İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi

Özet

Doğası gereği düzensiz proteinlerde zayıf ve geçici moleküller arası ve moleküller arası etkileşimleri tespit etmek için paramanyetik gevşeme geliştirme NMR spektroskopisinin uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Proteinler içindeki doğal olarak düzensiz proteinler ve içsel olarak düzensiz bölgeler, insan proteomunun büyük ve işlevsel olarak önemli bir bölümünü oluşturur. Bu dizilerin oldukça esnek doğası, çeşitli biyomoleküler ortaklarla zayıf, uzun menzilli ve geçici etkileşimler oluşturmalarına izin verir. Spesifik ancak düşük afiniteli etkileşimler, rastgele bağlanmayı teşvik eder ve özünde düzensiz tek bir segmentin çok sayıda hedef bölgeyle etkileşime girmesini sağlar. Bu etkileşimlerin geçici doğası nedeniyle, tek ve baskın bir konformasyon oluşturmak için proteinlere dayanan yapısal biyoloji yöntemleriyle karakterize edilmeleri zor olabilir. Paramanyetik gevşeme geliştirme NMR, zayıf ve geçici etkileşimlerin yapısal temelini tanımlamak ve tanımlamak için yararlı bir araçtır. Doğası gereği düzensiz proteinler ile bunların proteini, nükleik asidi veya diğer biyomoleküler ortakları arasında oluşan düşük nüfuslu karşılaşma komplekslerini karakterize etmek için paramanyetik gevşeme geliştirmesini kullanmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Giriş

İçsel bozukluk (ID), kendiliğinden stabil ikincil veya üçüncül yapılara katlanmayan, ancak biyolojik olarak aktif olan proteinleri (IDP'ler) veya proteinler (IDR'ler) içindeki bölgeleri tanımlar. Genel olarak, IDP/IDR'lerin işlevi, fizyolojik koşullarda biyomoleküllerle spesifik ancak geri dönüşümlü etkileşimleri kolaylaştırmaktır¹. Bu nedenle, IDP'ler ve IDR'ler, çoklu protein komplekslerinin işe alınması, organizasyonu ve stabilizasyonu dahil olmak üzere bir dizi hücresel fonksiyonda yer alır, örneğin, splisozom^2'nin montajı ve aktivitesi, DNA hasarı³ bölgelerinde bileşenlerin işe alınması ve organizasyonu, transkripsiyon komplekslerinin⁴ veya kromatin yeniden şekillendirici BAF^5'in işe alınmasının organizasyonu ve stabilizasyonu. Ek olarak, IDP'ler, farklı bağlanma ortakları için rastgele cinsel ilişkilerinin hücresel protein ağları aracılığıyla bilgi aktarımına aracılık etmelerini sağladığı sinyal bağlantı noktalarında bulunur⁶. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, IDR bölgelerinin sıvı-sıvı faz ayırma işlemi yoluyla biyomoleküler kondensatlar oluşturarak kendi kendine birleşme eğilimini de ortaya koymuştur⁷. ID'yi içeren yukarıda bahsedilen işlevlerin birçoğunun artık kondens oluşumunun bir yönünü de içerdiği düşünülmektedir⁸. ID'nin biyomoleküler kompleks montajı, stabilizasyonu, iskelesi ve sinyal iletimi için önemine rağmen, IDP'ler ve IDR'ler tipik olarak x-ışını kristalografisi veya kriyojenik elektron mikroskobu kullanılarak yapısal araştırmalara uygun olmadığından, spesifik etkileşimlerinin atomik ayrıntılarının tanımlanması zordur.

Nükleer manyetik rezonans (NMR), sert veya homojen yapısal toplulukların varlığına bağlı olmadığı, ancak tek tek çekirdeklerin yakın yerel ortamı hakkında rapor verdiği için ID'yi araştırmak için ideal bir tekniktir. Belirli bir moleküldeki bir çekirdeğin rezonans frekansı veya kimyasal kayması, yerel elektronik dağılımın neden olduğu zayıf manyetik alanlardan etkilenir ve bu da bağ uzunluklarına, açılarına, diğer çekirdeklerin yakınlığına, bağlanma ortaklarıyla etkileşimlere ve diğer faktörlere^{bağlıdır 9}. Böylece, her çekirdek, yerel kimyasal ortamındaki değişikliklere duyarlı, benzersiz, bölgeye özgü bir yapısal prob görevi görür. Bu avantajlara rağmen, NMR bir yığın tekniğidir ve gözlemlenen kimyasal kayma, belirli bir çekirdek tarafından örneklenen tüm ortamların ortalamasıdır. Birçoğu bu sayıda açıklanan bir dizi NMR tekniği, ortalama kimyasal kaymada^10,11 bulunan yüksek enerjili^, düşük nüfuslu biyomoleküler konformasyonlar hakkında yapısal, dinamik ve kinetik bilgileri geri kazanmak için geliştirilmiştir. Geçici olarak doldurulmuş olmasına rağmen, bu durumların tanımlanması ve ölçülmesi, işlevsel mekanizmaların ayrıntılarını belirlemek için önemlidir¹². Örneğin, IDP'ler ve IDR'ler söz konusu olduğunda, konformasyonel topluluk, fizyolojik bağlanma ortaklarıyla karşılaşma komplekslerinin oluşumu için üretken olan konformasyonları tercihen örneklemek için önyargılı olabilir. Bu durumların tespiti ve kalıntıya özgü moleküller arası ve moleküller arası etkileşimlerin ve dinamiklerin tanımlanması, protein fonksiyonunun ve kompleks oluşumunun altında yatan yapısal mekanizmaları belirlemek için önemlidir.

IDP/IDR aracılı biyomoleküler komplekslerin oluşumu için önemli olan geçici, düşük nüfuslu durumları araştırmak için paramanyetik gevşeme geliştirme (PRE) NMR'yi kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır¹³. Bu yaklaşım, α-sinüklein 14,15'ten amiloid fibrillerin montajını veya FUS^16'nın kendi kendine birleşmesini destekleyenler gibi geçici protein-protein etkileşimlerini incelemek ve ayrıca sinyal proteinleri ¹⁷ arasındaki gibi spesifik protein-protein etkileşimlerini karakterize etmek için kullanışlıdır. Spesifik moleküller arası ve moleküller arası etkileşimlerin tercihli olarak sıkıştırılmış durumların yanı sıra kendi kendine birleşmeyi yönlendiren bölgeye özgü etkileşimlerle sonuçlandığı, kendi kendini ilişkilendiren bir IDP örneği sunulmaktadır.

PRE, bir çekirdeğin, genellikle bir nitroksit grubu üzerinde eşleşmemiş bir elektron şeklinde veya bir paramanyetik metal atomu¹⁸ olarak sağlanan izotropik bir g-tensörü ile bir paramanyetik merkeze manyetik dipolar etkileşiminden kaynaklanır (Şekil 1). Anizotropik g-tensörlü atomlar da bir PRE etkisi üretirken, bu sistemlerin analizi, yalancı temas kaymaları (PCS) veya artık dipolar eşleşmenin (RDC) katkıda bulunduğu karıştırıcı etkiler nedeniyle daha ^zordur13,19. Bir çekirdek ile paramanyetik merkez arasındaki etkileşimin gücü, ikisi arasındaki <^r-6> mesafesine bağlıdır. Bu etkileşim, nükleer gevşeme oranlarında bir artışa neden olur, bu da uzun menzilli etkileşimler (~ 10-35 Å) için bile tespit edilebilir çizgi genişlemesine neden olur, çünkü eşleşmemiş elektronun manyetik momenti çok güçlüdür^20,21. PRE ile geçici durumların tespiti, aşağıdaki iki koşulun karşılanması durumunda mümkündür; (1) geçici etkileşim, NMR zaman ölçeğinde hızlı bir değişim içindedir (gözlemlenen kimyasal kayma, değiş tokuş durumlarının nüfus ağırlıklı ortalamasıdır); ve (2) çekirdeklerin paramanyetik merkez mesafesi, geçici nüfuslu durumda ana durum^11'den daha kısadır. Enine PRE, Γ₂ ile gösterilir ve pratik amaçlar için, bir paramanyetik merkez içeren bir numune ile bir diyamanyetik kontrol arasındaki ¹H enine gevşeme oranlarındaki farktan hesaplanır. Hızlı ve yavaş değişim rejimlerinde PRE teorisinin ve ilgili sözde temas kaymalarının derinlemesine bir tedavisi için, okuyucu Clore ve çalışma arkadaşları^13,22 tarafından yapılan kapsamlı incelemelere yönlendirilir. Burada sadece ¹H N-Γ_2'nin hızlı değişim rejiminde olduğu durum dikkate alınır, burada PRE'nin ^r-6 bağımlılığı nedeniyle, gözlenen gevşeme oranı hem paramanyetik merkezin çekirdeğe yaklaştığı mesafe hem de bu konformasyonda geçirdiği süre ile ilgilidir. Bu nedenle, yakın bir yaklaşım içermeyen geçici konformasyonlar küçük bir PRE üretirken, daha yakın etkileşimler, kısa ömürlü olsa bile, daha büyük bir PRE üretecektir.

IDP'ler için PRE, tek bir molekül içinde (molekül içi) ve ayrı moleküller (termoleküler) arasında meydana gelen etkileşimleri ölçmek ve ayırt etmek için kullanılır. Bir NMR görünür (örneğin, ¹⁵N-etiketli) veya NMR görünmez (örneğin, doğal bolluk ¹⁴N) proteinine bir paramanyetik merkez ekleyerek, PRE'nin kaynağı (moleküller arası veya moleküller arası) belirlenebilir (Şekil 2). Bir sistein kalıntısı ekleyen bölgeye yönelik mutajenez, bir proteine bir paramanyetik merkez (spin-label) eklemek için uygun bir yaklaşımdır²³. Metal şelatlama (EDTA bazlı) ve serbest radikal (nitroksit bazlı) dahil olmak üzere spin etiketleri olarak kullanılmak üzere çeşitli molekül türleri ^{önerilmiştir24}. Çeşitli nitroksit spin etiketleri tanımlanmıştır ve methanetiosülfonat, maleimid ve iyodoasetamid^25,26 gibi farklı sistein reaktif kimyaları ile mevcuttur (Şekil 1). Etiketin veya bağlayıcının doğal esnekliği belirli analizler için sorunlu olabilir ve bu durumlarda, etiketin hareketini sınırlamak için hacimli kimyasal gruplar eklemek veya etiketi proteine sabitlemek için ikinci bir bağlayıcının kullanılması gibi farklı stratejiler önerilmiştir (iki bölge eki)^{27, 28}. Ek olarak, ticari olarak temin edilebilen etiketler diastereomerik proteinler içerebilir, ancak genellikle bu, gözlemlenen PRE^29'a katkıda bulunmayacaktır. Maleimid kimyası yoluyla serbest bir sisteine bağlanan 3-Maleimido-PROXYL'in kullanımı, kolayca temin edilebildiği, uygun maliyetli, geri dönüşümsüz olduğu ve indirgeyici ajan tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) etiketleme reaksiyonu boyunca çözelti içinde tutulabildiği için açıklanmaktadır. 3-Maleimido-PROXYL izotropik bir g-tensöre sahip olduğundan, hiçbir PCS veya RDC indüklenmez ve aynı kimyasal kayma atamaları hem paramanyetik hem de diyamanyetik numuneler^{için kullanılabilir 13}.

¹H N-T₂, daha önce 8 ila 12 zaman noktasından oluşan tam bir evrim serisini toplamak kadar doğru olduğu gösterilen iki zaman noktası stratejisi (T _a, T_b) kullanılarak ölçülür³⁰. İlk zaman noktası (T _a) pratik olarak sıfıra yakın olarak ayarlanır ve ikinci zaman noktasının optimum uzunluğu, belirli bir numune için beklenen en büyük PRE'nin büyüklüğüne bağlıdır ve şu şekilde tahmin edilebilir: T_b ~ 1.15/(R 2,dia + Γ 2) burada R_2,dia, diyamanyetik numunenin _R2'sini temsil eder¹³. En büyük PRE'lerin büyüklüğü bilinmiyorsa, T_b'yi proteinin 1 H T2'sinin ^~bir katına ayarlamak iyi bir başlangıç tahminidir ve sinyali gürültüye iyileştirmek için _T2'yi ayarlayarak daha da optimize edilir. Bu iki noktalı ölçüm stratejisi, PRE'leri ölçmek için gereken deneysel süreyi önemli ölçüde azaltır ve özellikle moleküller arasındaki spesifik olmayan temasların etkilerini en aza indirmek için nispeten seyreltik numuneler kullanıldığından, daha fazla sinyal ortalaması için zaman sağlar. ¹H N-T2'yi ölçmek için HSQC tabanlı bir darbe dizisi kullanılır ve başka bir yerde^{ayrıntılı olarak açıklanmıştır 30}. Daha iyi hassasiyet için, ileri ve geri BECERIKLİ transferlerin sert darbeleri şekilli darbelerle değiştirilebilir; alternatif olarak, dizi kolayca TROSY tabanlı bir okuma^31'e dönüştürülür. IDP'ler tipik olarak, benzer büyüklükteki küresel proteinlerden daha dar çizgi genişliklerine (doğal bozukluk nedeniyle) neden olan çok daha uzun enine gevşeme oranlarına sahip olduklarından, spektral çözünürlüğü iyileştirmek ve IDP'lerin doğasında bulunan kimyasal kayma dağılım sınırlamasını hafifletmek için dolaylı boyutta uzun alım süreleri kullanılabilir.

PRE, protein-protein ve protein-nükleik asit etkileşimlerini, özellikle geçici veya düşük nüfuslu etkileşimleri incelemek için yararlı bir araçtır. Protein saflaştırma, sahaya yönelik spin etiketleme, nabız programının ayarlanması ve kalibre edilmesi, NMR verilerinin işlenmesi ve yorumlanması dahil olmak üzere PRE'leri ölçmek için uygun bir NMR numunesinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sağlanır. Numune konsantrasyonu, spin etiketinin seçimi ve paramanyetik bileşenlerin çıkarılması dahil olmak üzere veri kalitesini ve deneysel sonucu etkileyebilecek önemli deneysel hususlar not edilmiştir.

Protokol

Protokol için genel gereksinimler: protein saflaştırma tesisleri, UV-Vis spektrometresi, yüksek alanlı NMR spektrometresi ve işletim yazılımı, işlem sonrası analiz yazılımı; NMRPipe³², Sparky 33 (veya CCPN Analizi 34 veya NMRViewJ³⁵).

1. PRE ölçümleri için bir proteinin rekombinant ekspresyonu ve saflaştırılması

1. İlgilenilen protein için tek bir sistein kalıntısı olacak şekilde bir ekspresyon yapısı tasarlayın. İlgilenilen proteinde farklı pozisyonlarda serbest bir sistein eklemek için çoklu mutasyonlar gerekecektir³⁶.
2. Yerleşik bir protokol³⁷ kullanarak ilgilenilen proteinin doğal bolluğu (¹⁴N) veya ¹⁵N etiketli bir örneğini ifade edin ve saflaştırın.
   NOT: E. coli ekspresyon sistemleri, ¹⁵ N'lik izotopik zenginleştirme, biyomoleküler heteronükleer NMR spektroskopisi için minimum bir gereklilik olduğundan, rekombinant protein ekspresyonu için uygun maliyetli ve sağlam bir yöntem sağlar. Tipik adımlar, minimal ortamda ekspresyon, kromatografik saflaştırma ve afinite saflaştırma etiketinin çıkarılmasıdır. Bu protokol, NMR araştırmaları için uygun kalitede yeterli protein üretebilen sağlam bir ekspresyon ve saflaştırma protokolünün oluşturulduğunu varsayar.
   1. Serbest sisteinin reaksiyonunu ve IDP'ler için moleküller arası disülfür bağlarının oluşumunu önlemek için tüm saflaştırma adımlarında tamponlarda 1 mM indirgeyici ajan (DTT veya TCEP) bulundurun.
      NOT: Bazı sistemler, proteinin spesifik özelliklerinin yanı sıra saflaştırma için seçilen sıcaklık, pH ve tampon sistemine bağlı olarak indirgeyici olmayan koşullara daha toleranslı ve daha az agregasyona eğilimli olabilir³⁸.
   2. Devam etmeden önce saflaştırma için kullanılan afinite etiketlerini çıkarın, çünkü bunlar proteinle öngörülemeyen şekillerde spesifik olmayan bir şekilde etkileşime girebilir veya muhtemelen yanlışlıkla istenmeyen bir bağlanma bölgesi olarak hizmet edebilecek reaktif sistein kalıntıları içerebilir.
   3. Çözücü PRE'lerin katkısını değerlendirmek için spin etiketinin çözünür bir versiyonu ile karıştırılmış sistein mutasyon(lar)ı olmadan ¹⁵N etiketli bir referans numunesi hazırlayın.

2. 3-Maleimido-PROXYL nitroksit spin etiketinin konjuge edilmesi

1. Saflaştırılmış proteini 50 mM Tris pH 7 ve 1 mM TCEP içeren gazı alınmış bir tamponda saklayın veya değiştirin; tampon ayrıca protein çözünürlüğüne yardımcı olmak için gerekirse 8 M'ye kadar üre içerebilir.
   Alternatif olarak, bir protein stok çözeltisini, gazı alınmış 50 mM Tris pH 7 ve 1 mM TCEP tamponunun en az 10 hacim eşdeğerine hızla seyreltin. Spin etiketi eklemeden önce protein konsantrasyonunun en az 100 μM olduğundan emin olun.
2. İlgilenilen proteinin 20x molar fazlasına bir stok çözeltisinden 3-Maleimido proxyl ekleyin. Numuneyi ışıktan ve oksijenden koruyun ve gece boyunca oda sıcaklığında veya 4 °C'de inkübe edin; Nazik sallama veya nutasyon, etiketleme verimliliğini artırabilir.
3. 3-Maleimido proxyl tozunu %95 etanol içinde çözerek spin etiketinin stok çözeltilerini hazırlayın. Stokların tamamı -80 °C'de 6 aydan daha kısa süre saklanabilir.
4. Kritik adım: Spesifik olmayan çözücü PRE'leri önlemek için reaksiyona girmemiş serbest spin etiketini çıkarın. Bunu, protein örneğinin jel filtrasyonu veya (tercihen) kapsamlı diyalizi ile elde edin. Bu adım aynı zamanda proteini NMR için uygun bir tampona sokacaktır.
   NOT: İndirgeyici maddeler taze olarak hazırlanmalı ve tampon bileşenleri arasındaki uyumluluk dikkate alınmalıdır; örneğin, TCEP fosfat bazlı tamponlarda hızla bozunur ve bu kombinasyondan kaçınılmalıdır³⁹.
5. Bu adımdan itibaren kullanılan tüm tamponlara, paramanyetik iyonları veya spin etiketli söndürücüleri uzaklaştırmak için iki değerlikli ve geçiş metalleri için seçici bir şelatlama reçinesi uygulayın. Protein bir NMR tamponunda saklanamıyorsa, hızla seyreltilecek proteini NMR için uygun bir tampona konsantre edin.
6. Spin-label birleştirme verimliliğinin izlenmesi.
   1. ^{Çözelti 40'taki} serbest sülfhidril gruplarını ölçmek için Ellman reaktifini (5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzoik asit) kullanın.
      NOT: Ayrıntılı protokoller üreticiden temin edilebilir. Buradaki amaçlar için, spin etiketinin dahil edilmesinin belirlenmesi önemlidir, serbest sülfhidril gruplarının konsantrasyonu toplam protein konsantrasyonu ile karşılaştırılır. Serbest sülfhidril gruplarının yüzdesi, nitroksit spin etiketi iliştirilmemiş moleküllerin yüzdesidir.
   2. İlgilenilen proteine spin-etiket katılımını değerlendirmek için etiketli sistein kalıntısına karşılık gelen pikin yoğunluğunu izleyin.
      NOT: Bu, proteinin spin etiketleme derecesini belirlemek için hızlı ve etkili bir yaklaşımdır. Spin etiketinin tamamen dahil edilmesi, tepe noktasının spektrumdan kaybolmasına neden olacaktır. IDP'lerin zayıf dağılım karakteristiği ile mutant sistein kalıntısına karşılık gelen tepe noktası her zaman kolayca tanımlanamayabilir ve bu nedenle Ellman reaktifinin (adım 2.6.1) kullanılması önerilir.

3. Molekül içi veya moleküller arası PRE'yi ölçmek için NMR numunesi hazırlayın

1. Molekül içi PRE ölçümü için numune hazırlayın
   1. NMR için uygun bir tamponda en az 100 μM, ancak 300 μM'den fazla olmayan bir konsantrasyona kadar ¹⁵N izotopik olarak zenginleştirilmiş, spin etiketli protein hazırlayın. Toplam numune hacmi (_D2Odahil) 500 - 550 μL'dir.
      NOT: Yaygın NMR tamponları arasında fosfat, asetat, (bi)karbonat ve TRIS bulunur. MES, HEPES gibi iyi tamponlar da uygun olabilir. Diğer çözelti bileşenleriyle çapraz reaktivite olmamasını sağlamak için arabellekleri seçerken dikkatli olun.
   2. Su ile amid proton değişiminin etkilerini en aza indirmek için pH'ın ~7.2 veya daha düşük olduğundan emin olun. Tuz konsantrasyonunu mümkün olduğunca düşük tutun (tipik olarak 150 mM'den az), ancak birincil husus protein stabilitesini korumaktır.
      NOT: Yüksek tuz koşullarında NMR deneyleri yürütme yaklaşımları başka bir yerde^{açıklanmıştır 41}.
2. Moleküller arası PRE ölçümü için numune hazırlayın
   1. Bu adımı veya adım 3.1'i izleyin; Aynı anda yapılmazlar. Seçilen NMR tamponunda ¹⁴N doğal bolluk, spin etiketli protein hazırlayın.
   2. Protein numunesini, ¹⁵N izotopik olarak zenginleştirilmiş, spin etiketli olmayan proteini, %1-50 ¹⁴N doğal bolluk, spin etiketli protein ile karıştırarak hazırlayın, böylece nihai konsantrasyon 3.1.1'de hazırlanan numune ile aynı olur. Toplam numune hacmi (_D2Odahil) 500 - 550 μL'dir.
   3. İncelenen her protein için ¹⁵N ve ¹⁴N proteinlerinin oranını ampirik olarak optimize edin. ¹⁴N-spin etiketli proteinin %1, %5 ve %20 oranları iyi başlangıç noktalarıdır.
      NOT: Eklenen ¹⁴N-spin etiketli proteinin bir fonksiyonu olarak PRE'nin birikmesi, belirli bir etkiyi gösterir; gözlemlenen PRE, mesafeye ve popülasyona (yukarıda tartışıldığı gibi) bağlı olduğundan örneğe özgüdür ve bu nedenle, etkileşim özellikle geçici ise daha yüksek oranlarda ¹⁴N-spin etiketli protein gerekli olacaktır¹⁷.
3. NMR (molekül içi veya moleküller arası) numuneyi, uzun saplı (5") cam pipet veya mikropipet kullanarak yüksek alanlı mıknatıslarda kullanıma uygun 9 mm'lik bir NMR tüpüne aktarın. Alan kilitlemeyi kolaylaştırmak için tüm NMR numunelerinin %5-10 D_2Oiçerdiğinden emin olun.
   NOT: Gerekli numune hacmini azaltmak için polimer tapalar kullanan NMR tüpleri, etkili numune şimleme ile ilgili zorluklar nedeniyle PRE ölçümleri için önerilmez.

4. NMR spektrometresini ayarlayın ve belirli parametreleri deneyin

1. Süper iletken, yüksek alanlı NMR spektrometreleri etrafında çalışırken çok dikkatli olun.
   NOT: Tehlikeler, metalik nesnelerin mıknatısa doğru ani hızlanmasından kaynaklanan yaralanmaları, implante edilmiş tıbbi cihazlarla etkileşimi ve bir mıknatısın sönmesi durumunda_N2 ve He₂ gazının aniden salınmasından kaynaklanan boğulmayı içerir. Aşağıdaki adımlar, okuyucunun gerekli eğitimden geçtiğini, bu ve diğer yerel tehlikelerin farkında olduğunu ve NMR spektrometresini çalıştırmak için tesis yöneticisinden onay aldığını varsayar. Bir adım veya talimattan şüphe duyduğunuzda, olası kişisel yaralanmaları veya spektrometrenin hasar görmesini önlemek için tesis yöneticisine veya deneyimli kullanıcıya danışın.
2. Aşağıdaki adımlarda, satın alma kontrol yazılımının modern bir sürümünü çalıştıran ticari bir NMR spektrometresi varsayılmaktadır. Darbe programını ve parametre dosyalarını indirin ve bunları uygun dizinlere yerleştirin.
   NOT: Bruker spektrometresi ve TopSpin (3.2 veya üstü) ile kullanıma uygun bir darbe programı ve parametre seti, yazarlardan talep üzerine temin edilebilir.
   1. Kritik adım: Yerel olmayan NMR darbe programlarının kurulumuna aşinalık varsayılır; Gerekirse tesis yöneticisine veya deneyimli bir kullanıcıya danışın.
3. Numuneyi mıknatısa yerleştirin, Kilitle komutunu kullanarak ²H sinyalini kilitleyin, ¹H kanalını tesis protokollerine göre ayarlayın ve eşleştirin (kesin prosedür, probun bir uzaktan ayarlama ve eşleştirme modülü ile donatılıp donatılmadığına bağlı olacaktır).
4. Solvent sinyal bastırmasını optimize etmek için topshim alt yordamını kullanarak şimleri ayarlayın.
5. Standart yöntemleri kullanarak ¹H ve ¹⁵N 90° darbeleri kalibre edin.
   1. Popt programını kullanarak ¹H darbeyi kalibre edin (darbe uzunluğunu tahmin etmek için önce darbeyi kullanın).
   2. ¹⁵N darbeyi standart bir örneğe göre kalibre edin; Bir teknik direktör veya deneyimli bir kullanıcı ile görüşerek bu değerin yakın zamanda kalibre edildiğinden emin olun.
   3. Alternatif olarak, sıfır sinyal elde edilene kadar bir HMQC deneyinin ¹⁵° darbelerinden birini değiştirerek numune üzerindeki 90 N darbeyi kalibre edin.
   4. Şekil aracı (stdisp) alt yordamını kullanarak şekilli darbeler için doğru zayıflamayı belirleyin.
   5. Klasör simgesine tıklayarak uygun darbe şekli dosyasını açın. Şekillendirilmiş darbeler, ACQUPARS'ın darbe parametreleri bölümünde bulunur.
   6. Darbe tanım dosyasını yükleyin ve Dalga Formunu Analiz Et > Şekli Entegre Et'e tıklayın. Kalibre edilmiş ¹H 90° sert darbeyi, istenen şekilli darbe uzunluğunu ve dönüşü (90° veya 180°) girin.
   7. Kalibre edilmiş 90° darbe için zayıflamaya güç seviyesi değişikliğini ekleyerek şekillendirilmiş darbenin güç seviyesini hesaplayın.
6. Süpürme genişliğini, taşıyıcı frekansını optimize etmek ve su bastırmayı kontrol etmek için standart bir ¹H, ¹⁵N HSQC (hsqcetfpf3gpsi) kaydedin²⁵.
7. sw ve td komutlarını kullanarak veya doğrudan uygun iletişim kutularında tarama genişliğini ve dolaylı boyut artışlarının sayısını ayarlayın. Tipik olarak, PRE'leri toplamak için, spektrum katlanmayacak şekilde spektral genişlikler seçilir.

5. ¹H_{N-T 2} deneyini kurun

1. Şekilli darbeleri yukarıda açıklandığı gibi kalibre edin (4.4.5-4.5.7). PRE deneyi için şekillendirilmiş darbe parametre dosyaları Eburp2.1000 (90° darbe), Reburp.1000 ve Iburp2.1000'dir. ACQUPARS sekmesindeki darbe parametreleri bölümüne kalibre edilmiş darbe uzunluklarını girin.
2. Bu deney, iki zaman gecikme noktası yaklaşımı^30'u kullanarak ¹H NT2'yi ölçer.
   1. Vdlist dosyasını düzenleyerek zaman gecikmelerini ayarlayın, ilk gecikme (T_a) 0,01 ms olarak ayarlanır.
   2. Beklenen maksimum PRE (T b ~ 1.15/(R 2,dia + Γ 2) ile olan ilişkiyi kullanarak ikinci gecikmeyi (T _b) seçin, burada R _2,dia, diyamanyetik numunenin _R2'sini temsil eder¹³. Gözlenen gevşemeye PRE katkısının büyüklüğü hakkında önceden bilgi sahibi olmadan, T_b'yi ~1x ¹H T_2'ye ayarlamak iyi bir başlangıç noktasıdır.
   3. Ardından, T _a ve T b spektrumlarının ilk artışlarını (efp komutuyla işlenir) karşılaştırarak ve T_b'yi sinyalin başlangıç değerinin %40-50'si arasında düşecek şekilde ayarlayarak uygun bir değer belirleyin.
      NOT: Bu yaklaşım, yüksek konsantrasyonlu (50 μM'<) numuneler için gerekli bir husus olan spektral sinyal-gürültüyü optimize eder. Uygun T_b değerleri örneğe bağlıdır, ancak ortalama büyüklükteki bir protein için tipik olarak 8 - 40 ms arasında değişir.
3. Yeterli sinyal ortalaması için kaydedilecek karmaşık noktaların sayısını ve tarama sayısını belirleyin. IDP'ler, karşılaştırılabilir büyüklükteki katlanmış proteinlerden daha uzun ¹⁵N _T2'ye sahip olduklarından, dolaylı boyutta daha uzun edinim süreleri kullanılabilir.
   NOT: Bu değer, proteinin spesifik özelliklerine bağlıdır, ancak ^{kabaca 15}N T_2'den tahmin edilebilir ve FID'deki sinyal bozulmasını izleyerek optimize edilebilir. Doğrudan boyut için, çoğu numune için 1024* karmaşık nokta (13 ppm tarama genişliği, 112,6 ms toplama süresi) yeterlidir.
4. Deneme süresini hesaplamak için expt komutunu kullanın ve ardından zg komutuyla denemeyi başlatın.

6. Askorbik asit ile spin etiketini azaltarak diyamanyetik bir numune yapın

1. Sodyum askorbatı NMR tamponunda çözün ve pH'ı orijinal NMR tamponuna uyacak şekilde ayarlayın.
2. Sodyum askorbat stoğunun konsantrasyonunu hesaplayın, böylece numune hacminde en az değişiklikle spin etiketinin konsantrasyonu üzerinde 10x molar fazla askorbat eklenebilir. Örneğin, 100 μM'lik bir protein numunesi için 100 mM'lik bir askorbat stoğu uygundur. Döndürme etiketinin azaltılması, toplam numune hacminin sadece %1'i olan 5,5 μL askorbik asit stok çözeltisinin eklenmesini gerektirecektir.
3. Tüpün kenarının altına bir damlacık yerleştirerek NMR tüpüne gerekli miktarda askorbik asit ekleyin, tüpü kapatın, karıştırmak için tüpü dikkatlice ters çevirin ve ardından numuneyi tüpün dibine yerleştirmek için elle kranklanmış bir santrifüjde 10-20 s boyunca 200-400 x g'da döndürün.
4. Işıktan korumak için NMR tüpünü folyoya sarın ve reaksiyonun en az 3 saat devam etmesine izin verin.
5. Paramanyetik numune için kullanılan aynı parametreleri kullanarak diyamanyetik numune üzerine ¹H NT2 kaydedin.
6. Darbeleri yeniden kalibre edin. Ancak, paramanyetik ölçümlerden değişmemeleri gerekirdi; Önemli ölçüde farklılarsa (> 0,5 μs fark), numune kalitesini (örn. bozunma, çökeltme) dikkate alın.
7. Diyamanyetik ve paramanyetik numuneler için belirtilen gevşeme gecikmeleri (vdlist), kukla tarama sayısı, toplanan tarama sayısı, toplanan karmaşık nokta sayısı, toplama süresi, tarama genişlikleri ve taşıyıcı frekansları dahil olmak üzere tüm alım parametrelerinin aynı kaldığından emin olun.

7. Proses paramanyetik ve diyamanyetik spektrumları

1. Verileri NMRPipe ve Sparky'nin yüklü ve yapılandırılmış olduğu yerel bilgisayara veya iş istasyonuna kopyalayın. ser dosyasını içeren deneme verileri dizininde proc adlı bir klasör oluşturun.
2. NMRPipe komut dosyalarını fid.com, p3d.com ve nmrproc.com proc'a kopyalayın (işleme komut dosyaları yazarların isteği üzerine mevcuttur).
   1. Bruker veri biçimini (ser) NMRPipe biçimine dönüştürmek için fid.com komut dosyasını kullanın.
   2. Sözde 3B düzlemleri ayrı spektrumlara bölmek için p3D.com komut dosyasını kullanın.
   3. fid.com komut dosyasının çıktısını okumak, çözücü bastırma, bir pencere işlevi uygulamak, ham verilere sıfırlar eklemek (sıfır doldurma), faz düzeltmesi uygulamak, bir Fourier dönüşümü yürütmek, verileri görüntülemek için kırpmak ve işlenen verileri diske yazmak için nmrproc.com komut dosyasını kullanın. Komut dosyası, kaydedilen her gevşeme gecikmesi için bir dosya çıkarır (T _a ve T_b).
      NOT: Bu komut dosyalarının her biri, her denemenin belirli ayrıntıları için işlemeyi optimize etmek üzere özelleştirilebilir. Öğreticiler ve örnek veri kümeleri, NMRPipe web sitesinde bulunan NMRPipe dağıtımına^{dahil edilmiştir 32}. NMRDraw, işleme sırasında spektral görüntüleme için kullanılabilir (örneğin, uygun faz açılarının ayarlanması vb.). NMRPipe komutları için kullanılabilen seçenekler, nmrPipe -help komutu kullanılarak görüntülenebilir.

8. Rezonans atamalarını aktarın ve tepe yüksekliklerini çıkarın

1. Komutu kullanarak her spektrum dosyası için dosya başlığı bilgilerini değiştirin (hem paramanyetik hem de diyamanyetik örnekler için T_a, T_b ) sethdr [dosyaadı] -ndim 2.
2. ^33-8.3 adımlarını izleyerek en yüksek yükseklikleri 8.5 çıkarmak için Sparky'yi kullanın. NMRPipe (NMRDraw)³², CCPN Analysis 34 ve NMRViewJ³⁵ dahil olmak üzere diğer yazılım paketleri de uygundur.
3. Spektral dosyaları Sparky'ye okuyun. Bu adımda veri seti, proteindeki spin etiketinin her bir konumu için ölçülen, hem paramanyetik hem de diyamanyetik numuneler için her bir zaman noktası spektrumu (T_a, T_b) için bir spektrumdan oluşacaktır.
4. Tepe noktalarını seçmek için Sparky'yi kullanın (komut: F8, ardından tıklayıp sürükleyin) ve bir referans tepe listesinden tepe listesini aktarma aracını kullanarak atamaları aktarın.
   NOT: İlgilenilen proteinin rezonans atamaları, gözlemlenen PRE'lerin diziye özgü yorumlanması için gereklidir³⁶.
   1. Hem paramanyetik hem de diyamanyetik spektrumlardaki konturları aynı seviyeye ayarlayın. Konturları, zaman gecikmesinden sonra toplanan spektrumların kasıtlı olarak tepe noktalarını dışlamaması, ancak T_a spektrumlarının aşırı gürültülü olmaması için yeterince yüksek olması için ayarladığınızdan emin olun.
5. Her spektrum için yeni tepe listelerini kaydedin ve ölçülen tepe yoğunluğunu ve Sparky hesaplanan sinyal-gürültü oranını ekleyin (komut: tepe listesini açmak için lt , yoğunluk ve SNR sütunlarını dahil etmek için seçeneklere tıklayın, komut: kaydet).

9. Her kalıntı için ¹H_{NT 2} oranlarını çıkarın ve PRE'yi hesaplayın

1. Tepe listelerini elektronik tablo yazılımına veya Python gibi tercih edilen bir programlama diline aktarın.
   NOT: Protein üzerindeki her bir spin etiketi konumu için, veri seti, hem paramanyetik hem de diyamanyetik deneyler için her biri T _a ve T_b olmak üzere ilişkili tepe yoğunluklarına sahip dört tepe listesinden oluşacaktır.
2. Aşağıdaki denklemi kullanarak hem paramanyetik hem de diyamanyetik numuneler için ¹H_N R₂ hesaplayın:
   
   
3. Paramanyetik ve diyamanyetik numuneler için her bir kalıntı için gevşeme oranını belirlemek için yukarıdaki denklemi kullanın.
4. Aşağıdaki denklemi kullanarak her kalıntı için ¹H_{N-Γ 2} oranını belirleyin:
   
5. Her kalıntı için tepe yüksekliğinin belirsizliğini hesaplamak için Sparky hesaplanan sinyal-gürültü oranını (SNR) kullanın.
6. Denklemi kullanarak hatayı yayın:
   
7. Grafik ¹H_{N-Γ 2}, 9.6'da hesaplanan hatayı içeren bir dağılım grafiği kullanılarak kalıntı sayısının bir fonksiyonu olarak.

Sonuçlar

Molekül içi ¹H_{N-Γ 2} PRE'ler, RNA bağlayıcı protein EWSR1^42'nin düşük karmaşıklık alanından türetilen, kendi kendine birleşen, içsel olarak düzensiz bir fragman (kalıntılar 171-264) üzerine kaydedildi (Şekil 3). Spin-etiket bağlantı noktasına yakın sıralı kalıntıların (örneğin, Şekil 3'teki kalıntı 178 veya 260) önemli ölçüde genişlemesi beklenir ve spektrumd...

Tartışmalar

Kendinden düzensiz proteinler ve PRE kullanan çeşitli bağlanma ortakları arasında düşük popülasyonlarda var olan geçici etkileşimleri karakterize etmek için bir yöntem sunulmuştur. Gösterilen örnekte, protein kendi kendine ilişkilidir ve bu nedenle PRE, moleküller arası ve moleküller arası etkileşimlerin bir kombinasyonundan kaynaklanabilir. Bu yöntem, iki farklı protein arasındaki etkileşimlerin karakterize edilebildiği heterojen numunelere kolayca genişletilebilir. Proteinin farklı bölgel...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm and 0.22 µm syringe filters	Millipore Sigma	SLHVM33RS SLGVR33RS	Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.
100 mm Petri Dish	Fisher	FB0875713	Agar plates for bacterial transformation.
14N Ammonium chloride	Sigma Aldrich	576794	Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
15N Ammonium chloride	Sigma Aldrich	299251	Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
3 L Fernbach baffled flask	Corning	431523	Bacterial expression culture
3-Maleimido-Proxyl	Sigma Aldrich	253375	Nitroxide spin label
50 mL conical centrifuge tubes	Thermo Fisher	14-432-22	Solution/protein storage
Amicon centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC900308	Protein concentration
Ampicillan	Sigma Aldrich	A5354	Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid
Analytical balance	Oahus	30061978	Explorer Pro, for weighing reagents
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	AX1775	Reduces nitroxide spin label
Autoclave			Sterilize glassware and culture media
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901	M9 media component
Centrifuge bottles	Thermo Fisher	010-1459	Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Centrifuge, hand-crank	Thomas Scientific	0241C68	Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes
Chelex 100	Sigma Aldrich	C7901	Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions
Computer workstation			Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky
Deuterium oxide	Sigma Aldrich	151882	Needed for NMR lock signal
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	M9 media component
Dibasic Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	S5136	M9 media component
Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)	Thermo Fisher	22582	Quantification of free cystiene residues
High speed centrifuge tubes	Thermo Fisher	3114-0050	Used to clear bacterial lysate.
High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)	Bruker		Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control
IMAC column, HisTrap FF	Cytvia	17528601	Initial fractionation of crude bacterial lysate
Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758	Induces protein expression for genes under control of lac operator
LB agar	Thermo Fisher	22700025	Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.
LB broth	Thermo Fisher	12780052
Low-pressure chromatography system	Bio-Rad	7318300	BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M7506	M9 media component
Medium pressure chromatography system	Bio-Rad	7880007	BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector
MEM vitamin solution	Sigma Aldrich	M6895	M9 media component
Microfluidizer	Avestin	EmulsiFlex-C3	Provides rapid and efficient bacterial cell lysis
Micropipettes	Thermo Fisher		Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)
Monobasic potassium phosphate	Sigma Aldrich	1551139	M9 media component
NMR pipettes	Sigma Aldrich	255688	To remove sample from NMR tube
NMR sample tube	NewEra	NE-SL5	Suitable for high-field NMR spectrometers
Preparative Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-HC	Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Round bottom polystyrene centrifuge tubes	Corning	352057	Clear bacterial lysate
Shaking incubator	Eppendorf	S44I200005	Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S5886	M9 media component
Sonicating water bath and vacuum source	Thomas Scientific		Used to degas buffer solutions
Sonicator	Thermo Fisher	FB505110	Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA
Spectrophotometer	Implen	OD600 Diluphotometer	Monitor growth of E.coli protein expression cultures
Superdex 200 16/600 size exculsion colum	Cytvia	28989333	Final protein purification step
Topspin software, version 3.2 or later	Bruker		Operating software for the NMR instrument
Transformation competent E. coli cells	Thermo Fisher	C600003	One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	ThermoFisher	20490	Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations
UV-Vis spectrophotometer	Implen	NP80	Measure protein concentration.
Water bath, temperature controlled	ThermoFisher	FSGPD25	For heat shock step of bacterial transformation
Yeast extract	Sigma Aldrich	Y1625	For supplementing M9 media if required