Amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter et caractériser des auto-associations de protéines intrinsèquement désordonnées

Résumé

Un protocole pour l’application de la spectroscopie RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter les interactions inter- et intramoléculaires faibles et transitoires dans les protéines intrinsèquement désordonnées est présenté.

Résumé

Les protéines intrinsèquement désordonnées et les régions intrinsèquement désordonnées dans les protéines constituent une partie importante et fonctionnellement significative du protéome humain. La nature très flexible de ces séquences leur permet de former des interactions faibles, à longue portée et transitoires avec divers partenaires biomoléculaires. Des interactions spécifiques mais de faible affinité favorisent la liaison de promiscuité et permettent à un seul segment intrinsèquement désordonné d’interagir avec une multitude de sites cibles. En raison de la nature transitoire de ces interactions, elles peuvent être difficiles à caractériser par des méthodes de biologie structurale qui reposent sur des protéines pour former une seule conformation prédominante. La RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique est un outil utile pour identifier et définir le fondement structurel des interactions faibles et transitoires. Un protocole détaillé pour l’utilisation de l’amélioration de la relaxation paramagnétique pour caractériser les complexes de rencontre faiblement peuplés qui se forment entre les protéines intrinsèquement désordonnées et leurs protéines, acides nucléiques ou autres partenaires biomoléculaires est décrit.

Introduction

Le trouble intrinsèque (DI) décrit des protéines (IDP) ou des régions à l’intérieur des protéines (IDR) qui ne se replient pas spontanément en structures secondaires ou tertiaires stables, mais qui sont biologiquement actives. Généralement, la fonction des IDP/IDR est de faciliter des interactions spécifiques mais réversibles avec des biomolécules dans des conditions physiologiques¹. Ainsi, les IDP et les IDR sont impliqués dans une gamme de fonctions cellulaires, y compris le recrutement, l’organisation et la stabilisation de complexes multiprotéiques, par exemple, l’assemblage et l’activité du splicéosome², le recrutement et l’organisation des composants sur les sites de dommages à l’ADN³, l’organisation et la stabilisation du recrutement des complexes de transcription⁴, ou du remodeleur de chromatine BAF⁵. En outre, les PDI se trouvent à des carrefours de signalisation où leur promiscuité pour différents partenaires de liaison leur permet de servir de médiateur dans le transfert d’informations via des réseaux de protéines cellulaires⁶. Des travaux récents ont également révélé une propension des régions IDR à s’associer en formant des condensats biomoléculaires par le processus de séparation en phase liquide-liquide⁷. Bon nombre des fonctions susmentionnées impliquant l’ID sont également considérées comme impliquant un aspect de la formation de condensats⁸. Malgré l’importance de l’ID pour l’assemblage de complexes biomoléculaires, la stabilisation, l’échafaudage et la transduction du signal, les détails atomiques de leurs interactions spécifiques sont difficiles à identifier car les IDP et les IDR ne se prêtent généralement pas à des études structurelles utilisant la cristallographie aux rayons X ou la microscopie électronique cryogénique.

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique idéale pour étudier l’ID car elle ne dépend pas de la présence d’ensembles structurels rigides ou homogènes, mais rend compte de l’environnement local immédiat des noyaux individuels. La fréquence de résonance, ou décalage chimique, d’un noyau dans une molécule donnée est influencée par les faibles champs magnétiques induits par la distribution électronique locale, qui à son tour dépend de la longueur des liaisons, des angles, de la proximité d’autres noyaux, des interactions avec les partenaires de liaison et d’autres facteurs⁹. Ainsi, chaque noyau agit comme une sonde structurelle unique, spécifique au site, sensible aux changements de son environnement chimique local. Malgré ces avantages, la RMN est une technique de masse, et le décalage chimique observé est la moyenne de tous les environnements échantillonnés par un noyau particulier. Une gamme de techniques de RMN, dont beaucoup sont décrites dans ce numéro, ont été développées pour récupérer des informations structurelles, dynamiques et cinétiques sur les conformations biomoléculaires à haute énergie et faiblement peuplées contenues dans le décalage chimique moyen^10,11. Bien que transitoirement peuplés, l’identification et la quantification de ces états sont importantes pour déterminer les détails des mécanismes fonctionnels¹². Par exemple, dans le cas des PDI et des IDR, l’ensemble conformationnel peut être biaisé pour échantillonner préférentiellement les conformations productives pour la formation de complexes de rencontre avec des partenaires de liaison physiologiques. La détection de ces états, ainsi que l’identification des interactions et de la dynamique inter- et intramoléculaires spécifiques aux résidus, sont importantes pour déterminer les mécanismes structurels sous-jacents de la fonction protéique et de la formation complexe.

Un protocole d’utilisation de la RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique (PRE) pour étudier les états transitoires et peu peuplés importants pour la formation de complexes biomoléculaires médiés par IDP/IDR est décrit¹³. Cette approche est utile pour étudier les interactions transitoires protéine-protéine telles que celles qui favorisent l’assemblage des fibrilles amyloïdes à partir de la α-synucléine 14,15 ou l’auto-association de FUS^16, ainsi que pour caractériser des interactions protéine-protéine spécifiques telles que entre protéines de signalisation¹⁷. Un exemple d’IDP auto-associatif est présenté, où des interactions inter- et intramoléculaires spécifiques entraînent des états préférentiellement compactés ainsi que des interactions spécifiques au site qui conduisent à l’auto-association.

Le PRE résulte de l’interaction dipolaire magnétique d’un noyau à un centre paramagnétique avec un tenseur g isotrope, généralement fourni sous la forme d’un électron non apparié sur un groupe nitroxide ou sous forme d’atome métallique paramagnétique¹⁸ (Figure 1). Alors que les atomes avec des tenseurs g anisotropes produisent également un effet PRE, l’analyse de ces systèmes est plus difficile en raison des effets de confusion apportés par les décalages de pseudo-contact (PCS) ou le couplage dipolaire résiduel (RDC)^13,19. La force de l’interaction entre un noyau et le centre paramagnétique dépend de la distance <^r-6> entre les deux. Cette interaction entraîne une augmentation des taux de relaxation nucléaire, ce qui provoque un élargissement détectable de la raie même pour les interactions à longue portée (~10-35 Å), car le moment magnétique de l’électron non apparié est si fort^20,21. La détection d’états transitoires avec le PRE est possible si les deux conditions suivantes sont remplies; (1) l’interaction transitoire est en échange rapide sur l’échelle de temps RMN (le déplacement chimique observé est une moyenne pondérée en fonction de la population des états échangeurs); et (2) la distance entre les noyaux et le centre paramagnétique est plus courte à l’état de population transitoire qu’à l’état principal¹¹. Le PRE transversal est noté Γ₂ et, pour des raisons pratiques, est calculé à partir de la différence de vitesse de relaxation transversale ¹H entre un échantillon contenant un centre paramagnétique et un contrôle diamagnétique. Pour un traitement approfondi de la théorie du PRE et des changements de pseudo-contact connexes dans les régimes d’échange rapide et lent, le lecteur est renvoyé aux examens complets de Clore et de ses collègues^13,22. Ici, seule la situation où ¹H N-Γ₂ est dans le régime d’échange rapide est considérée, où, en raison de la dépendance ^r-6 du PRE, le taux de relaxation observé est lié à la fois à la distance à laquelle le centre paramagnétique s’approche du noyau ainsi qu’au temps qu’il passe dans cette conformation. Par conséquent, les conformations transitoires qui n’impliquent pas une approche rapprochée produisent un petit PRE tandis que des interactions plus étroites, même si elles sont de courte durée, produiront un PRE plus grand.

Pour les PDI, le PRE est utilisé pour mesurer et différencier les interactions qui se produisent au sein d’une seule molécule (intramoléculaire) et entre des molécules distinctes (intermoléculaires). En attachant un centre paramagnétique à une protéine RMN visible (p. ex., ¹⁵N-marquée) ou RMN invisible (p. ex., abondance naturelle ¹⁴N), la source (inter- ou intra-moléculaire) de l’ERP peut être déterminée (Figure 2). La mutagénèse dirigée qui introduit un résidu de cystéine est une approche pratique pour attacher un centre paramagnétique (spin-label) à une protéine²³. Plusieurs types de molécules ont été proposés pour être utilisés comme marqueurs de spin, y compris la chélation des métaux (à base d’EDTA) et les radicaux libres (à base de nitroxide)²⁴. Diverses étiquettes de spin de nitroxide ont été décrites et sont disponibles avec différentes chimies réactives à la cystéine telles que le méthanethiosulfonate, le maléimide et l’iodoacétamide^25,26 (Figure 1). La flexibilité inhérente de l’étiquette ou de l’agent de liaison peut être problématique pour certaines analyses, et dans ces situations, différentes stratégies ont été proposées pour limiter le mouvement de l’étiquette, par exemple en ajoutant des groupes chimiques volumineux ou l’utilisation d’un deuxième agent de liaison pour ancrer l’étiquette à la protéine (fixation à deux sites)^{27, 28}. De plus, les étiquettes disponibles dans le commerce peuvent contenir des protéines diastéréomères, mais cela ne contribuera généralement pas à l’ERP²⁹ observée. L’utilisation du 3-Maleimido-PROXYL attaché à une cystéine libre via la chimie maléimide est décrite car il est facilement disponible, rentable, non réversible et l’agent réducteur tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) peut être maintenu dans la solution tout au long de la réaction de marquage. Étant donné que le 3-maléimido-PROXYL possède un tenseur g isotrope, aucun PCS ou RDC n’est induit, et les mêmes assignations de décalage chimique peuvent être utilisées pour les échantillons paramagnétiques et diamagnétiques¹³.

Le ¹H_{N-T 2} est mesuré à l’aide d’une stratégie à deux points temporels (T _a, T_b) qui s’est déjà révélée aussi précise que la collecte d’une série d’évolution complète composée de 8 à 12 points temporels³⁰. Le premier point temporel (T _a) est fixé aussi près de zéro que possible, et la longueur optimale du deuxième point de temps dépend de l’amplitude du plus grand PRE attendu pour un échantillon donné et peut être estimée à partir de: T_b ~ 1,15 / (R 2,dia + Γ 2) où R _2,dia représente le R2 de l’échantillon diamagnétique¹³. Si la magnitude des plus grands PRE est inconnue, définir T _b à ~ une fois le ¹H T 2 de la protéine est une bonne estimation initiale et optimisée en ajustant T₂ pour améliorer le signal au bruit. Cette stratégie de mesure en deux points réduit considérablement le temps expérimental requis pour mesurer les PRE et laisse le temps de faire plus de moyenne des signaux, d’autant plus que des échantillons relativement dilués sont utilisés pour minimiser les effets des contacts non spécifiques entre les molécules. Une séquence d’impulsions basée sur HSQC est utilisée pour mesurer ¹H_{N-T 2} et a été décrite en détail ailleurs³⁰. Pour améliorer la sensibilité, les impulsions dures des transferts INEPT avant et arrière peuvent être remplacées par des impulsions façonnées; alternativement, la séquence est facilement convertie en une lecture basée sur TROSY³¹. Étant donné que les PDI ont généralement des taux de relaxation transversale beaucoup plus longs, ce qui entraîne des largeurs de raies plus étroites (en raison du désordre inhérent) que les protéines globulaires de taille similaire, de longs temps d’acquisition dans la dimension indirecte peuvent être utilisés pour améliorer la résolution spectrale et atténuer la limitation de la dispersion par décalage chimique inhérente aux PDI.

Le PRE est un outil utile pour étudier les interactions protéine-protéine et protéine-acide nucléique, en particulier les interactions transitoires ou peu peuplées. Un protocole détaillé pour la préparation d’un échantillon RMN adapté à la mesure des PRE, y compris les étapes de purification des protéines, le marquage par centrifugation dirigé sur site, la mise en place et l’étalonnage du programme d’impulsions, le traitement et l’interprétation des données RMN, est fourni. D’importantes considérations expérimentales sont notées tout au long de la période qui peuvent avoir une incidence sur la qualité des données et les résultats expérimentaux, y compris la concentration de l’échantillon, la sélection de l’étiquette de spin et l’élimination des composants paramagnétiques.

Protocole

Exigences générales pour le protocole: installations de purification des protéines, spectromètre UV-Vis, spectromètre RMN à haut champ et logiciel d’exploitation, logiciel d’analyse post-traitement, y compris; NMRPipe³², Sparky 33, (ou CCPN Analysis 34, ou NMRViewJ³⁵).

1. Expression recombinante et purification d’une protéine pour les mesures PRE

1. Concevoir une construction d’expression pour la protéine d’intérêt afin qu’il y ait un seul résidu de cystéine présent. De multiples mutations seront nécessaires pour introduire une cystéine libre à différentes positions dans la protéine d’intérêt³⁶.
2. Exprimer et purifier un échantillon d’abondance naturelle (¹⁴N) ou ¹⁵N-marqué de la protéine d’intérêt en utilisant un protocole établi³⁷.
   REMARQUE: Les systèmes d’expression d’E. coli fournissent une méthode rentable et robuste pour l’expression de protéines recombinantes, car l’enrichissement isotopique de ¹⁵N est une exigence minimale pour la spectroscopie RMN hétéronucléaire biomoléculaire. Les étapes typiques sont l’expression dans un milieu minimal, la purification chromatographique et le retrait de l’étiquette de purification d’affinité. Ce protocole suppose qu’un protocole d’expression et de purification robuste a été établi qui peut produire suffisamment de protéines de qualité appropriée pour les investigations RMN.
   1. Maintenir l’agent réducteur de 1 mM (DTT ou TCEP) dans les tampons à toutes les étapes de purification pour empêcher la réaction de la cystéine libre et la formation de liaisons disulfures intermoléculaires pour les PDI.
      NOTE: Certains systèmes peuvent être plus tolérants et moins sujets à l’agrégation dans des conditions non réductrices en fonction des caractéristiques spécifiques de la protéine, ainsi que de la température, du pH et du système tampon choisi pour la purification³⁸.
   2. Retirez les étiquettes d’affinité utilisées pour la purification avant de continuer, car elles peuvent interagir de manière imprévisible avec la protéine ou éventuellement contenir des résidus de cystéine réactifs qui pourraient servir par inadvertance de site de fixation involontaire.
   3. Préparer un échantillon de référence marqué à ¹⁵N sans mutation(s) de cystéine mélangé à une version soluble de l’étiquette de spin pour évaluer la contribution des PRE solvants.

2. Conjuguer l’étiquette de spin de nitroxide 3-Maleimido-PROXYL

1. Stocker ou échanger la protéine purifiée dans un tampon dégazé contenant 50 mM Tris pH 7 et 1 mM de PTCE ; le tampon peut également contenir jusqu’à 8 M d’urée si nécessaire pour faciliter la solubilité des protéines.
   Sinon, diluer rapidement une solution mère de protéines dans au moins 10 équivalents volumiques de tampon de PTCE Tris pH 7 dégazé de 50 mM et 1 mM. Assurez-vous que la concentration de protéines avant d’ajouter le spin-label est d’au moins 100 μM.
2. Ajouter 3-Maleimido proxyl d’une solution mère à 20x l’excès molaire de la protéine d’intérêt. Protéger l’échantillon de la lumière et de l’oxygène et incuber pendant la nuit à température ambiante ou à 4 °C; Un balancement doux ou une nutation peut améliorer l’efficacité de l’étiquetage.
3. Préparer les solutions mères de l’étiquette de spin en dissolvant la poudre de 3-Maleimido proxyl dans de l’éthanol à 95%. Les aliquotes du stock peuvent être conservées à -80 °C pendant moins de 6 mois.
4. Étape critique : Retirer l’étiquette de spin libre n’ayant pas réagi pour éviter les PRE de solvants non spécifiques. Pour ce faire, vous pouvez le faire par filtration sur gel ou (de préférence) dialyse extensive de l’échantillon de protéines. Cette étape introduira également la protéine dans un tampon adapté à la RMN.
   NOTA : Les agents réducteurs doivent être préparés frais et la compatibilité entre les composants tampons doit être prise en compte; par exemple, le PTCE se dégrade rapidement dans les tampons à base de phosphate, et cette combinaison doit être évitée³⁹.
5. Traiter tous les tampons utilisés à partir de cette étape avec une résine chélatante sélective pour les métaux divalents et de transition afin d’éliminer les ions paramagnétiques ou les quenchers de spin-label. Si la protéine ne peut pas être stockée dans un tampon RMN, concentrez-la pour qu’elle soit rapidement diluée dans un tampon adapté à la RMN.
6. Surveillance de l’efficacité de l’incorporation spin-label.
   1. Utiliser le réactif d’Ellman (acide 5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoïque)) pour quantifier les groupes sulfhydryles libres dans la solution⁴⁰.
      REMARQUE: Des protocoles détaillés sont disponibles auprès du fabricant. Aux fins de la présente étude, il est important de déterminer l’incorporation du spin-label, la concentration des groupes sulfhydryle libres est comparée à la concentration totale en protéines. Le pourcentage de groupes sulfhydryles libres est le pourcentage de molécules qui n’ont pas d’étiquette de spin de nitroxide attachée.
   2. Surveillez l’intensité du pic correspondant au résidu de cystéine marqué pour juger de l’incorporation du spin-label dans la protéine d’intérêt.
      REMARQUE: Il s’agit d’une approche rapide et efficace pour déterminer le degré de marquage de spin de la protéine. L’incorporation complète de l’étiquette de spin entraînera la disparition du pic du spectre. Compte tenu de la faible dispersion caractéristique des PDI, le pic correspondant au résidu de cystéine mutante peut ne pas toujours être facilement identifié, et l’utilisation du réactif d’Ellman (étape 2.6.1) est donc recommandée.

3. Préparer l’échantillon RMN pour mesurer l’ERP intra ou intermoléculaire

1. Préparer l’échantillon pour la mesure de l’ERP intramoléculaire
   1. Préparer 15 protéines marquées par un spin enrichies en isotopie de ¹⁵N à une concentration d’au moins 100 μM mais pas plus de 300 μM dans un tampon adapté à la RMN. Le volume total de l’échantillon (y compris D₂O) est compris entre 500 et 550 μL.
      REMARQUE: Les tampons RMN courants comprennent le phosphate, l’acétate, le (bi)carbonate et le TRIS. Les tampons de Good tels que MES, HEPES peuvent également être appropriés. Faites preuve de prudence lors de la sélection des tampons pour éviter toute réactivité croisée avec d’autres composants de la solution.
   2. Assurez-vous que le pH est ~7,2 ou inférieur pour minimiser les effets de l’échange amide de protons avec l’eau. Maintenez la concentration de sel aussi faible que possible (généralement inférieure à 150 mM), bien que la principale considération soit de maintenir la stabilité des protéines.
      NOTA : Des approches pour mener des expériences de RMN dans des conditions à haute teneur en sel ont été décrites ailleurs⁴¹.
2. Préparer l’échantillon pour la mesure de l’ERP intermoléculaire
   1. Suivez cette étape ou l’étape 3.1; ils ne sont pas effectués simultanément. Préparer une protéine d’abondance naturelle ^{de 14}N, marquée par spin, dans le tampon RMN choisi.
   2. Préparer l’échantillon de protéines en mélangeant 15 N de protéines non marquées par spin enrichies isotopiquement avec des protéines marquées par spin d’abondance naturelle de ¹⁵à 50 % à ¹⁴N, de sorte que la concentration finale soit identique à celle de l’échantillon préparé en 3.1.1. Le volume total de l’échantillon (y compris D₂O) est compris entre 500 et 550 μL.
   3. Optimiser empiriquement le rapport des protéines ¹⁵N et ¹⁴N pour chaque protéine étudiée. Les ratios de 1%, 5% et 20% de ¹⁴protéines marquées par N-spin sont de bons points de départ.
      REMARQUE: Une accumulation du PRE en fonction de l’ajout de ¹⁴protéines marquées par le spin N indique un effet spécifique; l’EPR observée est spécifique à l’échantillon puisqu’elle dépend de la distance et de la population (comme discuté ci-dessus), et par conséquent, des ratios plus élevés de ¹⁴protéines marquées par un spin N seront nécessaires si l’interaction est particulièrement transitoire¹⁷.
3. Transférer l’échantillon RMN (intra- ou intermoléculaire) dans un tube RMN de 5 mm qui convient à une utilisation dans des aimants à champ élevé à l’aide d’une pipette ou d’une micropipette en verre à longue tige (9 pouces). S’assurer que tous les échantillons RMN contiennent de 5 % à 10 % de_D2Opour faciliter le verrouillage sur le terrain.
   REMARQUE: Les tubes RMN qui utilisent des bouchons en polymère pour réduire le volume d’échantillon nécessaire ne sont pas recommandés pour les mesures PRE en raison de difficultés liées au calage efficace de l’échantillon.

4. Configurer le spectromètre RMN et expérimenter les paramètres spécifiques

1. Faites preuve d’une extrême prudence lorsque vous travaillez autour de spectromètres RMN supraconducteurs à haut champ.
   NOTE: Les dangers comprennent les blessures dues à l’accélération soudaine d’objets métalliques vers l’aimant, l’interférence avec les dispositifs médicaux implantés et l’asphyxie due à une libération soudaine de gaz N 2 et He₂ en cas d’extinction de l’aimant. Les étapes suivantes supposent que le lecteur a suivi la formation requise, qu’il est conscient de ces dangers et d’autres dangers locaux et qu’il a reçu l’approbation du gestionnaire de l’installation pour utiliser le spectromètre RMN. En cas de doute sur une étape ou une instruction, consultez le gestionnaire de l’installation ou l’utilisateur expérimenté pour éviter d’éventuelles blessures ou dommages au spectromètre.
2. Les étapes suivantes supposent un spectromètre RMN commercial exécutant une version moderne du logiciel de contrôle d’acquisition. Téléchargez le programme pulse et les fichiers de paramètres et placez-les dans les répertoires appropriés.
   REMARQUE: Un programme d’impulsions et un ensemble de paramètres adaptés à une utilisation avec un spectromètre Bruker et TopSpin (3.2 ou ultérieur) sont disponibles sur demande auprès des auteurs.
   1. Étape critique : On suppose qu’il est familier avec l’installation de programmes d’impulsions RMN non natifs; Consultez le gestionnaire de l’installation ou un utilisateur expérimenté si nécessaire.
3. Placez l’échantillon dans l’aimant, verrouillez le signal ²H à l’aide de la commande Verrouiller, réglez et faites correspondre le canal ¹H selon les protocoles de l’installation (la procédure exacte dépendra si la sonde est équipée d’un module de réglage et de correspondance à distance).
4. Ajustez les cales à l’aide du sous-programme topshim pour optimiser la suppression du signal de solvant.
5. Calibrer les impulsions ^{de 1}H et ¹⁵N 90° à l’aide de méthodes standard.
   1. Calibrez l’impulsion de ¹H à l’aide du programme popt (utilisez d’abord pulsecal pour estimer la longueur de l’impulsion).
   2. Calibrer l’impulsion de ¹⁵N par rapport à un échantillon étalon; Assurez-vous que cette valeur a été calibrée récemment en discutant avec un directeur technique ou un utilisateur expérimenté.
   3. Vous pouvez également calibrer l’impulsion ^{de 15}N sur l’échantillon en faisant varier l’une des impulsions à 90° d’une expérience HMQC jusqu’à ce qu’un signal nul soit atteint.
   4. Déterminez l’atténuation correcte des impulsions façonnées à l’aide de la sous-routine de l’outil de forme (stdisp).
   5. Ouvrez le fichier de forme d’impulsion approprié en cliquant sur l’icône du dossier. Les impulsions façonnées se trouvent dans la section des paramètres d’impulsion d’ACQUPARS.
   6. Chargez le fichier de définition d’impulsion et cliquez sur Analyser la forme d’onde > Intégrer la forme. Entrez l’impulsion dure calibrée ^{de 1}H 90°, la longueur d’impulsion de forme souhaitée et la rotation (90° ou 180°).
   7. Calculez le niveau de puissance de l’impulsion façonnée en ajoutant le changement de niveau de puissance à l’atténuation pour l’impulsion calibrée à 90°.
6. Enregistrer une HSQC standard ¹H, ¹⁵N (hsqcetfpf3gpsi) pour optimiser la largeur de balayage, la fréquence de la porteuse et vérifier la suppression de l’eau²⁵.
7. Ajustez la largeur de balayage et le nombre d’incréments de cotes indirectes à l’aide des commandes sw et td ou directement dans les boîtes de dialogue appropriées. En règle générale, pour la collecte des PRE, les largeurs spectrales sont choisies de manière à ce que le spectre ne soit pas replié.

5. Configurer l’expérience ¹H_{N-T 2}

1. Calibrer les impulsions façonnées comme décrit ci-dessus (4.4.5-4.5.7). Les fichiers de paramètres d’impulsion façonnée pour l’expérience PRE sont Eburp2.1000 (impulsion de 90°), Reburp.1000 et Iburp2.1000. Entrez les longueurs d’impulsion calibrées dans la section des paramètres d’impulsion de l’onglet ACQUPARS .
2. Cette expérience mesure le ¹H N-T₂ en utilisant l’approche à deux points de retard³⁰.
   1. Définissez les délais en éditant le fichier vdlist, le premier délai (T_a) est défini sur 0,01 ms.
   2. Choisir le second délai, (T b) en utilisant la relation avec le PRE maximum attendu (T _b ~ 1,15/(R2,dia + Γ₂) où R2,dia représente le _R2 de l’échantillon diamagnétique¹³. Sans connaissance préalable de l’ampleur de la contribution du PRE à la relaxation observée, un bon point de départ est de fixer T _b à ~1x ¹H T₂.
   3. Ensuite, déterminez une valeur appropriée en comparant les premiers incréments (traités avec la commande efp) des spectres T _a et T b et en ajustant T _b de telle sorte que le signal diminue entre 40% et 50% de sa valeur initiale.
      REMARQUE : Cette approche optimise le rapport signal/bruit spectral, une considération nécessaire pour les échantillons qui ne peuvent pas être fortement concentrés (< 50 μM). Les valeurs appropriées de T_b dépendent de l’échantillon, mais varient généralement de 8 à 40 ms pour une protéine de taille moyenne.
3. Déterminez le nombre de points complexes à enregistrer et le nombre de balayages pour une moyenne de signal suffisante. Étant donné que les PDI ont ¹⁵ N T₂ plus longs que les protéines repliées de taille comparable, des temps d’acquisition plus longs dans la dimension indirecte peuvent être utilisés.
   NOTE: Cette valeur dépend des caractéristiques spécifiques de la protéine mais peut être approximativement estimée à partir du ¹⁵ N T₂ et optimisée en surveillant la désintégration du signal dans le FID. Pour la dimension directe, 1024* points complexes (largeur de balayage de 13 ppm, temps d’acquisition de 112,6 ms) est suffisant pour la plupart des échantillons.
4. Utilisez la commande expt pour calculer la durée de l’expérience, puis démarrez l’expérience avec la commande zg.

6. Faire un échantillon diamagnétique en réduisant l’étiquette de spin avec de l’acide ascorbique

1. Dissoudre l’ascorbate de sodium dans le tampon RMN et ajuster le pH pour qu’il corresponde au tampon RMN d’origine.
2. Calculer la concentration du stock d’ascorbate de sodium de manière à ajouter un excès molaire d’ascorbate de 10 fois par rapport à la concentration de l’étiquette de spin avec le moins de changement possible du volume de l’échantillon. Par exemple, pour un échantillon de protéines de 100 μM, un stock d’ascorbate de 100 mM est approprié. Pour réduire l’étiquette d’essorage, il faudra ajouter 5,5 μL de solution mère d’acide ascorbique, ce qui ne représente que 1 % du volume total de l’échantillon.
3. Ajouter la quantité requise d’acide ascorbique au tube RMN en plaçant une gouttelette sous le bord du tube, boucher le tube, retourner soigneusement le tube pour mélanger, puis tourner à 200-400 x g pendant 10-20 s dans une centrifugeuse à manivelle pour déposer l’échantillon au fond du tube.
4. Enveloppez le tube RMN dans une feuille d’aluminium pour le protéger de la lumière et laisser la réaction se dérouler pendant au moins 3 heures.
5. Noter ¹H N-T2 sur l’échantillon diamagnétique en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour l’échantillon paramagnétique.
6. Recalibrez les impulsions. Cependant, ils n’auraient pas dû changer par rapport aux mesures paramagnétiques; S’ils sont significativement différents (> différence de 0,5 μs), tenir compte de la qualité de l’échantillon (p. ex. dégradation, précipitation).
7. Assurez-vous que tous les paramètres d’acquisition, y compris les délais de relaxation spécifiés (vdlist), le nombre de scans factices, le nombre de scans collectés, le nombre de points complexes collectés, le temps d’acquisition, les largeurs de balayage et les fréquences porteuses restent les mêmes pour les échantillons diamagnétiques et paramagnétiques.

7. Traiter les spectres paramagnétiques et diamagnétiques

1. Copiez les données sur l’ordinateur local ou le poste de travail sur lequel NMRPipe et Sparky sont installés et configurés. Créez un dossier nommé proc dans le répertoire de données d’expérience qui contient le fichier ser.
2. Copiez les scripts NMRPipe fid.com, p3d.com et nmrproc.com dans le processus (les scripts de traitement sont disponibles sur demande auprès des auteurs).
   1. Utilisez le script fid.com pour convertir le format de données Bruker (ser) au format NMRPipe.
   2. Utilisez le script p3D.com pour diviser les plans pseudo3D en spectres individuels.
   3. Utilisez le script nmrproc.com pour lire la sortie du script fid.com, appliquer une fonction de suppression de solvant, une fonction de fenêtre, ajouter des zéros aux données brutes (remplissage zéro), appliquer une correction de phase, exécuter une transformation de Fourier, rogner les données pour les afficher et écrire les données traitées sur le disque. Le script produira un fichier pour chaque délai de relaxation enregistré (T _a et T_b).
      Remarque : Chacun de ces scripts est personnalisable pour optimiser le traitement pour les détails spécifiques de chaque expérience. Des tutoriels et des exemples d’ensembles de données sont inclus dans la distribution NMRPipe disponible sur le site Web NMRPipe³². NMRDraw peut être utilisé pour la visualisation spectrale pendant le traitement (par exemple, réglage des angles de phase appropriés, etc.). Les options disponibles pour les commandes NMRPipe peuvent être visualisées à l’aide de la commande nmrPipe -help.

8. Transférer les assignations de résonance et extraire les hauteurs de pointe

1. Modifiez les informations d’en-tête de fichier pour chaque fichier de spectre (T _a, T_b pour les échantillons paramagnétiques et diamagnétiques) à l’aide de la commande sethdr [nom du fichier] -ndim 2.
2. Utilisez Sparky pour extraire les hauteurs^{de pic 33} en suivant les étapes 8.3-8.5. D’autres logiciels, y compris NMRPipe (NMRDraw)³², CCPN Analysis³⁴ et NMRViewJ³⁵ sont également appropriés.
3. Lisez les fichiers spectraux dans Sparky. À cette étape, l’ensemble de données consistera en un spectre pour chaque spectre de point temporel (T _a, T_b), pour les échantillons paramagnétiques et diamagnétiques, mesuré pour chaque position du spin-marqueur dans la protéine.
4. Utilisez Sparky pour sélectionner des pics (commande : F8, puis cliquer et glisser) et transférer des affectations à l’aide de l’outil de liste de pics de transfert à partir d’une liste de pics de référence.
   NOTE: Les assignations par résonance de la protéine d’intérêt sont nécessaires pour l’interprétation spécifique à la séquence des PRE^{observés 36}.
   1. Définissez les contours des spectres paramagnétique et diamagnétique au même niveau. Assurez-vous de définir les contours de manière à ce que les spectres collectés après le délai n’excluent pas délibérément les pics, mais soient suffisamment élevés pour que les spectres T_a ne soient pas trop bruyants.
5. Enregistrez les nouvelles listes de pics pour chaque spectre et incluez l’intensité de crête mesurée et le rapport signal sur bruit calculé par Sparky (commande: lt pour ouvrir la liste des pics, cliquez sur les options pour inclure les colonnes intensité et SNR, commande: enregistrer).

9. Extraire ¹H_{N-T 2} taux pour chaque résidu et calculer PRE

1. Importez les listes de pics dans un tableur ou un langage de programmation préféré tel que Python.
   REMARQUE : Pour chaque position de spin-étiquette sur la protéine, l’ensemble de données sera composé de quatre listes de pics avec les intensités de pic associées, une de T_a et une de T_b pour les expériences paramagnétiques et diamagnétiques.
2. Calculer ¹H_N R2 pour les échantillons paramagnétiques et diamagnétiques à l’aide de l’équation:
   
   
3. Utilisez l’équation ci-dessus pour déterminer le taux de relaxation de chaque résidu pour les échantillons paramagnétiques et diamagnétiques.
4. Déterminer le taux ^{de 1}H N-Γ₂ pour chaque résidu à l’aide de l’équation suivante :
   
5. Utilisez le rapport signal sur bruit (SNR) calculé par Sparky pour calculer l’incertitude de la hauteur maximale pour chaque résidu.
6. Propagez l’erreur à l’aide de l’équation :
   
7. Graphique ¹H_{N-Γ 2} en fonction du nombre de résidus à l’aide d’un nuage de points comprenant l’erreur calculée au point 9.6.

Résultats

Des PRE intramoléculaires ¹H _{N-Γ 2} ont été enregistrées sur un fragment auto-associatif, intrinsèquement désordonné (résidus 171-264) dérivé du domaine de faible complexité de la protéine de liaison à l’ARN EWSR1⁴² (Figure 3). Les résidus à proximité séquentielle étroite du point de fixation de l’étiquette de spin (p. ex. résidus 178 ou 260 à la figure 3) devraient être ...

Discussion

Une méthode pour caractériser les interactions transitoires qui existent à de faibles populations entre des protéines intrinsèquement désordonnées et divers partenaires de liaison utilisant PRE a été présentée. Dans l’exemple montré, la protéine s’auto-associa, et donc le PRE peut provenir d’une combinaison d’interactions inter et intramoléculaires. Cette méthode est facilement étendue à des échantillons hétérogènes où les interactions entre deux protéines différentes peuvent être caract?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 µm and 0.22 µm syringe filters	Millipore Sigma	SLHVM33RS SLGVR33RS	Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.
100 mm Petri Dish	Fisher	FB0875713	Agar plates for bacterial transformation.
14N Ammonium chloride	Sigma Aldrich	576794	Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
15N Ammonium chloride	Sigma Aldrich	299251	Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein
3 L Fernbach baffled flask	Corning	431523	Bacterial expression culture
3-Maleimido-Proxyl	Sigma Aldrich	253375	Nitroxide spin label
50 mL conical centrifuge tubes	Thermo Fisher	14-432-22	Solution/protein storage
Amicon centrifugal filter	Millipore Sigma	UFC900308	Protein concentration
Ampicillan	Sigma Aldrich	A5354	Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid
Analytical balance	Oahus	30061978	Explorer Pro, for weighing reagents
Ascorbic acid	Sigma Aldrich	AX1775	Reduces nitroxide spin label
Autoclave			Sterilize glassware and culture media
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901	M9 media component
Centrifuge bottles	Thermo Fisher	010-1459	Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Centrifuge, hand-crank	Thomas Scientific	0241C68	Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes
Chelex 100	Sigma Aldrich	C7901	Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions
Computer workstation			Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky
Deuterium oxide	Sigma Aldrich	151882	Needed for NMR lock signal
Dextrose	Sigma Aldrich	D9434	M9 media component
Dibasic Sodium Phosphate	Sigma Aldrich	S5136	M9 media component
Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)	Thermo Fisher	22582	Quantification of free cystiene residues
High speed centrifuge tubes	Thermo Fisher	3114-0050	Used to clear bacterial lysate.
High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)	Bruker		Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control
IMAC column, HisTrap FF	Cytvia	17528601	Initial fractionation of crude bacterial lysate
Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I6758	Induces protein expression for genes under control of lac operator
LB agar	Thermo Fisher	22700025	Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.
LB broth	Thermo Fisher	12780052
Low-pressure chromatography system	Bio-Rad	7318300	BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns
Magnesium sulfate	Sigma Aldrich	M7506	M9 media component
Medium pressure chromatography system	Bio-Rad	7880007	BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector
MEM vitamin solution	Sigma Aldrich	M6895	M9 media component
Microfluidizer	Avestin	EmulsiFlex-C3	Provides rapid and efficient bacterial cell lysis
Micropipettes	Thermo Fisher		Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)
Monobasic potassium phosphate	Sigma Aldrich	1551139	M9 media component
NMR pipettes	Sigma Aldrich	255688	To remove sample from NMR tube
NMR sample tube	NewEra	NE-SL5	Suitable for high-field NMR spectrometers
Preparative Centrifuge	Beckman Coulter	Avanti J-HC	Harvest E. coli cells after recombinant protein expression
Round bottom polystyrene centrifuge tubes	Corning	352057	Clear bacterial lysate
Shaking incubator	Eppendorf	S44I200005	Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures
Sodium chloride	Sigma Aldrich	S5886	M9 media component
Sonicating water bath and vacuum source	Thomas Scientific		Used to degas buffer solutions
Sonicator	Thermo Fisher	FB505110	Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA
Spectrophotometer	Implen	OD600 Diluphotometer	Monitor growth of E.coli protein expression cultures
Superdex 200 16/600 size exculsion colum	Cytvia	28989333	Final protein purification step
Topspin software, version 3.2 or later	Bruker		Operating software for the NMR instrument
Transformation competent E. coli cells	Thermo Fisher	C600003	One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	ThermoFisher	20490	Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations
UV-Vis spectrophotometer	Implen	NP80	Measure protein concentration.
Water bath, temperature controlled	ThermoFisher	FSGPD25	For heat shock step of bacterial transformation
Yeast extract	Sigma Aldrich	Y1625	For supplementing M9 media if required