İn vivo İntradermal Candida albicans Enfeksiyonunda Kutanöz Dendritik Hücrelerin Diferansiyel Alt Kümelerinin Th17 Bağışıklığını İndükleme İşlevi

Özet

Burada, derin dermal Candida albicans enfeksiyonunun Th17 bağışıklığında kutanöz dendritik hücre alt kümelerinin in vivo fonksiyonunu gösterdik.

Özet

Deri, bir grup profesyonel antijen sunan hücre olan çeşitli dendritik hücre (DC'ler) içeren vücudun en dıştaki bariyer organıdır. Cilt istilacı patojenlerle karşılaştığında, farklı kutanöz DC'ler vücudu korumak için farklı bir T hücresi bağışıklık tepkisi başlatır. İstilacı patojenler arasında, mantar enfeksiyonu özellikle koruyucu bir interlökin-17 üreten Th17 bağışıklık tepkisine neden olur. Th17 bağışıklığını indüklemekten sorumlu kutanöz DC'lerin bir alt kümesini araştırmak için Th17 hücrelerini intradermal Candida albicans enfeksiyonu ile etkili bir şekilde ayırt etmek için bir protokol geliştirilmiştir. Akım sitometrisi ve gen ekspresyon analizleri, cildi boşaltan lenf nodlarında ve enfekte ciltte Th17 immün yanıtının belirgin bir indüksiyonunu ortaya çıkardı. Difteri toksininin neden olduğu DC alt kümesini tüketen fare suşları kullanılarak, CD301b ⁺ dermal DC'lerin bu modelde optimal Th17 farklılaşmasının montajından sorumlu olduğu bulundu. Bu nedenle, bu protokol, derin deri mantar enfeksiyonuna karşı Th17 bağışıklığını belirlemek için kutanöz DC'lerin diferansiyel alt kümelerinin in vivo fonksiyonunu incelemek için değerli bir yöntem sağlar.

Giriş

Deri, vücudu istilacı dış patojenlerden ve uyaranlardan koruyan en dıştaki bariyer organıdır¹. Deri, keratinositlerin tabakalı bir epiteli olan epidermis ve altta yatan dermis, yoğun bir kollajen ağı ve diğer yapısal bileşenler dahil olmak üzere iki ayrı katmandan oluşur. Birincil epitelyal bariyer dokusu olarak, cilt esas olarak fiziksel engeller sağlar ve çok sayıda yerleşik bağışıklık hücresi içerdiğinden ek immünolojik engellere katkıda bulunur ^2,3. Kutanöz immün hücreler arasında, dendritik hücreler (DC'ler), aktif olarak kendi kendine ve öz olmayan antijenleri alan ve antijenlerin doğasına göre antijene özgü T hücresi yanıtlarını ve toleransını başlatmak için bölgesel lenf düğümlerine (LN'ler) göç eden bir tür profesyonel antijen sunan hücrelerdir⁴.

Deri, epidermal antijen sunan hücreleri, yani Langerhans hücrelerini (LC'ler) ve dermal tip 1 konvansiyonel DC'ler (cDC1) ve dermal tip 2 konvansiyonel DC'ler (cDC2) dahil olmak üzere en az iki tip DC'yi ^{barındırır5}. Epidermal LC'ler embriyonik monositik kökenlidir ve homeostatik koşullar altında kendi kendini devam ettirerek hücre sayılarını korurlar⁶. Buna karşılık, dermal cDC1 ve cDC2 hematopoietik kök hücre kökenlidir ve DC'ye bağlı progenitörler⁵ tarafından sürekli olarak yenilenir. Kutanöz DC'ler, kabaca Langerin⁺ (LC'ler ve cDC1 dahil) ve CD11b⁺Langerin^- popülasyonlarına (esas olarak cDC2) ayrılan yüzey belirteçleri ile karakterize edilir. Ek olarak, bu grup CD11b⁺Langerin-DC popülasyonunun CD301b ekspresyon^7'ye göre iki alt kümeye ayrıldığını ortaya koymuştur.

Kutanöz DC'lerin önemli fonksiyonel özellikleri, esas olarak DC'lerin her bir alt kümesinin içsel doğası, DC'lerin in situ konumları, doku mikroçevresi ve lokal inflamatuar ipuçları⁸ tarafından belirlenen bir iş bölümüne odaklanır. Kutanöz DC'lerin bu fonksiyonel özellikleri, cildin belirli immün yanıt tipleri sırasında DC'lerin spesifik alt kümelerinin rolünün araştırılmasını gerektirir. Drenaj LN'lerinde kutanöz DC'ler tarafından antijenik stimülasyon üzerine, saf CD4 ⁺ T hücreleri, efektör^{fonksiyonlarını} 9 uygulamak için bir dizi tanımlanmış sitokin üreten yardımcı T hücrelerinin spesifik alt kümelerine farklılaşır. CD4 ⁺ yardımcı T hücresi alt kümeleri arasında, interlökin-17 (IL-17) üreten Th17 hücreleri, otoimmün hastalıklarda ve antifungal bağışıklıkta çok önemli bir rol oynar¹⁰. Bu bağlamda, kutanöz mantar enfeksiyonu, in vivo Th17 bağışıklığını incelemek için sağlam bir model olmuştur 11,12,13. Bantla soyulmuş deriler epikütan olarak Candida albicans (C. albicans) mayasına maruz kaldığında, epidermal LC'ler antijene özgü Th17 farklılaşmasının tetiklenmesinde çok önemli bir rol oynar¹⁴.

İntradermal C. albicans enfeksiyonuna karşı koruyucu bağışıklık, fibroblastların ve fagositlerin fibrinolitik aktivitesi gibi doğuştan gelen bağışıklık gerektirir¹⁵. Bununla birlikte, derin dermal C. albicans enfeksiyonunda Th17 bağışıklığının oluşturulmasında kutanöz DC alt kümelerinin rolü hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu yazıda, lokal ve bölgesel Th17 immün yanıtları üreten C. albicans'ın intradermal deri enfeksiyonu yöntemi anlatılmaktadır. Difteri toksini (DT) ile indüklenen DC alt küme tükenmesi fare suşlarının uygulanması, CD301b ⁺ dermal DC'lerin bu modelde Th17 bağışıklığı için çok önemli olduğunu ortaya koydu. Burada açıklanan yaklaşım, derin dermal invaziv mantar enfeksiyonuna Th17 yanıtının incelenmesine izin verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Tüm hayvan deneyleri Kurum Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır (IACUC, Onay No: 2019-0056, 2019-0055). Bu çalışma için 18-24 g ağırlığında yedi ila 9 haftalık vahşi tip (WT) C57BL / 6 dişi fareler kullanıldı. Bazı çalışmalar, aynı yaş ve ağırlıktaki dişi Langerin-difteri toksin reseptörü (DTR) ve CD301b-DTR fareleri kullanılarak yapılmıştır. Bir deney için her grupta dört ila altı fare kullanıldı ve veriler üç bağımsız deneyi temsil ediyor. Bu çalışma, Biyogüvenlik Seviye 3 koşulları altında gerçekleştirilmiştir ve kurumsal yönergelere göre Biyogüvenlik Seviye 2 koşulları altında da gerçekleştirilebilir (oda sıcaklığı 23 °C ± 3 °C, nem %50 ± %10).

1. Candida albicans'ın hazırlanması

NOT: Bu bölümdeki deneyler biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmiştir.

1. Streak C. albicans , SC5314'ü bir aşılama halkası ve iğne kullanarak bir maya-pepton-dekstroz-adenin (YPDA) agar plakasına süzer.
2. Plakayı 30 °C'de 2 gün boyunca baş aşağı inkübe edin.
   NOT: C. albicans içeren YPDA agar plakası 4 °C'de 1 aya kadar saklanabilir.
3. Steril bir pipet ucu kullanarak 50 mL'lik bir tüpte 10 mL YPDA ortamına aşılama için plakadan tek bir koloniyi izole edin.
4. 30 °C'de 230-250 rpm'de ~17 saat çalkalayarak inkübe edin.
5. Maya süspansiyonunu bir küvete yerleştirin ve OD 600 1.5-2.0'a ulaşana kadar bir UV-VIS spektrofotometre kullanarak her 30 dakikada bir₆₀₀ nm'de optik yoğunluğu (OD) ölçün.
   NOT: Bu adım 16-18 saat sürebilir.
6. Maya süspansiyonunu 1000 × g'da 5 dakika döndürün.
7. Süpernatanı atın ve maya hücrelerini uygun miktarda steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden süspanse edin.
8. Bir hemositometre kullanarak C. albicans hücrelerini sayın ve süspansiyonu 5 dakika boyunca 1000 × g'da döndürün.
9. Süpernatanı atın ve PBS'deki C. albicans hücrelerini, ayak pedi başına 40 μL PBS'de 1 × 10⁷ hücre konsantrasyonuna yeniden süspanse edin.
10. Isıyla öldürülmüş (HK) C. albicans'ın hazırlanması için, hücre sayısını belirledikten sonra bir ısıtma karıştırıcısı kullanarak 65 °C'de 60 dakika ısıtarak maya hücrelerini öldürün.

2. C. albicans ile fare ayak pedi enfeksiyonu

Şekil 1: İntradermal Candida albicans enfeksiyon modelinin şematik diyagramı. (A) Farelerin arka ayak tabanlarına 1 × 10⁷ C. albicans ile intradermal olarak enjekte edildi. 7 gün sonra, farelerin ayak pedleri intradermal enjeksiyon ile 1 × 10⁷ HK C. albicans'a yeniden maruz bırakıldı ve gecikmiş tip aşırı duyarlılık yanıtı antijen zorluğundan 24 saat sonra ölçüldü. C. albicans duyarlılığı sırasında lokal immün yanıt, cildi boşaltan LN'lerde 7 gün sonra analiz edildi. (B, C) C. albicans ile intradermal ayak tabanı enjeksiyonundan önce ayak tabanlarının görüntüleri.(D, E) C. albicans'ın sağ ayak tabanının derin dermisine enjeksiyonu. (F, G) Sağ ayak pedine ayak pedi enjeksiyonunu takiben kızarıklık ve şişlik klinik belirtileri. (H) C. albicans enjeksiyonunu takiben ayak tabanından popliteal LN'lere kadar lenfatik yolları gösteren bir eskiz. (I) C. albicans enjeksiyonundan 7 gün sonra diz arkasında bulunan ve (J) enjeksiyonsuz maruz kalan popliteal LN'ler. Kısaltmalar: HK = ısıyla öldürülmüş; LN'ler = lenf düğümleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Fareler yavaş bir solunum hızına sahip olana ve ayak parmağı veya kuyruk tutamaklarına geri çekilme tepkisi göstermeyene kadar fareleri bir indüksiyon odasında izofluran ile uyuşturun.
   NOT: Anestezi sırasında, özellikle 5 dakikadan uzun süren anestezi için göz kuruluğunu önlemek için göz merhemi önerilir.
2. Kapağı 31 G'lik bir iğneden çıkarın ve hücreleri karıştırdıktan sonra 0.3 mL insülin şırıngasını 1.9. adımdan itibaren hazırlanan C. albicans ile yükleyin.
3. Anestezi uygulanmış fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve 40 μL maya hücrelerini (1 × 10⁷ hücre) C. albicans duyarlılığı için sağ ayak tabanının derin dermisine nazikçe enjekte edin.
   NOT: Bir ayak tabanına enjekte edilebilecek maksimum hacim 50 μL'dir.
4. Şırınga iğnesini enjeksiyon bölgesinden yavaşça çekin.
5. Her fareyi anesteziden tamamen iyileşene kadar tek başına bir kafese koyun ve ardından güvenli bir şekilde ev kafesine geri koyun.
6. Antijene özgü bir yanıt geliştirmek için C. albicans , daha önce tarif edildiği gibi, duyarlılıktan 7 gün sonra intradermal enjeksiyon yoluyla hazırlanan HK C. albicans ile farelerin sağ ayak tabanına meydan okuyun (1 × 10⁷ hücre; ayak pedi başına 40 μL; 2.1-2.5 adımlarını tekrarlayın).
7. Bir CO₂ odasında ötenaziden sonra antijen uyarısından 24 saat sonra C. albicans duyarlılığından veya lezyonel ayak tabanı dokularından 7 gün sonra cildi boşaltan LN'leri hasat edin.

3. İn vivo difteri toksininin neden olduğu dendritik hücre tükenmesi

NOT: Bu çalışmada, hem Langerin-DTR hem de CD301b-DTR fareleri, C. albicans'a karşı intradermal sensitizasyondan 1 gün önce ve sonra DT ile tedavi edildi.

1. PBS'de 10 μg / mL'lik bir DT çözeltisi hazırlayın.
2. 1 mL'lik bir insülin şırıngasının iğnesinden kapağı çıkarın, DT'yi karıştırın ve şırıngayı DT ile doldurun.
3. Fareleri baş aşağı pozisyonda uygun şekilde tutun.
4. Farelerin ventral tarafını% 70 etanol ile dezenfekte edin.
5. Spesifik dendritik hücre alt kümelerini tüketmek için her fareye 100 μL 1 μg DT intraperitoneal olarak karnın sol alt kadranına yavaşça enjekte edin.
   NOT: Enjeksiyon sırasında organlara zarar vermemeye dikkat edin.
6. 5 saniye bekleyin; Ardından iğneyi yavaşça çıkarın.

4. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu

1. Fareyi, solunum hareketi gözlenene kadar bir CO₂ odasına yerleştirin.
2. Fareyi% 70 etanol ile dezenfekte edin ve lezyonu arka ayak pedi derisinden forseps ve makas kullanarak küçük parçalar halinde kesin.
3. Dilimlenmiş dokuları tamamen RNA izolasyon reaktifine daldırın.
4. Numuneleri üreticinin talimatlarına göre bir doku homojenizatörü kullanarak homojenize edin (30 Hz'de 3 dakikalık 2 döngü).
   NOT: Bu çalışmada doku lizisi için paslanmaz çelik boncuklar kullanılmıştır.
5. 10.000 × g'da 5 dakika, 4 °C döndürün.
6. Süpernatanı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın.
7. Bir total RNA izolasyon kiti kullanarak lezyonel deriden total RNA'yı izole edin.
8. Bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak RNA konsantrasyonunu belirleyin.
9. Kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) için bir ters transkripsiyon kiti kullanarak cDNA'yı sentezleyin.
10. Yeşil floresan boya kullanarak PCR döngüleri sırasında çift sarmallı DNA sentezini izleyerek gerçek zamanlı PCR sistemi ile gerçek zamanlı qPCR gerçekleştirin.
    NOT: Bu çalışmada sonuçlar hipoksantin-guanin fosforibosiltransferaz (Hprt) seviyesine normalize edildi. Primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir ve PCR protokolü aşağıdaki gibidir: 30 saniye boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon, 42 döngü için amplifikasyon (5 saniye için 95 ° C, 30 saniye için 60 ° C).

5. Hücre izolasyonu ve akış sitometrik analizi

1. CO₂ ötenazisinden sonra, fareleri forseps ve makas kullanarak inceleyin, diz arkasında bulunan popliteal LN'ler olarak adlandırılan ayak tabanını boşaltan LN'leri dikkatlice açığa çıkarın ve hasat edin.
2. 3 mL'lik bir şırınganın pistonu kullanılarak homojenizasyondan sonra dokuları 70 μm'lik bir süzgeçten süzerek her farenin ayak tabanını boşaltan LN'lerinden tek hücreli süspansiyonlar hazırlayın.
3. Hücreleri PBS ile yıkayın ve 500 × g'da 4 ° C'de 5 dakika döndürün.
4. Süpernatanı atın ve hücreleri tekrar PBS ile yıkayın.
5. 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika döndürün.
6. Süpernatanı atın ve hücreleri, 55 μM β-merkaptoetanol, 50 ng / mL forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) ve 500 ng / mL iyonomisin içeren tam RPMI-10 ortamında yeniden süspanse edin T hücresi stimülasyonu için 24 oyuklu bir plakada.
7. 1 saat sonra, hücre süspansiyonuna 10 μg / mL brefeldin A ve 1000x monensin ekleyin ve 5 saat daha kültürleyin.
8. Hücreleri hasat edin ve floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponu ile yıkayın.
9. 500 × g'da 4 ° C'de 5 dakika döndürün ve süpernatanı atın.
10. Ölü hücreleri sabitlenebilir bir ölü hücre boyama boyası ile boyayın ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
11. Numuneleri FACS tamponu ile yıkayın ve 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika döndürün.
12. Süpernatanı atın ve hücreleri florokrom konjuge yüzey işaretleyici antikorlar ve Fc reseptör blokeri ile 4 ° C'de 30 dakika boyunca boyayın.
13. Numuneleri FACS tamponu ile yıkayın ve 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika döndürün.
14. Süpernatanı atın ve peletlenmiş hücreleri hücre içi boyama için 4 ° C'de 15-20 dakika boyunca fiksasyon ve geçirgenleştirme solüsyonunda yeniden süspanse edin.
15. Numuneleri 1x yıkama tamponu ile yıkayın ve 500 × g'da 4 °C'de 5 dakika döndürün.
16. Süpernatanı atın ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca hücre içi sitokin boyaması yapın.
17. Numuneleri 1x yıkama tamponu ile yıkayın ve 500 x g'da 4 °C'de 5 dakika döndürün.
18. Hücreleri uygun hacimde (200-300 μL) FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
19. Akış sitometrisi kullanarak protein ekspresyonunu analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada, kutanöz DC aracılı Th17 immün yanıtının rolünü in vivo olarak incelemek için C. albicans'ın intradermal bir enfeksiyon modelini gösterdik. Ayak tabanına C. albicans ile ilk intradermal enjeksiyonu takiben, cildi boşaltan LN'ler genişledi (Şekil 2A). Duyarlılık periyodu sırasında, CD4 ⁺ 'nın CD8 ⁺ efektör T hücrelerine oranı önemli ölçüde artmıştır (Ş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yazıda, Th17 immün yanıtında kutanöz DC'lerin rolünün in vivo olarak incelenmesine izin veren bir intradermal C. albicans enfeksiyonu yöntemi tanımlanmıştır. DT ile indüklenen fare suşları ile multiparametrik akış sitometrik analizi uygulayarak, CD301b⁺ dermal DC'lerin derin dermal C. albicans enfeksiyonuna karşı Th17 bağışıklığını başlatmak için çok önemli bir kutanöz DC alt grubu olduğunu bulduk. Ayrıca, sonuçl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL (31 G) insulin syringe	BD	328822
1x  Perm/Wash buffer	BD	554723
1 mL (30 G) syringe insulin syringe	BD	328818
24 well-plate	Falcon	353047
50 mL conical tube	Falcon	50050
70 μm strainer	Falcon	352350
70% ethanol
ABI StepOnePlus real-time PCR system	Applied Biosystems
Anesthesia chamber	Harvard Apparatus
Brefeldin A	BD	BD 555029
β-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
Candida albicans strain SC5314			provided by Daniel Kaplan at Pittsburgh University
CD3	BioLegend	100216	Clone 17A2
CD301b-DTR mice			provided by Akiko Iwasaki at Yale University
CD4	BioLegend	100408	Clone GK1.5
CD44	eBioscience	47-0441-80	Clone IM7
CD8a	BD Biosciences	553031	Clone 53.6.7
Centrifuge
Clicker counter
Cuvette	Kartell	KA.1938
Cytofix/Cytoperm solution	BD	554722
Diphtheria toxin (DT)	Sigma
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Welgene	LB001-02
FACS (Fluorescence-activated cell sorting) buffer	In-house
Fc receptor blocker	BD	553142
Fetal bovine serum (FBS)	Welgene	S101-07
Forceps	Roboz		for harvesting sample
Hemocytometer	Fisher Scientific	267110
Hybrid-R total RNA kit	GeneAll Biotechnology	305-101
hydroxyethyl piperazine ethane sulfonic acid (HEPES)	Gibco	15630-080
IL-17A (intracellular cytokine)	BioLegend	506912	Clone TC11-18H10.1
Ionomycin	Sigma	I0634
Isoflurane
Langerin-DTR			provided by Heung Kyu Lee at Korea Advanced Institute of Science and Technology
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit	Invitrogen	L34957
Loop and Needle	SPL	90010
Monensin	BD	BD554724
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Penicillin	Gibco	15140-122
Petri dish	SPL	10090
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma	P8139
PrimeScript RT Master Mix	Takara Bio	RR360A
RPMI 1640	Gibco	11875-093
Scissors	Roboz		for harvesting sample
Stainless Steel Beads, 5 mm	QIAGEN	69989
Sterile pipette tip
SYBR Green Premix Ex Taq II	Takara Bio	RR820A
TCRβ	BioLegend	109228	Clone H57-597
ThermoMixer C	Eppendorf
TissueLyser	QIAGEN
UV-VIS spectrophotometer	PerkinElmer
Wild-type C57BL/6 mice	Orient Bio		7- to 9-week-old mice were used
Yeast-peptone-dextrose-adenine (YPDA) medium, liquid, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose)
YPDA agar plate, sterile (1% yeast extract, 2% Bacto peptone, 2% dextrose, 2% Bacto agar)