Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins(본질적으로 무질서한 단백질의 자기 연관성을 검출하고 특성화하기 위한 상자성 이완 향상)

요약

본질적으로 무질서한 단백질에서 약하고 일시적인 분자 간 및 분자 내 상호 작용을 감지하기 위한 상자성 이완 강화 NMR 분광법의 적용을 위한 프로토콜이 제시됩니다.

초록

본질적으로 무질서한 단백질과 단백질 내의 본질적으로 무질서한 영역은 인간 프로테옴의 크고 기능적으로 중요한 부분을 구성합니다. 이러한 서열의 매우 유연한 특성으로 인해 다양한 생체 분자 파트너와 약하고 장거리이며 일시적인 상호 작용을 형성할 수 있습니다. 구체적이지만 친화도가 낮은 상호 작용은 무차별 결합을 촉진하고 본질적으로 무질서한 단일 세그먼트가 다수의 표적 부위와 상호 작용할 수 있도록 합니다. 이러한 상호 작용의 일시적인 특성으로 인해 단백질에 의존하여 하나의 우세한 형태를 형성하는 구조 생물학 방법으로 특성화하기 어려울 수 있습니다. 상자성 이완 강화 NMR은 약하고 일시적인 상호 작용의 구조적 토대를 식별하고 정의하는 데 유용한 도구입니다. 본질적으로 무질서한 단백질과 단백질, 핵산 또는 기타 생체 분자 파트너 사이에 형성되는 저인구 만남 복합체를 특성화하기 위해 상자성 이완 향상을 사용하기 위한 자세한 프로토콜이 설명됩니다.

서문

내인성 장애(ID)는 안정적인 2차 또는 3차 구조로 자발적으로 접히지 않고 생물학적으로 활성인 단백질(IDP) 또는 단백질 내 영역(IDR)을 설명합니다. 일반적으로 IDP/IDR의 기능은 생리학적 조건에서 생체 분자와의 특이적이면서도 가역적인 상호작용을 촉진하는 것이다¹. 따라서, 국내실향민 및 IDR은 다중단백질 복합체의 모집, 조직 및 안정화, 예를 들어, 스플라이소좀²의 조립 및 활성, DNA 손상^부위에서의 성분의 모집 및 조직화3, 전사 복합체⁴ 또는 염색질 리모델러^BAF5의 모집의 조직 및 안정화를 포함하는 다양한 세포 기능에 관여한다. 또한 IDP는 서로 다른 결합 파트너에 대한 난잡함으로 인해 세포 단백질 네트워크를 통한 정보 전달을 매개할 수 있는 신호 연결 고리에서 발견됩니다⁶. 최근 연구에서는 IDR 영역이 액체-액체 상 분리 과정을 통해 생체 분자 응축수를 자가 결합하는 경향이 있음이 밝혀졌다⁷. ID를 포함하는 전술한 기능들 중 많은 것들은 또한 응축수 형성(condens....

프로토콜

프로토콜에 대한 일반 요구 사항: 단백질 정제 시설, UV-Vis 분광계, 고자기장 NMR 분광계 및 운영 소프트웨어, 다음을 포함한 후처리 분석 소프트웨어; NMRPipe³², Sparky 33 (또는 CCPN 분석 34 또는 NMRViewJ³⁵).

1. PRE 측정을 위한 단백질의 재조합 발현 및 정제

1. 단일 시스테인 잔기가 존재하도록 관심 단백질에 대한 발현 구조체를 설계합니다. 관심 단백질의 상이한 위치에 유리 시스테인을 도입하기 위해 다중 돌연변이가 필요할 것이다³⁶.
2. 확립된 프로토콜³⁷을 사용하여 관심 단백질의 천연 풍부도(^14N) 또는 ^15N-표지된 샘플을 발현하고 정제합니다.
   참고: 대장균 발현 시스템은 ^15N의 동위원소 농축이 생체 분자 이종 핵 NMR 분광법에 대한 최소 요구 사항이기 때문에 재조합 단백질 발현을 위한 비용 효율적이고 강력한 방법을 제공합니다.....

결과

분자 내 1H_{N-Γ 2} PRE는 RNA 결합 단백질 EWSR1⁴²의 저복잡성 도메인에서 유래된 자가 회합, 본질적으로 무질서한 단편(잔기 ^171-264)에 기록되었습니다(그림 3). 스핀-라벨 부착 지점에 근접한 순차적 근접 잔기(예를 들어, 도 3의 잔기 178 또는 260)는 상당히 넓어질 것으로 예상되며, 스펙트럼에서 검출가능하지 ?.......

토론

PRE를 사용하여 본질적으로 무질서한 단백질과 다양한 결합 파트너 사이에 낮은 집단에 존재하는 일시적인 상호 작용을 특성화하는 방법이 제시되었습니다. 제시된 예에서, 단백질은 자가 회합이며, 따라서 PRE는 분자간 및 분자내 상호작용의 조합으로부터 발생할 수 있다. 이 방법은 두 개의 서로 다른 단백질 간의 상호 작용을 특성화할 수 있는 이종 샘플로 쉽게 확장됩니다. 단백질의 상이한 영?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm and 0.22 µm syringe filters	Millipore Sigma	SLHVM33RS SLGVR33RS	Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.
100 mm Petri Dish	Fisher	FB0875713	Agar plates for bacterial transformation.
14N Ammonium chloride	Sigma Aldrich	576794	Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
15N Ammonium chloride	Sigma Aldrich	299251	Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
3 L Fernbach baffled flask	Corning	431523	Bacterial expression culture
3-Maleimido-Proxyl	Sigma Aldrich	253375	Nitroxide spin label
50 mL conical centrifuge tubes	Thermo Fisher	14-432-22	Solution/protein storage
Amicon centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC900308	Protein concentration
Ampicillan	Sigma Aldrich	A5354	Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid
Analytical balance	Oahus	30061978	Explorer Pro, for weighing reagents
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	AX1775	Reduces nitroxide spin label
Autoclave			Sterilize glassware and culture media
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901	M9 media component
Centrifuge bottles	Thermo Fisher	010-1459	Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Centrifuge, hand-crank	Thomas Scientific	0241C68	Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes
Chelex 100	Sigma Aldrich	C7901	Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions
Computer workstation			Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky
Deuterium oxide	Sigma Aldrich	151882	Needed for NMR lock signal
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	M9 media component
Dibasic Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	S5136	M9 media component
Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)	Thermo Fisher	22582	Quantification of free cystiene residues
High speed centrifuge tubes	Thermo Fisher	3114-0050	Used to clear bacterial lysate.
High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)	Bruker		Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control
IMAC column, HisTrap FF	Cytvia	17528601	Initial fractionation of crude bacterial lysate
Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758	Induces protein expression for genes under control of lac operator
LB agar	Thermo Fisher	22700025	Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.
LB broth	Thermo Fisher	12780052
Low-pressure chromatography system	Bio-Rad	7318300	BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M7506	M9 media component
Medium pressure chromatography system	Bio-Rad	7880007	BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector
MEM vitamin solution	Sigma Aldrich	M6895	M9 media component
Microfluidizer	Avestin	EmulsiFlex-C3	Provides rapid and efficient bacterial cell lysis
Micropipettes	Thermo Fisher		Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)
Monobasic potassium phosphate	Sigma Aldrich	1551139	M9 media component
NMR pipettes	Sigma Aldrich	255688	To remove sample from NMR tube
NMR sample tube	NewEra	NE-SL5	Suitable for high-field NMR spectrometers
Preparative Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-HC	Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Round bottom polystyrene centrifuge tubes	Corning	352057	Clear bacterial lysate
Shaking incubator	Eppendorf	S44I200005	Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S5886	M9 media component
Sonicating water bath and vacuum source	Thomas Scientific		Used to degas buffer solutions
Sonicator	Thermo Fisher	FB505110	Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA
Spectrophotometer	Implen	OD600 Diluphotometer	Monitor growth of E.coli protein expression cultures
Superdex 200 16/600 size exculsion colum	Cytvia	28989333	Final protein purification step
Topspin software, version 3.2 or later	Bruker		Operating software for the NMR instrument
Transformation competent E. coli cells	Thermo Fisher	C600003	One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	ThermoFisher	20490	Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations
UV-Vis spectrophotometer	Implen	NP80	Measure protein concentration.
Water bath, temperature controlled	ThermoFisher	FSGPD25	For heat shock step of bacterial transformation
Yeast extract	Sigma Aldrich	Y1625	For supplementing M9 media if required