Murine Oviduct'un Mikroseksiyonu ve Ayrışması: Bireysel Segment Tanımlama ve Tek Hücre İzolasyonu

Özet

RNA bütünlüğünü korurken tek tek segmentlerin toplanmasına izin veren fare yumurta kanalının mikro dezenfeksiyonu için bir yöntem sunulmuştur. Ayrıca enzymatik olmayan ovidüktal hücre ayrışması prosedürü açıklanmıştır. Yöntemler fonksiyonel olarak farklı ovidüktal segmentlerin ve ayrışmış ovidüktal hücrelerin sonraki gen ve protein analizi için uygundur.

Özet

Fare modeli sistemleri, genetik manipülabillikleri ve deneysel tedavilerin maliyetinin düşük olması nedeniyle hastalık süreçlerinin analizi için eşsizdir. Bununla birlikte, küçük vücut boyutları nedeniyle, 200-400 μm çapındaki yumurta kanalı gibi bazı yapıların, immünhistokimya dışında incelenmesinin nispeten zor olduğu kanıtlanmıştır. Son zamanlarda, immünohistokimyasal çalışmalar, yumurta kanalı segmentlerinde daha önce tanınandan daha karmaşık farklılıklar ortaya çıkarmıştır; böylece, yumurta kanalı yedi farklı epitel hücre tipinin farklı oranlarına sahip dört fonksiyonel segmente ayrılır. Epitel hücre tiplerinin farklı embriyolojik kökenleri ve oranları muhtemelen dört fonksiyonel bölgeyi hastalığa farklı olarak duyarlı hale getirir. Örneğin, seröz intraepithelial karsinomların öncü lezyonları fare modellerindeki infundibulumdan ve insan fallop tüpündeki ilgili fimbrial bölgeden kaynaklanır. Burada açıklanan protokol, mikrodiseksiyonun, ters transkripsiyon-nicel PCR (RT-qPCR) ve RNA dizilimi (RNAseq) gibi aşağı akış analizi için gerekli olan yeterli miktarda ve saflıkta RNA elde etmek için yeterli miktarda ve saflıkta bir şekilde alt bölümlere ayırma yöntemini detaylandırmamaktadır. Ayrıca, akış sitometrisine veya tamamen farklılaştırılmış ovidüktal hücrelerin tek hücreli RNAseq analizine uygun çoğunlukla enzimatik olmayan bir doku ayrışma yöntemidir. Açıklanan yöntemler, üreme, doğurganlık, kanser ve immünoloji alanında murine yumurta kanalını kullanarak daha fazla araştırmayı kolaylaştıracaktır.

Giriş

Murin oviduct fonksiyon ve morfoloji olarak insan fallop tüpüne ^benzer1. Her ikisi de tarihsel olarak tanımlanmış iki epitel yerleşik hücreden oluşan sözde siliated epitelden oluşur: siliated hücreler ve salgı ^{hücreleri1,2}. Yumurta kanalının klasik olarak tanınan üç bölümü vardır: infundibulum, ampulla ve isthmus. Yeni bir çalışmada, Harwalkar ve ark. ³, yerleşik epitel hücrelerinin kategorizasyonunun yedi farklı popülasyona genişlemesine yol açan yumurta kanalı morfolojisi ve gen ekspresyasyonu araştırılmıştır. Buna ek olarak, ampullary-isthmus kavşağını ^oviduct3'ün ayrı bir segmenti olarak kurdular. Burada açıklanan ve infundibulum, ampulla ve isthmus'a odaklanan yöntem, ampullery-isthmic kavşağını da içerecek şekilde kolayca ^{genişletilebilir2,3}. İnfundibular bölge ostium veya yumurta kanalının açılmasını içerir ve fimbrial bölgenin yanı sıra proksimal sapı içerir. Rahime doğru ilerlerken, sırada ampulla ve sonra isthmus var. Siliated hücreler en çok bölgenin distal ucunda, yumurtalık proksimal veya infundibulumda öne çıkarken, salgı hücreleri en çok proksimal uçta veya isthmus segmentinde ^belirgindir1. İnsan fallop tüpünün aksine, murine oviduct, geniş ligament peritonunun bir uzantısı olan mezosalpinx tarafından desteklenen sarmal bir ^yapıdır1,4. Ek olarak, fare oviduct, ^oviduct4'e oosit transferi olasılığını artıran bir bursal keseye kaplanmıştır. Ampulla, gelişmekte olan embriyoların uterusa girmeden önce isthmusa geçtiği döllenme yeri olarak ^{tanımlanır5}. Tubal segmentler 200-400 μm çapında ve daha uzun ampullery ve isthmus bölgeleri yaklaşık 0.5-1.0 cm ^{uzunluğundadır4}. Östrous döngüsü sırasındaki oviduct distendleri ve ampulla ve infundibulum ^isthmus1'den daha dağılabilir.

Hücrelerin, özellikle de salgı hücrelerinin aşırı çoğalması, pelvik boşlukta bulunan seröz tümörlere öncü lezyonları karakterize ^eder6. Bu öncül seröz intraepithelial lezyonlar sadece fimbrial bölgede yumurta kanalı epitelinde ortaya çıkar; lezyon oluşumunun neden salgı ^2,7,8 değil, normalde baskın hücre tipinin siliated olduğu bu bölge ile sınırlı olduğu bilinmemektedir. Normal fizyolojik fonksiyon açısından bölgesellik ve yumurtalık kanserinin ovidüktal kökenine olan ilginin artması9,10,11,12,13, yumurta kanalı segmentlerinin ayrı ayrı değerlendirilmesinin öneminin altını çizmektedir.

Burada açıklanan yöntem, segmente özgü gen ekspresyonunun ve ayrışmış hücrelerin işlevinin sonraki aşağı akış analizleri için ayrı ovidüktal segmentlerin toplanmasını detaylandırmaktadır. Geleneksel olarak, birçok doku fenolden sonra tüm RNA ekstraksiyonu için işlenir: kloroform yöntemi veya sütun üzerinde tam ekstraksiyon yöntemi; ancak açıklanan kombinasyon yöntemi ile yeterli verim üretilirken RNA kalitesinin korunduğunu tespit ettik. Bu yöntem kullanılarak, yumurta kanalının çok küçük fonksiyonel segmentleri, yumurta kanalını bir bütün olarak araştırmak yerine aşağı akış analizleri için işlenebilir ve bu da farklı segmentlerin sonuç temsilcisini ^{maskeleyebilir14}.

Dissositasyonlu murin ovidüktal hücreler, büyük olasılıkla bu dokudan hücre verimini sınırlaması nedeniyle akış sitometrisi tarafından nadiren araştırılmıştır. Bu sorunun üstesinden gelmek için bir yaklaşım, hücreleri ayrıştırmak, kültürde büyütmek ve daha sonra aşağı akış hücre analizi için uygun hücre numaralarını elde etmek için yeniden farklılaşma in vitrosunu teşvik etmek olmuştur15,16,17,18. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, kültürde ex vivo ve değiştirilmiş mikroçevrim zamanıdır ve her ikisi de gen ekspresyonunun değişmesidir. Morfolojik yeniden farklılaşmanın, bozulmamış hayvanda mevcut olan transkripsiyon ve proteomik imzaya sahip olduğu varsayımı da vardır. Mevcut ayrışma yöntemi, tek hücre farklılaşması sürdürülürken heterojen ovidüktal hücre popülasyonunda en yüksek sayıda epitel hücre elde etmek için tasarlanmıştır. Ayrıca, çoğunlukla enzmatik olmayan yaklaşım muhtemelen hücre yüzey proteinlerinin kaybını sınırlar.

Protokol

Tüm hayvan taşıma ve prosedürleri Kaliforniya Üniversitesi, Riverside kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandı ve Amerikan Laboratuvar Hayvanları Bakım Derneği, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin yönergelerine uygundu. Açıklanan yöntem C57BL / 6 yetişkin, dişi fareler kullandı. Tüm hayvanlar doku hasadı öncesinde kafalarının kesilmesiyle ötenaziye tabi edildi.

NOT: Yumurta kanalının verimli bir şekilde sökülmesine ve geri tepmesine yardımcı olmak için mavi bir boya kullanan protokole genel bir bakış ilk şekilde gösterilmiştir (Şekil 1).

Şekil 1: Mikrodiseksiyon yöntemine genel bakış. (A) Sol panel, yumurtalık yağ yastığının çoğunun ve yumurtalığı çevreleyen bağ dokusu kalıntılarının çoğunun çıkarıldığı sağlam yapıyı gösterir. Bundan sonra, toluidin mavisinin eklenmesi, yumurta kanalının bobinlerini (orta panel) ayırt etmeye yardımcı olur. Sağ panel, yumurtalığın çıkarılmasından sonraki yapıları gösterir. (B) Her segmentin nerede başlayıp nerede bittiğini belirlemek için iç dönüşlere sahip tepmeyen bir yumurta kanalı. (C) Kullanılan segmentasyonun karikatürü (ölçeklemek için çizilmez). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Diseksiyon yüzeyinin hazırlanması

1. Petri kabına yapışkanlı bir diş cilası parçası yapıştırın ve kurumaya bırakın (Şekil 2A). Yemeği% 70 etanol ile sterilize edin. Yüzey diseksiyona hazır.

2. Yumurtalık, yumurtalık ve uterusun makrodiseksiyonu

1. Diş mumunu içeren Petri kabını diseksiyona hazır olduğunda diseksiyon mikroskobu altında tercih edilen soğuk bir platformda (örneğin, kullanımdan önce -20 °C'de tutulan bir buz torbası) hareketsiz hale getirin (Şekil 2A).
2. Hayvanın ventral yüzeyini% 70 etanol ile dezenfekte edin. Karın ve pelvik boşluğu steril diseksiyon makası ile açın ve dorsal bihornal uterusu bulmak için gastrointestinal sistemi bir tarafa taşıyın. Böbreğin hemen altında bulunan rahim yağ yastığında zarflanmış her bir yumurtalığı ve yumurtalığı bulmak için her bir uterus boynuzu rostral olarak takip edin (Şekil 2B,C).
3. Hem yumurtalıklarla lateral oviducts hem de diseksiyon makası kullanılarak hala bağlı distal rahim boynuzu bir kısmını kesin. Her bir lateral rahim boynuzu, hala sarmal yumurtalığa ve yumurtalığa bağlı olan boynuzunun yaklaşık 1-2 cm'si ile kesin (Şekil 2D). Dokuyu hemen 2 mL soğuk diseksiyon ortamına batırın (bkz. Malzeme tablosu).

Şekil 2: Yumurtalığın makrodiseksiyonu ve diseksiyon kurulumu. Yumurta kanalı, yumurtalık yağ yastığı (B) içindeki böbreğin tabanındaki pelvik boşlukta dorsally olarak bulunur. Pelvik boşlukta (C) rahim çatallanmasını bulun ve uterus-oviduct-yumurtalık sürekliliğini (B) bulmak için lateral rahim boynuzu izleyin. Bir rahim boynuzu ve kaba diseksiyonu keserek bu yapıları çıkarın. Diseksiyon platformuna (A) yerleştirin ve rahim kısmını diş ağdasına bir iğne (A ve D) ile yapıştırın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Diseksiyon platformuna yapışmaya izin vermek için yeterli rahim boynuzu sağlam ve yumurta kanalına tutturulmuş olarak bırakın (Şekil 2D).

4. Diseksiyon için dokuyu sabitlemek için steril 25 G iğne ile rahim dokusunu diş ağdasına yapıştırın (Şekil 2A, D ve Şekil 3A). Diseksiyon mikroskobu altında çalışarak yumurtalık yağ yastığını ve bağ dokusunu temizleyip parçalara ayrıştırarak yumurta kanalının net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar (Şekil 3B).

Şekil 3: Adım adım oviduct mikrodiseksiyon. Kalıntı yağ ve bağ dokusunun (A,B) çıkarılmasını takiben, dokuya (C) toluidin mavisi ekleyin ve ardından yumurtalığın görselleştirilmesini ve daha sonra çıkarılmasını ve tüpün (D-H) geri tepmesini kolaylaştırmak için yıkayın. Infundibulum proksimal isthmus ve uterin-tubal kavşağının (UTJ) yanında bulunabilir. Mezosalpinx'te keserken distal ucu hafifçe çekin ve uygun segmentasyona yönlendirmek için yumurta kanalının (H) endojen dönüşlerini ortaya çıkarın. Şekil A-C ölçek çubuğu = 500 μm, D-H ölçek çubuğu = 400 μm (I) Çeşitli segmentlerin karikatürü (ölçeklemek için çizilmez). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. 1 mL şırınd kullanarak, uterusa yapıştırılmış oviduct'u 30 s-1 dakika boyunca 1-2 damla steril% 1 toluidin mavi boya çözeltisi içinde dağıtın ve kuluçkaya yayalım. Soğuk Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) ile durulayın ve tüm sıvıyı çıkarın (Şekil 3C).
6. Yumurtalığı bobinli yumurtalıktan hafifçe çekin ve tubal dokudan ödün vermeden yumurtalığı yumurtalıktan çıkarmak için bursal zarı ve geniş ligamenti kesin (Şekil 3D,E).
   NOT: Yumurtalık yumurta kanalına bağlanmaz, ancak oviduct (Şekil 2D) ile bursal zara kaplanır ve geniş bağ yoluyla uterusun lateral tarafına bağlanır.

3. Yumurta kanalının mikrodispeksiyonu ve segmentasyonu

1. Rahim-tubal kavşağına (UTJ) yanal bulunan yumurta kanalının distal, fimbrial ucunu bulun. Yumurta kanalı kendi kendine döner; bu nedenle fimbrial uç proksimal uca yanal olarak yerlenebilir ve yumurta kanalının tesirini çözmek için yönlendirmek için uygun bir başlangıç noktasıdır (Şekil 3F,I).
   1. Tüpü hafifçe çekerken, yumurta kanalını sönmek için yay şeklindeki mikro makasla mezosalpinkste (Şekil 3I) kesin (Şekil 3G).
2. Tesbihini açtıktan sonra, infundibular, ampullary ve istemik bölgeleri üretmek için tüpü kesin (Şekil 3H).
   1. İnfundibulum 'un (fimbrial uç ve proksimal sap) eksizyonunun ardından, ampullery bölgesini tüpün ikinci belirgin dönüşünden sonra keserek kesin (iki ila üç dönüşler arasında yaklaşık 1 cm uzunluğunda kesin). Son olarak, kalan kısmı istikam bölgesi olan UTJ'ye kesin (Şekil 3H).
      NOT: Yumurta kanalı tamamen düz bir yapıya dönüşmeyecektir. Tüp dönüşlerini koruyacaktır (Şekil 3H)³. Ampullary bölgesini takip eden sonraki dönüşlere dayanarak, kalan tüpü ampullary-isthmic kavşağına ve isthmus3'e daha fazla parçalayabilir. Ampulla eksizyonun ardından, ampullary-isthmic kavşağını elde etmek için beş ila altı dönüşleri arasında kesin; kalan tüp (UTJ'nin başlangıcına altı dönüş) ^{isthmus3'tür}.
3. RNA izolasyonu için sıvı nitrojende parçalanmış doku segmentlerini hemen dondurun veya her segmenti yönlendirilmiş gömme ve immünohistolojik analiz için sabitleyin ve işleyin.
   1. RNA ekstraksiyonu için devam ediyorsanız dokuya 200 μL soğuk RNA ekstraksiyon reaktifi ve 1:1 homojenizasyon boncuk karışımı ekleyin (bkz. malzeme tablosu).

4. Oviduct ayrışması

1. Yukarıdaki adım 3.1.1'den devam eder) Epitelinin optimal ayrışması için, luminal epitelin açığa çıkması için mümkün olan alanlarda (yani infundibulum ve ampulla) yumurta kanalını kesin (Şekil 4A).

Şekil 4: Oviduct hücre ayrışması, bölüm 1. Optimal hücre ayrışması (A) için distal epitelin nasıl açığa çıkarılacağını gösteren karikatür ve 1 ^mm2 mesh'i (B) kullanmanın en kolay yolunu gösteren bir görüntü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Fimbrial bölgeden başlayarak, forsepsleri kaldıraç olarak kullanarak, tüpü yay şeklindeki makasla uzunlamasına kesin.

2. Yarık açık kısımları ve kalan yumurta kanalını parçalara ayırın (~1-2 mm boyut) ve 5 mL sıcak, enzimatik olmayan ayrıştırma tamponu ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) ve 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
   1. Doku parçalarını ve ayrışmış hücreleri 9-10 dakika boyunca her 3 dakikada bir ampul pipetörü ile yeniden biriktirin. Dissosiyelasyon tamponu 1:1'i soğuk diseksiyon ortamı ile seyreltin.
3. Hücreleri santrifüjleme (350 x g, 3 dk, 4 °C) ile toplayın. Hücreleri oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 2 mL RBC liziz tamponunda yeniden depolayın ve ardından soğuk diseksiyon ortamı ile 1:1 seyreltin.
4. Hücreleri santrifüjleme (350 x g, 3 dk, 4 °C) ile toplayın ve 5 mL soğuk pronaz çözeltisinde yeniden depolayın.
   1. Pronaz sindirim ortamında kuluçkaya yaslanın ve tek bir hücre süspansiyonu elde edilene kadar (~25-30 dk) her 3-5 dakikada bir ampul pipetörü ile hücre kümelerini yeniden dürtün.
      NOT: Bu adım, gereksiz aşırı pozlamanın pronase olmasını önleyen sürekli gözleme izin vermek için en iyi şekilde bir doku kültürü plakasında veya şişesinde gerçekleştirilir.
5. Kalan bozulmamış doku parçalarını çıkarmak için hücreleri steril bir makro ağdan (kauçuk bantlı konik bir tüpe yapıştırılmış 1 mm x 1 mm ağ) geçirin (Şekil 4B).). Hücreleri santrifüjleme (350 x g, 3 dk, 4 °C) ile toplayın ve aşağı akış analizine uygun soğuk bir ortamda yeniden depolayın (örneğin, akış sitometrisi için boyama işlemine devam ediyorsanız FACS tamponu).

5. Oviductal segmentlerin RNA ekstraksiyonu

1. Paslanmaz çelik boncuk karışımını kullanarak 4 °C'de iki aralık (her biri 3 dk) için seviye 12'de bir boncuk mermisi blender doku homojenizatörinde 200 μL RNA ekstraksiyon reaktifinde çıtçıtlı donmuş numuneleri homojenize edin.
   NOT: RNA bütünlüğünü korumak için numuneler hemen donmuş durumdan RNA ekstraksiyon reaktifine taşınmalı ve tartılmamalıdır.
2. Sıvıyı boncuklardan ayırmak için oda sıcaklığında yaklaşık 5 sn masa üstü santrifüjde 100-200 x g'da kısa bir süre santrifüj homojene olur. Süpernatant'ı yeni bir tüpe aktarın.
3. Daha fazla numuneyi kurtarmak için boncuklara 200 μL daha RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyin, ardından santrifüjleme (100-200 x g, 5 s, oda sıcaklığı). Üstünlükleri birleştir.
   NOT: Süpernatantı çıkarırken boncuk taşımayı önlemek için küçük bir pipet ucu kullanın (çoğu p200 ucu uygundur).
4. RNA'yı aşamalı olarak ayırmak ve çökeltmek için üreticinin yönergelerine uyun. Temsili numuneler gece boyunca -20 °C'de %100 izopropanol (yaklaşık 2:1 hacim, izopropanol: geri kazanılan sulu faz) ile çökeltildi.
5. RNA çökeltisinin tamamını, çözelti ile birlikte RNA bağlayıcı bir spin sütununa ve 9.500 x g'da 30 sn santrifüje aktarın. RNA'yı üreticinin yönergelerine göre kolon üzerinde arındırın ve ardından RNA'yı 20 μL çekirdeksiz suya boşaltın. Bir mikrovolum spektrofotometresi ve/veya biyoanalyzer üzerindeki kaliteyi/miktarı değerlendirin.

Sonuçlar

Açıklanan ayrışma protokolü, her iki yumurta kanalının birikmesiyle fare başına 100.000-120.000 hücre sağlar. Yöntem, çok siliated hücre kenarlıklarını bozulmadan bırakacak kadar naziktir, çok siliated hücreler ve salgı hücreleri arasında bir ayrım sağlar ve sindirim yönteminin farklılaşmayı önleyecek kadar nazik olduğunu doğrular. Şekil 5'teki temsili immünofluoresans görüntüleri, %4 paraformaldehit (PFA)/ DPBS'de 3 dakika sabitlenen, %1 sığır serum a...

Tartışmalar

Yumurta kanalının üç segmenti histolojik, morfolojik ve fonksiyonel olarak ^{farklı1,2,3'tür}. Epitel, yumurta kanalının bir ucundan diğerine büyük ölçüde değişir. Fimbrial/infundibular uçta siliated hücreler baskınken, istik bölgede salgı hücreleri ^hakimdir1. Bu genel gradyan bir süredir tanınsa da, son çalışmalar oviductal segmentler arasında daha fazla ayrım ortaya çıkardı....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB05	Mix 1:1 with 1.4 mm SSB14B, sterilized
1.4 mm Stainless steel bead mix	Next Advance	SSB14B	Mix 1:1 with 0.5 mm SSB05, sterilized
1X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline A, pH 7.4 (DPBS)	Gibco	21600-010	Cold, sterile
25G needle	BD	305122
60 mm sterile petri dishes	Corning	430166
70 μm cell meshes	Fisherbrand	22-636-548
Agilent Eukaryote Total RNA 6000 Pico Chip kit	Agilent 2100 Bioanalyzer	5067-1513
Bead Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	BBY24M
Bioanlyzer	Agilent 2100 Bioanalyzer
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906
Cold plate/pack/surface of choice	N/A	N/A	Kept at -20C for dissection
Dental wax	Polysciences Inc.	403
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/ Ham’s F12	Corning	10-090-CV	Prepare dissection medium: DMEM/ Ham’s F12, 10% FBS, 25 mM Hepes, 1% Pen-Strep
Fetal Bovine Serum	Corning	35-015CV
Fine point forceps of choice	N/A	N/A
Glycine	Sigma Aldrich	G712b	Immunocytochemical validation images
Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21422	Immunocytochemical validation images
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11001	Immunocytochemical validation images
Hepes	Sigma Aldrich	H-3784
Hoescht 33342	Cell Signaling Technologies	4082S	Immunocytochemical validation images
Inverted compound microscope	Keyence BZ-X700
Mouse anti-mouse Occludin	Invitrogen	33-1500	Immunocytochemical validation images
Non-enzymatic dissociation buffer	N/A		5 mM EDTA, 1 g/L glucose, 0.4% BSA, 1X DPBS
Nylon macro-mesh 1 mm x 1 mm	Thomas Scientific	1210U04
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P-6148	Immunocytochemical validation images
Pen-Strep	MP Biomedicals	10220-718
Prolong Gold Antifade Reagent	Cell Signaling Technologies	9071S	Immunocytochemical validation images: antifade mounting medium
Pronase	Sigma Aldrich	10165921001	Prepare pronase digestion medium: 0.15% Pronase in DMEM/Ham's F12, sterile
Propidium Iodide	Roche	11 348 639 001	Viability validation images
Rabbit anti-mouse Acetylated-Tubulin	Abcam	ab179484	Immunocytochemical validation images
RBC lysis buffer	BD Biosciences	555899
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74134	Utilized for on-column purification in text.
Spring form microdissection scissors	Roboz Surgical	RS-5610
Sterile 3 mL bulb pipettors	Globe Scientific	137135
Toluidine blue	Alfa Aesar	J66015	Prepare toluidine blue solution: 1% in 1X DPBS, sterile
Tris-Buffered Saline-Tween (TBST)	N/A	N/A	Immunocytochemical validation images; 0.1 N NaCl, 10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1% Tween 20
Triton-X-100	Mallinckrodt Inc.	3555	Immunocytochemical validation images
Trizol RNA Extraction Reagent	Invitrogen	15596026	Referred to as RNA extraction reagent. Nucelase-free water, chloroform and isoproponal are required in supplement of performing Trizol extraction per manufacturer's guidelines