Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Özet

Zaman çözümlenmiş tek moleküllü protein kaynaklı floresan geliştirme, proteinlerdeki yerel yapısal değişikliklere duyarlı yararlı bir floresan spektroskopik yakınlık sensörüdür. Burada, daha uzun menzilli FRET cetveli kullanılarak ölçüldüğünde küresel olarak yapılandırılmamış ve kararsız olarak bilinen α-Synuclein'deki kararlı yerel konformasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Özet

Tek biyomoleküllerin ve dinamiklerinin birden fazla konformasyonunu izlemek için spektroskopik cetvellerin kullanılması, yapısal dinamiklerin anlaşılmasında ve biyolojiye katkılarında devrim yaratmasına neden oldu. FRET tabanlı cetvel 3-10 nm aralığındaki boyalar arası mesafeleri raporlarken, protein kaynaklı floresan geliştirme (PIFE) gibi diğer spektroskopik teknikler, daha kısa 0-3 nm aralığında bir boya ile protein yüzeyi arasındaki yakınlığı rapor eder. Tercih yöntemi ne olursa olsun, serbestçe dağılan biyomolekülleri teker teker ölçmedeki kullanımı, deneysel parametrenin histogramlarını alarak, her alt popülasyonun milisaniyeler içinde değişmeden kalan tek bir uyumu veya milisaniyeden çok daha hızlı bir şekilde kesişen birden fazla uyumu ve dolayısıyla ortalama bir alt popülasyonu temsil ettiği ayrı merkezi olarak dağıtılmış biyomolekül alt popülasyonlarını verir. Histogramlarda bildirilen parametrenin inter-boya FRET verimliliği olduğu tek moleküllü FRET'te, tampondaki α-Synuclein monomer gibi özünde düzensiz bir proteinin, daha önce hızla birbirine keneşen birden fazla konfektörden oluşan tek bir ortalama alt popülasyon sergilediği bildirilmiştir. Bu geçmiş bulgular FRET tabanlı cetvelin 3-10 nm aralığına bağlı olsa da, bu proteini, mekâna özgü sCy3 etiketli α-Synuclein proteinlerinin floresan ömrünü tek tek izlediğimiz tek moleküllü PIFE kullanarak test etmeye çalıştık. İlginçtir ki, bu daha kısa menzilli spektroskopik yakınlık sensörunu kullanarak, sCy3 etiketli α-Synuclein, 10-100 ms'de kesişen belirgin şekilde farklı ortalama ömürlere sahip birkaç ömür boyu alt popülasyon sergiler. Bu sonuçlar, α-Synuclein'in küresel olarak düzensiz olabileceğini, ancak yine de istikrarlı yerel yapılara sahip olduğunu göstermektedir. Özetle, bu çalışmada, yerel veya küresel yapısal değişiklikleri aynı anda bir biyomolekülden izleyen farklı spektroskopik yakınlık sensörleri kullanmanın avantajını vurguluyoruz.

Giriş

Son yirmi yılda, tek moleküllü floresan bazlı yöntemler biyomolekülleri ölçmek için güçlü bir araç^halinegelmiştir 1^,2, farklı biyomoleküler parametrelerin nasıl dağılacağını ve bu parametrelerin farklı alt popülasyonları arasında milisaniyenin altında çözünürlük 3 , 4^,5arasında dinamik olarak nasıl bir araya geldiklerini yoklar. Bu tekniklerdeki parametreler, FRET ölçümlerinde enerji transfer verimliliğini ^{içerir 6},⁷, floresan anizotropi^8,

Protokol

1. Plazmid dönüşümü

1. 0,5 L SOC ortamının hazırlanması
   1. 10 g tripton, 2,5 g Maya özü, 0,25 g sodyum klorür (NaCl), 0,1 g potasyum klorür (KCl) ağırlığındadır.
   2. Toplam 0,5 L hacme kadar çift damıtılmış su (DDW) ekleyin.
   3. Sodyum hidroksit (NaOH) ekleyerek pH 7'ye ayarlayın.
   4. 100 mL ve otoklav stok aliquots hazırlayın.
   5. Kullanmadan önce, 100 mL SOC'ye 0,5 mL steril magnezyum klorür (MgCl₂₎ve 1,8 mL steril glikoz ekleyin.
2. Buz üzerinde BL21 (DE3) yetkin Escherichia coli hücrelerini çözün.
3. Yetkin hücreleri hafifçe karıştırın.
4. İki adet 15 mL tüp hazırlayın. B....

Sonuçlar

Bir IDP olarak, başka bir biyomoleküle bağlı olmadığında, α-Syn, birkaç mikrosaniye⁴⁰ ve hatta yüzlerce nanosaniye^41'degeçişlerle birden fazla konformasyon arasında yapısal dinamikler sergiler. α-Syn konfokal noktayı geçtiğinde, konformasyonlar arasında binlerce geçişe maruz kalabilir. Gerçekten de, smFRET kullanıldığında durum böyleydi^39,40. Burada α-Syn'nin yerel konformasyon dinamikler.......

Tartışmalar

α-Syn'nin yapısal özelliklerini ve düzensiz doğasını incelemek için kapsamlı biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar yapıldı^{33,34,35,36,37,38}. Α-Syn monomerinin bağdan arındırılmış moleküler içi dinamiklerini araştırmak için birçok çalışma serbestçe dağıtıcı smFRET'i kullanmıştır. Bu çal.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merc	C7715	cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	A4418
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
cysteamine	Sigma-Aldrich	30070
dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube	Gene Bio-Application	MEGA320
dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fast SeeBand staining solution	Gene Bio-Application	SB050
Glycine	Sigma-Aldrich	50046
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES	Sigma-Aldrich	54457
HiTrap Desalting 5 mL	Sigma-Aldrich	GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX)	Sigma-Aldrich	238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I5502
LB broth	Sigma-Aldrich	L3152
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	63068
MonoQ column	Sigma-Aldrich	54807
protein LoBind tube	Sigma-Aldrich	EP0030108094	0.5 mL
Rinse a µ-slide 18	Ibidi	81816
SDS	Sigma-Aldrich	75746
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas	mini-plast	815-004-05-001
streptomycin sulfate	Sigma-Aldrich	S9137
sulfo-Cy3 maleimide	abcam	ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Sigma-Aldrich	75259
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	93363
Tryptone	Sigma-Aldrich	T7293
Yeast Extract	Sigma-Aldrich	Y1625