Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

Özet

Onun etiketi saflaştırma, diyaliz ve aktivasyon, bakterilerde çözünür, aktif matriks metalloproteinaz-3 katalitik alan protein ekspresyonunun verimini arttırmak için kullanılır. Protein fraksiyonları SDS-PAGE jelleri ile analiz edilir.

Özet

Matriks metalloproteinazlar (MMP'ler), hücre dışı matriks (ECM) bozunması ve yeniden şekillenmesinde merkezi rolleri olan metzinsin proteazlar ailesine ve ayrıca çeşitli büyüme faktörleri ve sitokinlerle etkileşimlere aittir. Spesifik MMP'lerin aşırı ekspresyonu, kanser, nörodejeneratif hastalıklar ve kardiyovasküler hastalık gibi çeşitli hastalıklardan sorumludur. MMP'ler, MMP aşırı ekspresyonu ile ilişkili hastalıkları tedavi edebilen terapötikler geliştirmeyi hedef alan hedefler olarak son zamanlarda ilgi odağı olmuştur.

Çözeltideki MMP mekanizmasını incelemek için, aktif, çözünür MMP'lerin üretimi için daha kolay ve sağlam rekombinant protein ekspresyonu ve saflaştırma yöntemlerine ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, çoğu MMP'nin katalitik alanı, posttranslasyonel makine eksikliği nedeniyle Escherichia coli'de (E. coli) çözünür formda ifade edilemezken, memeli ekspresyon sistemleri genellikle maliyetlidir ve daha düşük verime sahiptir. MMP inklüzyon organları, doğal konformasyondaki MMP'lerin verimini önemli ölçüde azaltan sıkıcı ve zahmetli kapsamlı saflaştırma ve yeniden katlama sürecinden geçmelidir. Bu yazıda, matris metalloproteinaz-3 katalitik etki alanı (MMP-3cd) üretmek için Rosetta2 (DE3) pLysS (bundan böyle R2DP olarak anılacaktır) hücrelerini kullanan ve afinite saflaştırmasında kullanılmak üzere bir N-terminal His-etiketi ve ardından pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) içeren bir protokol sunulmaktadır. R2DP hücreleri, bakteriyel ekspresyon sistemlerinde normalde nadir görülen kodonları içeren kloramfenikol dirençli bir plazmid yoluyla ökaryotik proteinlerin ekspresyonunu arttırır. Rekombinant protein ekspresyonu için tercih edilen geleneksel hücre hattı BL21 (DE3) ile karşılaştırıldığında, bu yeni suşu kullanarak saflaştırma, saflaştırılmış Hisx6-pro-MMP-3cd'nin verimini artırdı. Aktivasyon ve tuzdan arındırma üzerine, pro etki alanı N-terminal His-tag ile birlikte bölünür ve sayısız in vitro uygulamada anında kullanım için aktif MMP-3cd sağlar. Bu yöntem pahalı ekipman veya karmaşık füzyon proteinleri gerektirmez ve bakterilerde rekombinant insan MMP'lerinin hızlı üretimini tanımlar.

Giriş

Çoğu kompleks ökaryotik protein, ekspresyondan sonra ayrıntılı posttranslasyonel modifikasyonlara uğrar ve yüksek oranda yardımcı protein katlanmasını ve ko-faktörlerin işlevsel olmasını ^gerektirir1. Bir bakteri konağında büyük miktarlarda çözünür insan proteini üretmek, yüksek maliyetler ve daha küçük ölçekli laboratuvar deneyleri için bile sağlam ekspresyon ve saflaştırma yöntemlerinin bulunmaması nedeniyle önemli bir zorluk olmaya devam ^{etmektedir2,3}. MMP'ler, büyük moleküler ağırlığa sahip insan endopeptidazları, genellikle E. coli'de ifade edildiğinde çözünmez inklüzyon c....

Protokol

1. MMP ifadesi

1. pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd'nin klonlanması ve R2DP hücrelerine dönüştürülmesi
   1. pET-3a plazmidini (Malzeme Tablosuna bakınız) Digest Buffer'daki NdeI ve BamHI kısıtlama enzimleri ile sindirin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Toplam 40 μL'lik bir reaksiyon hacminde, 4 μL Sindirim Tamponu, 33 μL 100 ng / μL plazmid ve her bir kısıtlama enziminin 1.5 μL'sini ekleyin ve reaksiyonun 37 ° C'de tamamlanana kadar ~ 2 saat ilerlemesine izin verin.
   2. Bir N-terminal His-etiketi eklemek için MMP-3cd dizisinde bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin. 25 μL PCR Karışımı ( Malzeme Tablosuna

Sonuçlar

SDS-PAGE'de numuneler çalıştırılırken, protein çözünmez inklüzyon cisimleri şeklinde ifade edildiğinden, lize ve sonikasyonlu fraksiyonlar, protein henüz üre içinde çözünmediğinden, Hisx6-pro-MMP-3cd ekstraktını çok az içermeli veya hiç içermemelidir. Şekil 3 , BL21 (DE3) hücrelerinden ve R2DP hücrelerinden Hisx6-pro-MMP-3cd'nin His-tag saflaştırma elüsyon fraksiyonlarını karşılaştırmaktadır. Elüsyon fraksiyonları, diyalizden önce hem BL21 (DE3) hem d.......

Tartışmalar

Çözünür, insan, rekombinant MMP'lerin büyük ölçekli üretimi zorlu bir görev olmaya devam etmektedir. Memeli hücreleri, fonksiyonel MMP'leri yüksek maliyetlerle ve uzun bekleme süreleriyle ifade edebilirken, E. coli hızla saflaştırılması ve yeniden katlanması gereken yüksek miktarda MMP inklüzyon cismi ^üretir11,16. R2DP hücreleri, MMP inklüzyon gövdelerinin verimini önemli ölçüde artırarak daha uygun maliyetli ve üretken bir.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm sterile filter	Sigma Aldrich	SLGP033RS	Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging
1 L Erlenmeyer flasks	Thermo Fisher Scientific	S76106F	n/a
1 L glass bottles	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
1.5 mL microfuge tubes	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	n/a
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 G, 1-in. beveled needle	Amazon	B07S7VBHM2	Used in combination with the dialysis casette
2 mL desalting column	Thermo Fisher Scientific	89890	Removes APMA following activation
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	n/a
250 mL conical bottle cushions	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation
250 mL conical bottles	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
400 mL stirred cell	Sigma Aldrich	UFSC40001	Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit
4-aminophenylmercuric acetate (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	Activates MMP-3 by cleaving the propeptide
5 mL syringe	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	Used in combination with the dialysis casette
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	Used for storage in many purification steps
50 mL re-concentration tube	Sigma Aldrich	UFC901024D	Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling
Ampicillin	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media
BamHI	NEB	R3136S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Calcium chloride (CaCl2)	Thermo Fisher Scientific	600-30-23	The calcium ion stabilizes MMP structure
Cell spreaders	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	Can be used to spread cells across a petri dish after transformation
Chloramphenicol	Thermo Fisher Scientific	22-055-125GM	Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media
Dialysis Buffer 1	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialysis Buffer 2	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialysis Buffer 3	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2.
Dialysis clips	Thermo Fisher Scientific	68011	Used in combination with snakeskin dialysis tubing
Dialysis tubing	Thermo Fisher Scientific	88243	Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss
Digest buffer	NEB	B7204S	Buffer used in digesting the pET3a vector
Disposable cuvettes	Thermo Fisher Scientific	21-200-257	Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	D107125G	Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds
DNA assembly mix	NEB	E2621S	Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector
DNase I	NEB	M0303S	Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	A995-4	n/a
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds
Gel recovery kit	Promega	A9281	Isolates and purifies DNA from agarose gels
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-500	Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C
Gravity flow column	BioRad	7321010	Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins
Guanidine hydrochloride (GdnHCl)	Thermo Fisher Scientific	AAA135430B	Second chaotropic agent used for disrupting protein secondary structure.
High-transformation efficiency cells	NEB	C2987	High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elution Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
HT Equilibration Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4
HT Regeneration Buffer	n/a	n/a	20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0
HT Wash Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
Hydrochloric acid (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	Used to pH buffers
Imidazole	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein
Inclusion Body Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C
LB Amp CamR media	n/a	n/a	To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Amp CamR plates	n/a	n/a	To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride
Lysis Buffer	n/a	n/a	50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0
Lysozyme	MP Biomedicals	195303	Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls
Miniprep kit	Promega	A1330	If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants
NdeI	NEB	R0111S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Ni-NTA resin	Thermo Fisher Scientific	PI88221	Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole
PCR mix	NEB	M0492S	A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector
pET plasmid	Addgene	n/a	The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers
Petri dishes	VWR	25384-342	Used for plating transformants on LB agar media
R2DP cells	Novagen	714033	BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli
SOC growth media	NEB	B9020S	Non-selective growth media for rapid growth during transformation
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	Used in buffers and helps with protein stability
Sodium deoxycholate	Thermo Fisher Scientific	PI89905	Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls
Solubilization Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0
Tris base	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	Detergent used for cell lysis
Urea	Thermo Fisher Scientific	AAJ75826A7	First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure
Zinc chloride (ZnCl2)	Thermo Fisher Scientific	AAA162810E	Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3