermitteln. Die Art der funktionellen Folgen der G-Protein-Signalisierung wurde genutzt, um zellbasierte Assays zu erstellen, die die Rezeptoraktivierung reflektieren. Diese Methoden, die proximale (direkte) oder distale (indirekte) Ereignisse in der G-Protein-Signalisierung messen, werden am häufigsten für das GPCR-Liganden-Screening verwendet und wurden hauptsächlich in Deorphanisierungsstudien eingesetzt⁶. Beispiele für Assays, die die GPCR-vermittelte G-Protein-Aktivierung direkt messen, sind der [35S]GTP-Bindungstest, der die Bindung eines radioaktiv markierten und nicht hydrolysierbaren GTP analog zur G-Untereinheit misst, und Förster/Biolumineszenz-Resonanzenergieübertragung (FRET/BRET) zur Überwachung von GPCR-G- und G-/G-Wechselwirkungen, die in den Jahren⁹,¹⁰, an Zugkraft gewonnen haben. Assays, die distale Ereignisse überwachen, sind die am häufigsten verwendeten Tools für die GPCR-Profilerstellung; Z. B. messen cAMP- und IP1/3-Assays die intrazelluläre Akkumulation von G-proteinabhängigen Sekundärbotenstoffen, während [Ca²⁺] Fluss- und Reporter-Assays mit spezifischen Reaktionselementen, die an der G-Protein-Aktivierung beteiligt sind (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE), Ereignisse weiter nach der Signalkaskade¹¹untersuchen. Während die meisten der oben genannten Assays auf einem hohen Durchsatzniveau durchgeführt werden können, sind ziemlich empfindlich und rühmen sich bestimmter assayspezifischer Vorteile (z.B. Diskriminierung zwischen Voll-/Teilagonisten, neutralen Antagonisten und inversen Agonisten im Falle der GTP-Bindung oder Assay-Funktionalität auf lebenden Zellen wie [Ca²⁺] und IP1/3)⁶, es gibt leider keine vorhandenen G-Protein-abhängigen Methoden, die der Abfrage des gesamten medikamentösen GPCR-Ome sausen. Dies ist weitgehend auf die native Kopplung mehrerer G-Protein-Unterfamilien mit GPCRs zurückzuführen, was zu Signalisierungen an mehreren Kaskaden und der unbekannten G-Protein-Kopplung bei verwaisten GPCRs führt. Um dieses Problem zu mildern, wurden Assays entwickelt, um die promiscuous G-Protein-Kopplung durch eine einzige gemeinsame Signalisierungsauslesung wie cAMP und Ca²⁺zu erzwingen, obwohl die meisten von ihnen einen niedrigen Durchsatz¹²sind.

Ein wichtiger Aspekt des GPCR-Lebenszyklus ist die Beendigung der G-Protein-abhängigen Signalisierung, die zu einem großen Teil durch die Rekrutierung von S-Arrestinen erfolgt, die eine Dissoziation des G-Proteins induziert und letztlich den Rezeptor desensizipiert, das für die clathrinbeschichtete Internalisierung¹³bestimmt ist. Die allgegenwärtigsten Isoformen von '-arrestin sind die nicht-visuellen '-arrestin1 und '-arrestin2, auch als arrestin-2 und arrestin-3 bzw.¹⁴bezeichnet. Geben Sie G-Protein-unabhängige zellbasierte Assays ein, die dem GPCR-Liganden-Screening eine neue Dimension verleihen; Rezeptorenhandel, etikettenfreie ganze Zelle und Rekrutierungs-Assays sind bemerkenswerte Beispiele. GPCR-Handelstests verwenden fluorophormarkierte Liganden oder ko-internalisierte Antikörper, die auf den Rezeptor^{abzielen 15}, während etikettenfreie Ganzzell-Assays Biosensoren verwenden, die zelluläre Veränderungen, die durch Ligandenbindung induziert werden, in quantifizierbare Ausgänge wie elektrische oder optische Signale¹⁶übersetzen. Bemerkenswert ist, dass die Quintessenz der GPCR---Arrestin-Interaktionen den Rekrutierungs-Assay von '-arrestin als attraktives Werkzeug im Repertoire der funktionalen Assays¹⁷. Das Tango-System, das erst vor einem Jahrzehnt von Barnea et al. entwickelt wurde, beinhaltet die Einführung von drei exogenen genetischen Elementen: eine Proteinfusion, bestehend aus dem "-arrestin2" mit einem Tabak-Ätzvirus-Protease (TEVp), einem Tetracyclin-Transaktivator (tTA), der über ein Tabak-Etch-Virus an einen GPCR gebunden ist Protease-Spaltungsstelle (TEVcs) und wird von einer Sequenz aus dem C-Terminus des V2-Vasopressinrezeptors (V2-Schwanz) zur Förderung der Verhaftung bei der Rekrutierung und einem Reporter-Luziferase-Gen, dessen Transkription durch die tTA-Transkriptionsfaktor-Translokation in den Kern, der nach der Rekrutierung von A-arrestin2 aus der Membranverankerung befreit wird (Abbildung 1)¹⁸. Quantitative Messwerte der GPCR-Aktivierung und der Rekrutierung von '-arrestin2 können anschließend durch Lesen auf Lumineszenz bestimmt werden. Ein bemerkenswerter Unterschied ist, dass der Tango zwar den Rezeptorhandel und die etikettenfreien Ganzzellmethoden relativ gering ist, aber mehrere Vorteile hat, einschließlich des selektiven Auslesens, das spezifisch für den Zielrezeptor ist, und der Empfindlichkeit aufgrund der Signalintegration, die ihn zu einem geeigneten Kandidaten für das Liganden-Screening in größerem Maßstab^{machen 18}.

Angesichts dieser strategischen Merkmale entwickelten Kroeze et al. PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), eine Open-Source-Plattform mit hohem Durchsatz, die den Tango-Ansatz nutzt, um das medikamentöse GPCR-Ome parallel und gleichzeitig zu profilieren¹⁹. PRESTO-Tango nutzt die "promiscuous" Rekrutierung von '-arrestin2 für fast alle GPCRs und ist die erste seiner Art in Bezug auf zellbasierte funktionelle Assays, die ein schnelles "Erstrunden"-Screening von kleinen Molekülverbindungen an fast allen nicht-olfaktorischen GPCRs, einschließlich Waisen, unabhängig von der G-Protein-Unterfamilie ermöglicht.

Protokoll

1. Primäres Screening: Zellkultur und Plattenaussaat

1. Zur Herstellung von Poly-L-Lysin(PLL)-beschichteten Platten 20 l/well einer 25-g/ml-Stammlösung pLL in weißen oder schwarzen 384-Well-optischen Bodenplatten mit einer elektronischen Mehrkanalpipette oder einem Reagenzienspender. Inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur für 0,5-2 h.
   HINWEIS: Wenn Sie die schwarzen 384-Well-Platten verwenden, erwarten Sie, dass das Hintergrundsignal niedriger ist als die weißen Platten. Schwarze Platten werden empfohlen, um die Durchblutung der Lumineszenz zwischen benachbarten Brunnen zu reduzieren.
2. Um die beschichteten Platten zu erhalten und die überschüssige PLL abzuwaschen, entfernen Sie die PLL, indem Sie sie über das Waschbecken streichen, tippen Sie trocken über ein Papiertuch und fügen Sie 40 L/Well verdünnter 1x-Lösung von Antibiotika-Antimykotik mit einer elektronischen Mehrkanalpipette oder einem Reagenzienspender hinzu. PLL-beschichtete Platten bei 4 °C lagern, bis sie zur Plattensaat bereit sind.
3. Halten Sie HTLA-Zellen (freundlicherweise von Dr. Richard Axel zur Verfügung gestellt) – eine menschliche embryonale Nierenzelllinie (HEK293T) stabil auszudrückend -arrestin2-TEV und tTA-gesteuerte Luziferase – in vollständig Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 5% fetalem Rinderserum, 5 % des Rinderkalbserums, 2,5 g/ml Puromycin, 50 g/ml Hygromycin, 100 U/ml Penicillin und 100 g/ml Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5%_CO2.
4. Kultur HTLA-Zellen in 150 mm Geschirr und passieren Zellen zweimal pro Woche mit einem Verdünnungsfaktor von 1:10, mit optimaler Zelldurchgangszahl von 5–25. Stellen Sie sicher, dass eine ausreichende Anzahl von 150 mm Geschirr am Tag der 384-Well-Plattenaussaat, abhängig von der Skala des Primärsiebes, konfluent sind.
   HINWEIS: Die Verwendung von HTLA-Zellen, die größer als Durchgang 25 sind, kann zu einer verminderten Lebensfähigkeit führen, was zu suboptimalen Ergebnissen führt.
5. Um HTLA-Zellen für den Primärsieb auszusäen, spülen Sie die konfluente 150 mm Schale(en) vorsichtig mit 1x phosphatgepufferter Saline (PBS), pH 7.4, ab. Lösen Sie Zellen mit ca. 6 ml 0,05% Trypsin/0,53 mM EDTA und übertragen Sie sie in ein Zentrifugenrohr, das mindestens die gleiche Menge des modifizierten Dulbecco-modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) enthält, um das Trypsin zu neutralisieren.
6. Drehen Sie HTLA-Zellen bei 500 x g für 3 min und setzen Sie das Zellpellet mit einer Dichte von 0,22 x 10⁶ Zellen/ml in vollständiger DMEM wieder aus, wodurch die Zugabe von 2,5 g/ml Puromycin und 50 g/ml Hygromycin wegfällt, da sie die Transfektionswirksamkeit verringern können.
7. Die notwendigen 384-Well-PLL-beschichteten Platten bei 37 °C inkubieren, um sie vor der Aussaat von Zellen zu erwärmen. Entfernen Sie die Aufbewahrungslösung von 1x Antimykotik antimykotika aus der 384-well PLL-beschichteten Platte(n), indem Sie die Platte über das Waschbecken flicken und sie zum Trocknen über ein Papiertuch kleben.
8. Saatzellen in die 384-Well-PLL-beschichteten Platten mit einer Enddichte von 10.000 Zellen/Well, indem 45 l der 0,22 x 10 6-Zellen/ml-HTLA-Suspension mit einer elektronischen Mehrkanalpipette dosiert werden. Platten bei 37 °C über Nacht inkubieren. Wenn eine Transfektion am selben Tag bevorzugt wird, führen Samenzellen mit einer Dichte von 16.000 Zellen/Well die Transfektion 4 h später durch.
   HINWEIS: Für eine hohe Transfektionseffizienz ist die Konfluenz von 50–70 % der Zellen optimal.

2. Primäres Screening: DNA-Plattenpräparation und Transfektionen

1. Um die 384-Well-DNA-Quellenplatte für die Transfektion vorzubereiten, wie in Abbildung 2dargestellt, verteilen Sie die Plasmid-cDNAs, die die GPCR-Tango-Konstrukte kodieren, die für eine 96-Well-Platte mit einem anderen GPCR/Well von Interesse sind. Die Plasmid-DNA sollte in einem 0,1x Tris-EDTA (TE)-Puffer in einer Konzentration von 50 ng/l suspendiert werden.
   HINWEIS: Die 96-Well-DNA-Platten können bei -20 °C versiegelt und gelagert und für mehrere Screening-Experimente wiederverwendet werden. Alle cDNA-kodierenden GPCR-Tango-Konstrukte sind kommerziell erhältlich (siehe Materialtabelle) und werden im neomycin-Plasmid pcDNA3.1 geklont. Das PRESTO-Tango GPCR Kit besteht aus vier 96-Well-Platten, die jeweils 80 GPCRs, ein paar Brunnen mit einem leeren Vektor als Negativkontrollen und Positive Control-Brunnen enthalten, die den Dopamin-Rezeptor D2 (DRD2) halten, und Brunnen, die ein Plasmid tragen, das für ein fluoreszierendes Protein (YFP) kodiert, um die Transfektionseffizienz zu verfolgen.
2. Übertragen Sie die DNA-Lösung mit hilfe einer Mehrkanalpipette manuell vom 96-Well auf die 384-Well-DNA-Quellenplatte, wodurch 10 l pro 384-Well hinzugefügt werden. Um sicherzustellen, dass jede Bedingung des Experiments in Quadruplikat untersucht wird, deckt die Hälfte der 96-Well-DNA-Platte (Zeilen A-D oder E-H) eine volle 384-Well-Platte ab, indem jeder GPCR in zwei Quadranten verteilt wird (erster Quadrant = - Verbindung, zweiter Quadrant = + Verbindung), so dass derselbe GPCR in 8 Brunnen der 384-Well-Platte transfiziert wird (siehe Abbildung 2 als Führungsteil).
3. Zusammenbauen Sie die folgenden Transfektionsreagenzien, die für die Calciumphosphat-Fällungsmethode benötigt werden, wie von Jordan et al.²⁰beschrieben: 0,1x TE-Puffer (1 mM Tris-HCl und 0,1 mM EDTA); 2.5 M CaCl₂ Lösung; 2x Hepespuffer, pH 7,05 (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HPO₄). Sterilisieren Sie alle Lösungen durch Filtration und lagern Sie bei 4 °C. Am Tag der Transfektion, lassen Sie die Reagenzien Raumtemperatur vor Gebrauch zu erreichen.
4. Die 2,5 M CaCl₂ Stofflösung in 0,1x TE (1:8 Verdünnung) auf eine Endkonzentration von 0,313 M CaCl₂ und Wirbel verdünnen. Übertragen Sie 40 l von 0,313 M CaCl₂ auf die 384-Well-DNA-Quellenplatte und mischen Sie sie durch Pipettieren mit einer handgeführten Mehrkanalpipette oder einem automatisierten 384-Kanal-Pipettor auf und ab.
5. Der 384-Well-DNA-Quellenplatte 50 l 2x Hepespuffer hinzufügen, durch Pipettieren nach oben und unten wieder vermischen und 1 min stehen lassen; jeder 384-Well wird eine ausreichende Menge an DNA/Transfektionsgemisch für die Transfektion von neun 384-Well-Platten haben, abhängig von der Anzahl der Verbindungen, die getestet werden müssen. Übertragen Sie 10 l des DNA/Transfektionsgemisches von der 384-Well-DNA-Quellenplatte auf die gesäten HTLA-Zellen und inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C.

3. Primäres Screening: Zellstimulation

1. 24 Stunden später dekantieren Sie die transfizierten Zellmedien, indem Sie die 384-Well-Platte sanft über das Waschbecken streicheln und über ein Papiertuch oder mit einem Aspiratorkopf kleben. Fügen Sie langsam 40 L verhungernde Medien hinzu (DMEM ergänzt mit 1% dialysiertem fetalem Rinderserum (dFBS) und 1x Antibiotikum/Antimykotik), wobei darauf zu achten ist, dass die Zellen nicht direkt berührt werden.
2. Pipetten Sie 20 l der Zinsverbindung in einer 3-fachen Konzentration (Endkonzentration des Arzneimittels in der Zellplatte beträgt 1x) in die abwechselnden Reihen mit (+) Stimulation und 20 l Fahrzeugpuffer für die Wechselreihen ohne (-) Verbindung. Geben Sie die Zellplatte bei 37 °C in 5%_CO2 zurück und brüten Sie mindestens 16 h.

4. Primäres Screening: Lumineszenz-Lesung

1. Bereiten Sie das Glo Reagenz, modifiziert von Baker und Boyce²¹: 108 mM Tris-HCl; 42 mM Tris-Base, 75 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 5 mM Dithiothrei-tol (DTT), 0,2 mM Coenzym A, 0,14 mg/ml D-Luciferin, 1,1 mM ATP, 0,25% v/v Triton X-100, 2 mM Natriumhydrosulfit.
   HINWEIS: Lagerlösungen der Reagenzien können im Voraus hergestellt werden, mit Ausnahme von D-Luciferin, das dem Glo-Reagenz in seiner pulverförmigen Form immer frisch zugesetzt wird. Wenn schwarze Platten verwendet wurden, kann die Menge an D-Luciferin bis zu 0,25 mg/ml erhöht werden.
2. Um 16–24 Uhr nach stimulationieren, dekantieren Sie die transfizierten Zellmedien, indem Sie die 384-Well-Platte sanft über das Waschbecken streichen und über ein Papiertuch kleben. Fügen Sie 20 L/Well von Glo-Reagenz hinzu und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 5–20 min. Lesen Sie die Platten mit einem Mikroplatten-Lumineszenzzähler, mit einer Integrationszeit von 1 s/well.

5. Primäres Screening: Datenanalyse

1. Exportieren Sie die gespeicherten Dateien aus dem Lumineszenzzähler als Kalkulationstabelle; Ergebnisse werden in relativen Lumineszenzeinheiten (RLU) aufgezeichnet. Berechnen Sie anhand des Layouts der 384-Well-Platte die Aktivierung (Faltenänderung) jedes Rezeptors mit der folgenden Formel:
   
   ANMERKUNG: Hier bezieht sich Sample RLU auf den Wert jeder der vier Replizierungsbohrungen des stimulierten (+ zusammengesetzten) Quadranten, der mittlere Hintergrund RLU ist der Mittelwert der Negativkontrollen auf der Platte, und die mittlere basale RLU bezieht sich auf den Mittelwert des unbehandelten Quadranten desselben Rezeptors (- Verbindung). Berechnen Sie außerdem die Standardabweichung der 4 Datenpunkte, um die Qualität der Ergebnisse zu überprüfen. Es wird empfohlen, eine log2-Transformation auf den Mittelwert der Faltenänderungen durchzuführen, um jegliche Heteroskedastizität zu korrigieren. Die log2-Basis ist eine praktische Wahl, um positive Treffer zu identifizieren. Empirisch die positiven Trefferschwellen festlegen; Es muss angemerkt werden, dass einige Rezeptoren so niedrig wie 2-fache Erhöhung und bis zu 40-fache Erhöhung für andere mit vollem Agonisten haben können.
2. Wählen Sie auf der Grundlage der Ergebnisse die GPCRs aus, die potenzielle positive Treffer für das sekundäre Screening sind.

6. Sekundäres Screening: Zellaussaat und Transfektionen

1. Subkultur-HTLA-Zellen in 100-mm-Schalen mit einer Gesamtzelldichte von 5 x 10⁶ Zellen in 11 ml Gesamtmedien (4,55 x 10⁵/ml) und bei 37 °C für 24 h inkubieren. Wenn eine Transfektion am selben Tag bevorzugt wird, führen Samenzellen mit einer Dichte von 7,5 x 10⁶ Zellen die Transfektion 4 h später durch.
2. Die für die Calciumphosphatfällung bei Raumtemperatur benötigten Reagenzien vorwärmen. Kombinieren Sie 450 l 0,1x TE-Puffer mit 50 l von 2,5 M CaCl₂ und schnell Wirbel; diese Mengen sind spezifisch für eine 100 mm Schale, basierend auf dem Volumen des Wachstumsmediums, das es hält.
3. In einer Röhre 500 l der TE/CaCl_2-Lösung zu 10 g GPCR-cDNA und Wirbel hinzufügen. Fügen Sie 500 l 2x Hepes Pufferlösung in das Rohr, schütteln Sie kräftig (nicht Wirbel), und inkubieren für 1 min.
   ANMERKUNG: 1 g eines beliebigen Plasmids, das für ein fluoreszierendes Protein kodiert (z. B. YFP, mCherry usw.), kann mit 9 g GPCR-cDNA für insgesamt 10 g kotranstranstranstranstranstranssektiert werden. Das fluoreszierende Protein wird verwendet, um die Transfektionseffizienz zu verfolgen, und diese minimale Menge wird den Test nicht stören.
4. Unmittelbar nach der kurzen Inkubation die 1 ml Lösung tropfenweise auf die Zellen abgeben. Die Platte vorsichtig hin und her schaukeln, um den Niederschlag gleichmäßig zu verteilen, wobei darauf zu achten ist, dass die Platte nicht gewirbelt wird, und bei 37 °C für 24 h inkubieren.
5. Am nächsten Tag beobachten Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie die Expression des fluoreszierenden Proteins unter einem fluoreszierenden Zellbilder betrachten; Transfektionen von mehr als 50 % Abdeckung sind ideal.
6. Inkubieren Sie die notwendige 384-Well-PLL-beschichtete Platte(n) im Inkubator bei 37 °C, um sie vor der Aussaat von Zellen zu erwärmen. Entfernen Sie die Aufbewahrungslösung von 1x Antimykotik antimykotika aus der 384-well PLL-beschichteten Platte(n), indem Sie die Platte über das Waschbecken flicken und sie zum Trocknen über ein Papiertuch kleben.
7. Spülen Sie die transfizierten Zellen vorsichtig mit Versene-Lösung (1X PBS, pH 7,4; 0,53 mM EDTA) und lösen Sie sich, indem Sie 3 ml 0,05% Trypsin/0,53 mM EDTA in die Schale geben. Übertragen Sie den Inhalt in ein Zentrifugenrohr, das mindestens eine gleiche Menge an vollständigem DMEM enthält, um das Trypsin zu neutralisieren.
8. Drehen Sie die Zellen bei 500 x g für 3 min und suspendieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 0,4 x 10⁶ Zellen/ml in hungernden Medien. Saatzellen in die 384-Well-PLL-beschichtete Platte(n) mit einer Enddichte von 25.000 Zellen/Well, indem sie 45 l der Zellsuspension mit einer elektronischen Mehrkanalpipette dosieren. Bringen Sie die Platten für mindestens 4 h auf die 37 °C zurück, sodass sich die Zellen vor der Stimulation richtig an den Brunnen befestigen können.

7. Sekundäres Screening: Arzneimittelplattenpräparation für 16-Punkt (Halblog) Dosiskurve

1. In einer 96-Well-Platte 270 L 1X HBSS-Medikamentenpuffer (1x Hank es Balanced Salt Solution [HBSS], 20 mM HEPES pH 7.4, 1x antimycotic) hinzufügen, mit Ausnahme der letzten Reihe (Zeile H) der Platte, wie in Abbildung 4dargestellt.
   HINWEIS: Bei Peptiden, kolloidalen Molekülen und schlecht wasserlöslichen Verbindungen wird die Zugabe von 0,1–1% BSA empfohlen. Um die Oxidation von Medikamenten zu verhindern, können auch bis zu 0,01% Ascorbinsäure zugesetzt werden.
2. Aus dem Wirkstoffbestand eine Wirkstofflösung (als "hohe" Konzentration bezeichnet) durch Berechnung einer endgültigen 3x Konzentration (Endkonzentration des Arzneimittels in der Zellplatte wird 1x betragen). Zum Beispiel bereiten Sie für eine Dosis-Wirkungs-Kurve mit 10 M als höchste Konzentration die "hohe" Konzentration bei 30 m vor. Pipetten 300 l "Hohe" Konzentration in Brunnen in Reihe H.
3. In einem anderen Rohr bereiten Sie die "Niedrige" Konzentration vor, die die "hohe" Konzentration dividiert durch 3,16 (Halblog) darstellt. Basierend auf dem vorherigen Beispiel würde die "Niedrige" Konzentration 9,49 M betragen. Pipetten 300 l "Niedrige" Konzentration in Brunnen in Reihe H, neben den "High" Brunnen.
   HINWEIS: Die Gesamtzahl der 96-Bohrungen, die in Zeile H benötigt werden, hängt von der Anzahl der Zellen und stimulationsbedingungen ab. Vier Brunnen (zwei "High" und zwei "Low") haben reichlich Drogenlösung, um eine ganze 384 Well Platte zu stimulieren.
4. Führen Sie eine serielle Verdünnung durch Pipettierung von 30 l Medikamentenlösung von den "High" und "Low" Brunnen der Reihe H in die vorherige Reihe (Zeile G) und mischen Sie durch manuellepipetieren nach oben und unten, oder wie empfohlen, mit einer elektronischen Mehrkanalpipette mit der "Pipette und Mix" Funktion. Wiederholen Sie diesen Schritt bis zur ersten und am meisten verdünnten Zeile (Zeile A), während Sie Spitzen zwischen Verdünnungen ablegen.
   HINWEIS: Auf Wunsch können die seriellen Verdünnungen vor Zeile A gestoppt werden, was eine interne Kontrolle ohne Medikament darstellt, mit anderen Worten, eine "wahre Null".
5. Anhand von Abbildung 4 als Referenz stimulieren Sie transfizierte Zellen, indem Sie 20 l der "Low"-Säulenverdünnungen von der 96-Well-Platte auf die Reihen A-O der zuvor gesäten 384-Well-Platte sowie 20 l der "Hohen" Säulenverdünnungen an die Brunnen B-P pipetieren. Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für ein Minimum von 16 h.

8. Sekundäres Screening: Lumineszenzlesen und Datenanalyse

1. Um 16–24 Uhr nach stimulationieren, dekantieren Sie die transfizierten Zellmedien, indem Sie die 384-Well-Platte sanft über das Waschbecken streichen und über ein Papiertuch kleben. Fügen Sie 20 L/Well von Glo-Reagenz hinzu und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 5–20 min. Lesen Sie die Platten mit einem Mikroplatten-Lumineszenzzähler, mit einer Integrationszeit von 1 s/well.
2. Exportieren Sie die gespeicherten Dateien aus dem Lumineszenzzähler als Kalkulationstabelle; Ergebnisse werden in relativen Lumineszenzeinheiten (RLU) aufgezeichnet. Übertragen Sie die Daten der 384-Well-Platte an eine Statistiksoftware, um die Ergebnisse mithilfe der integrierten XY-Analyse für die Passform der nichtlinearen Regressionskurve zu analysieren. Wählen Sie die integrierte 3-Parameter-Dosis-Wirkungs-Stimulationsfunktion "Log(agonist) vs. Response (drei Parameter)",
   
   ANMERKUNG: Hier sind oben und unten Plateaus in den Einheiten der Y-Achse, bzw. die maximale Reaktion und Basalebene, EC50 ist die Konzentration des Agonisten, die 50% Antwort zwischen Oben und Unten erzeugt, und X bezieht sich auf die Log-Konzentration des Agonisten. Dieses Modell geht davon aus, dass die Dosis-Wirkungs-Kurve eine Standard-Hill-Neigung von 1 aufweist.

Ergebnisse

Mit dem hier vorgestellten PRESTO-Tango-Protokoll wurde ein Chromaffin-Granulat (CG)-Extrakt mit 168 nicht-olfaktorischen GPCR-Zielen abgeschirmt, wobei die Mehrheit Waisenrezeptoren waren. Die Profilierung dieses Extraktes erfolgte durch die Untersuchung der Mobilisierung von '-arrestin2 an den gewählten Rezeptoren, basierend auf dem von Barnea et al.¹⁸ entworfenen Prinzip (Abbildung 1). Plasmid cDNA der GPCRs wurde aus dem PRESTO-Tango GPCR Kit entnommen und in zwe...

Diskussion

Die konformdynamischen GPCRs sind Kraftpakete der Signaltransduktion. Die physiochemischen Eigenschaften der Bindungstaschen dieser heptahelischen Rezeptoren sowie ihre physiologische Relevanz unterstreichen die Notwendigkeit von GPCR-Ligand-Screening-Tools. Wie oben dargestellt, ist der PRESTO-Tango-Assay schnell, sensibel und benutzerfreundlich und verleiht sich der Arzneimittelentwicklung. Dieser Assay misst nicht nur die agonistisch-induzierte Aktivierung, sondern kann auch zur Quantifizierung der Aktivität von Anta...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile	NUNC	12-566
384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile	NUNC	12-566-1
384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid	ThermoFisher	12-565-390
Antibiotic-Antimycotic	Wisent	450-115-EL
D-Luciferin, sodium salt	GoldBio	LUCNA
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10-013-CV
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL	Eppendorf	4861000155
Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL	Eppendorf	4861000139
Matrix Platemate 2x3	ThermoFisher	801-10001
MicroBeta 1450 Wallac	Perkin Elmer
Penicilin-Streptomycin	Wisent	450-201-EL
Poly-L-Lysine hydrobromide	Millipore-Sigma	P2636-500MG
Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit	Addgene	Kit #1000000068