Expressão bacteriana e purificação da matriz humana Metaloproteinase-3 usando cromatografia de afinidade

Resumo

Sua marca purificação, diálise e ativação são empregadas para aumentar os rendimentos da expressão proteica de domínio catalítico de matriz solúvel-3 em bactérias. As frações proteicas são analisadas através de géis SDS-PAGE.

Resumo

As metaloproteínas matricial (MMPs) pertencem à família de proteases metzincinas com papéis centrais na degradação e remodelagem da matriz extracelular (ECM), bem como interações com diversos fatores de crescimento e citocinas. A superexpressão de MMPs específicos é responsável por diversas doenças, como câncer, doenças neurodegenerativas e doenças cardiovasculares. Os MMPs têm sido o centro das atenções recentemente como metas para desenvolver terapêuticas que possam tratar doenças correlacionadas à superexpressão de MMP.

Para estudar o mecanismo MMP em solução, são necessários métodos de expressão e purificação de proteínas recombinantes mais fáceis e robustas para a produção de MMPs ativos e solúveis. No entanto, o domínio catallítico da maioria dos MMPs não pode ser expresso em Escherichia coli (E. coli) em forma solúvel devido à falta de máquinas pós-transicionais, enquanto os sistemas de expressão dos mamíferos são geralmente caros e têm rendimentos mais baixos. Os órgãos de inclusão de MMP devem passar pelo processo tedioso e trabalhoso de purificação extensiva e re dobra, reduzindo significativamente o rendimento de MMPs na conformação nativa. Este artigo apresenta um protocolo usando células Rosetta2(DE3)pLysS (doravante referida como R2DP) para produzir domínio catalítico matrix metalloproteinase-3 (MMP-3cd), que contém uma tag N-terminal Sua seguida por pró-domínio (Hisx6-pro-MMP-3cd) para uso na purificação de afinidade. As células R2DP aumentam a expressão de proteínas eucarióticas através de um plasmídeo resistente a clororamfenícol contendo códons normalmente raros em sistemas de expressão bacteriana. Em comparação com a linha celular tradicional de escolha para expressão de proteína recombinante, BL21(DE3), a purificação usando esta nova cepa melhorou o rendimento do Hisx6-pro-MMP-3cd purificado. Após a ativação e desalagem, o domínio pro é cortado juntamente com o N-terminal His-tag, fornecendo MMP-3cd ativo para uso imediato em inúmeras aplicações in vitro . Este método não requer equipamentos caros ou proteínas de fusão complexas e descreve a rápida produção de MMPs humanos recombinantes em bactérias.

Introdução

A maioria das proteínas eucarióticas complexas sofrem modificações pós-transicionais elaboradas após a expressão, exigindo dobramento de proteína altamente assistida e cofatores para serem ^funcionais1. Produzir grandes quantidades de proteína humana solúvel em um hospedeiro bacteriano continua sendo um desafio significativo devido aos altos custos e à falta de métodos robustos de expressão e purificação, mesmo para experimentos laboratoriais de menor ^escala2,3. OS MMPs, endopeptidases humanas com grande peso molecular, são geralmente expressos como corpos de inclusão insolúveis quando expressos em E. coli. A extração de MMPs humanos solúveis muitas vezes leva a um processo de solubilização e reabascamento laborioso e ^demorado4.

Os MMPs têm papéis críticos em processos fisiológicos e patogênicos. Os MMPs humanos são uma família de 23 endopeptidases de zinco, categorizadas pela especificidade de estrutura e substrato, e expressas diferencialmente apesar de um domínio catalítico altamente ^{conservado5,6}. Os MMPs são secretados como zymogens inativos, regulados via ativação pós-translacional e seus inibidores endógenos, inibidores de tecidos de metaloproteinas (TIMPs)7,8,9,10. Embora inicialmente reconhecidos por seu papel na rotatividade do ECM, os MMPs também foram implicados no desenvolvimento, morfogênese, reparação de tecidos e ^{remodelação8}. A desregulação dos MMPs tem sido notavelmente ligada ao câncer, juntamente com doenças neurodegenerativas, cardiovasculares e fibrosas, entre outras ^doenças5,7.

O desenvolvimento de métodos robustos de produção de MMP em larga escala é fundamental para garantir o sucesso de estudos futuros de mecanismos MMP por meio de ensaios bioquímicos e baseados em células. Vários MMPs foram previamente expressos em ^bactérias11, incluindo MMPs com marca Hisx6, sem alterar a atividade MMP12,13,14,15. No entanto, esses métodos incluem passos longos e tediosos que podem ser difíceis de replicar.

As células mamíferas também podem ser usadas para expressar muitas proteínas humanas diferentes, garantindo as modificações pós-transacionais ^adequadas16. Embora o sistema de expressão de mamíferos seja a escolha ideal para produzir proteínas humanas recombinantes com modificações pós-translacionais adequadas, as principais desvantagens deste método são os baixos rendimentos iniciais, meios de crescimento caros e reagentes, longas linhas temporais para alcançar linhas de expressão estáveis e risco de contaminação com outras espécies, como fungos ou ^{bactérias2,11} . Além disso, a produção de MMP em linhas de células de mamíferos produz impurezas de proteínas celulares associadas, como TIMPs ou fibronectinas11. Ao contrário do lento crescimento celular observado em células mamíferas, o sistema de expressão bacteriana oferece produção de proteínas em larga escala em um curto período, juntamente com requisitos mais simples de mídia e crescimento. No entanto, devido à falta de outras proteínas celulares associadas (ou seja, TIMPs) em sistemas de expressão bacteriana, os MMPs ativos em concentrações mais elevadas estão sujeitos à degradação por meio da autoproteólise, resultando em baixo rendimento de ^MMP17.

Este artigo descreve um método detalhado para expressão bacteriana, purificação e ativação do recombinante Hisx6-pro-MMP-3cd usando E. coli como hospedeiro de expressão devido à sua acessibilidade, simplicidade e sucesso na produção de maiores rendimentos de MMPs2,3,18. Uma vez que a E. coli não tem o maquinário dobrável de proteínas e o processamento pós-transicional necessário para MMPs recombinantes e outras proteínas complexas, muitas cepas de E. coli foram projetadas para superar essas limitações, tornando a E. coli um hospedeiro mais adequado para a expressão de MMP-3cd humano recombinante,19,20 . Por exemplo, a cepa R2DP usada neste estudo aumenta a expressão eucariótica fornecendo um plasmídeo resistente a clororamfenícol contendo códons raramente usados em E. coli.

Como descrito neste protocolo, após a superexpressão de corpos de inclusão relativamente puros do vetor pET-3a (Figura 1) em células R2DP, proteínas do domínio catalítico Hisx6-pro-MMP-3 (MMP-3cd) são extraídas e desnaturadas4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19 foi purificado usando cromatografia de tag de afinidade. Após a redobramento e diálise, o pro-MMP-3cd (zymogen) foi ativado por acetato 4-aminofenilmerárico (APMA), e a análise SDS-PAGE é usada para avaliar os rendimentos e a necessidade de mais ^{purificação5,21}. Este protocolo descreve a expressão, purificação e ativação do MMP-3cd solúvel como exemplo. No entanto, também pode ser usado como guia para a expressão de outros MMPs e proteases humanas com expressão semelhante, e mecanismos de ativação (Figura 2). Para outras proteínas além do MMP-3cd, o leitor é aconselhado a determinar as composições e métodos de buffer ideais para sua proteína alvo antes de tentar este protocolo.

Figura 1: Mapa plasmídeo do pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid. O vetor pET-3a inclui um gene de resistência à ampicilina. Uma sequência de tags Hisx6-terminal N é clonada no vetor baseado em pET-3a, incluindo pró-MMP-3cd, para produzir a construção pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd sob controle do promotor T7 entre os locais de restrição BamHI e NdeI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Expressão bacteriana de pro-MMP-3cd, purificação, repato e ativação. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plasmid foi transformado em células BL21(DE3) ou R2DP. 1.2: A expressão proteica Pró-MMP-3cd foi induzida por IPTG. 1.3: A lise química e a sônica são utilizadas para extrair proteínas Hisx6-pro-MMP-3cd que são principalmente insolúveis e encontradas nos corpos de inclusão. A ureia foi usada para desnaturar e solubilizar proteínas de corpos de inclusão. 2.1. A proteína Hisx6-pro-MMP-3cd foi purificada por meio da purificação da cromatografia de afinidade. 3. O Hisx6-pro-MMP-3cd elucido foi lentamente redobrado durante a diálise através da remoção gradual da ureia do buffer. 4. Finalmente, a proteína MMP-3cd repato foi ativada usando APMA removendo o domínio pró-peptídeo n-terminal. A APMA é posteriormente removida da solução através da desalting. Os números correspondem a seções de protocolo descrevendo essas etapas. Abreviaturas: MMP-3cd = Domínio catalítico matrix metaloproteinase-3; APMA = acetato aminofenilmerálico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Expressão MMP

1. Clonagem e transformação de células pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd em células R2DP
   1. Digerir o plasmídeo pET-3a (ver a Tabela de Materiais) com enzimas de restrição NdeI e BamHI em Buffer digest (ver a Tabela de Materiais). Em um volume total de reação de 40 μL, adicione 4 μL de Buffer digest, 33 μL de 100 ng/μL plasmid e 1,5 μL de cada enzima de restrição e permita que a reação prossiga por ~2 h até a conclusão a 37 °C.
   2. Execute uma reação pcr na sequência MMP-3cd para inserir uma tag N-terminal His.. Use 25 μL de PCR Mix (ver a Tabela de Materiais), 2,5 μL de primers de 10 μM (Figura Suplementar S1) e 1,25 μL da sequência de inserção de 100 ng/μL. Adicione água estéril a um volume final de reação de 50 μL.
   3. Execute o produto PCR e o vetor digerido em um gel de 1% de agarose. Purifique as bandas de gel usando um Kit de Recuperação de Gel (veja a Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.
   4. Clone o produto PCR amplificado no vetor digerido entre os locais de restrição NdeI e BamHI usando o DNA Assembly Mix (veja a Tabela de Materiais). Use ferramentas on-line para determinar o volume necessário do vetor de inserção e corte para um volume total de reação de 15 μL.
   5. Descongele uma alíquota de 50 μL de células de eficiência de alta transformação (ver a Tabela de Materiais) no gelo até descongelar. Meio de Crescimento SOC pré-aque (ver a Tabela de Materiais) a 37 °C e placas LB-ampicillin (LB Amp) (ver a Tabela de Materiais).
   6. Adicione 1-2 μL da reação de montagem pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd à alíquota de 50 μL. Incubar no gelo por 30 minutos.
   7. Choque térmico das células incubando a 42 °C por 30 s. Incubar no gelo por 2 minutos.
   8. Adicione 950 μL de soc médio de crescimento a cada mistura transformadora. Agite por 1h a 250 rpm e 37 °C.
   9. Placa 100 μL dos transformadores em placas LB Amp e incubar durante a noite a 37 °C.
   10. Inocular cada colônia isolada em 10 mL de meio LB Amp. Agite durante a noite a 250 rpm e 37 °C.
   11. Extrair DNA plasmídeo por protocolo do fabricante para o kit miniprep (ver a Tabela de Materiais). Confirme a sequência da construção usando primers T7 para frente e para trás (Figura Suplementar S1).
       NOTA: O DNA de construção pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd pode ser armazenado a -20 °C. Quando estiver pronto, proceda com a transformação em células R2DP.
   12. Descongele uma alíquota de 20 μL de células R2DP (ver a Tabela de Materiais) no gelo por 2-5 min. Crescimento soc pré-aquecimento de temperatura média a ambiente e placas LB Amp ^CamR a 37 °C (veja a Tabela de Materiais).
   13. Adicione 1 μL de 100 ng/μL seqüência-confirmada pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd à alíquota de 50 μL. Mexa delicadamente para misturar e devolva o tubo ao gelo.
   14. Incubar o tubo no gelo por 5 minutos.
   15. Choque térmico das células incubando a 42 °C exatamente 30 s. Não se agite.
   16. Coloque as células no gelo por 2 minutos.
   17. Adicione 80 μL de soc de temperatura ambiente ao meio transformador. Agite por 1h a 250 rpm e 37 °C.
   18. Emplaque os transformadores em placas LB Amp ^CamR e incubar durante a noite a 37 °C.
2. Crescimento e indução
   1. Inocular uma única colônia isolada de R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd transformador de uma placa LB Amp ^CamR em 10 mL de mídia LB Amp ^CamR a 37 °C. Agite a 250 rpm durante a noite (~16 h). Salve alíquotas de cada cultura e prepare 40% (v/v) glicerol (veja a Tabela de Materiais) se desejar.
   2. Por cultura durante a noite, inocular um frasco de 1 L contendo 500 mL de meio LB Amp ^CamR a uma densidade óptica a 600 nm (_OD600) de 0,05-0,1.
      NOTA: Isso deve retornar as células ao crescimento logarítmico.
   3. Meça o _OD600 em vários pontos de tempo, normalmente para 3-4 h, até que caia entre 0,4 e 0,6.
   4. Antes da indução, alíquotar uma fração de cultura em um tubo de microfuça de 1,5 mL (ver a Tabela de Materiais) e rotulá-la de Fração Não Induzida. Armazene-o a -80 °C para análise de gel. Se não estiver executando um gel SDS-PAGE, pule esta etapa e prossiga para a etapa 1.2.5.
   5. Induzir as culturas a uma concentração final de 1 mM usando 1 M isopropílico-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) (ver a Tabela de Materiais). Continue incubando no agitador de 37 °C por mais 3-4 h.
      NOTA: Durante a expressão, o leitor deve determinar o _OD600 ideal no momento da indução e da concentração de IPTG. Se o rendimento cair substancialmente após a purificação, a concentração de imidazol em tampões de purificação pode exigir ajuste, ou a pelota celular pode precisar ser sisônica ainda mais.
   6. Antes de centrifugar as culturas, aliquotar uma fração de cultura em um segundo tubo de microfuça de 1,5 mL e rotulá-lo fração induzida. Armazene-o a -80 °C para análise de gel. Se não estiver executando um gel SDS-PAGE, pule esta etapa e prossiga para a etapa 1.2.7.
   7. Centrifugar a cultura celular em garrafas cônicas de 250 mL (ver a Tabela de Materiais) em velocidade máxima e 4 °C por 10 min.
   8. Repita o passo 1.2.7 até que as culturas estejam completamente pelotas.
      NOTA: PAUSA: As pelotas celulares podem ser congeladas a -80 °C e descongeladas posteriormente para posterior processamento. Caso contrário, pule esta etapa e prossiga para a etapa 1.3.1.
3. Inclusão extração corporal e solubilização corporal
   NOTA: Prepare a ureia fresca de 10 M, de preferência não antes de um dia de antecedência, mexendo bem até dissolver completamente. Não aqueça ou autoclave ureia; armazená-lo à temperatura ambiente.
   1. Resuspenda a pelota (a partir da etapa 1.2.8) no tampão de lise (ver a Tabela de Materiais). Por grama de pelota, adicione 3 mL de tampão de lise e resuspend por vórtice ou pipetação. Agite durante a noite a 4 °C.
   2. Adicione 1,25 mL de 10% (w/v) desoxicolato de sódio (ver a Tabela de Materiais) por 1 L de cultura. Agite à temperatura ambiente por 30 min a 150 rpm.
   3. Adicione 10 μL de DNase I (ver a Tabela de Materiais) por 1 L de cultura. Agite à temperatura ambiente por 30 min a 150 rpm.
   4. Centrifugar por 10 min a 13.000 × g e 4 °C.
   5. Reserve uma fração de MMP lysed para análise de gel. Armazene-o a -80 °C. Caso não realize a análise do gel, proceda à etapa 1.3.6.
      NOTA: Após a centrifugação, a pelota pode ser pega e não compactamente embalada, tornando arriscado descartar o supernatante. Se esse for o caso, então pule a etapa 1.3.6 e prossiga para a etapa 1.3.7.
   6. Descarte o sobrenatante das amostras centrífugas.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado neste momento e as pelotas de célula congeladas a -80 °C e descongeladas mais tarde. Caso contrário, pule esta etapa e prossiga para a etapa 1.3.7.
   7. Resuspense a pelota na cultura de 100 mL/L de Inclusão Body Buffer (ver a Tabela de Materiais) por tubulação para cima e para baixo.
   8. Durante a sonicação, mantenha as amostras no gelo para evitar superaquecimento. Sonicate cada amostra para 6 ciclos de 15 s, saída 5, e 50% de pulso. Permita períodos de descanso de 15 s para resfriamento entre os ciclos.
      NOTA: Se necessário, transfira as amostras para tubos cônicos de 50 mL para posterior centrifugação (consulte a Tabela de Materiais). Centrifugar por 10 min a 13.000 × g e 4 °C.
   9. Reserve uma fração de MMP Sonicated para análise de gel. Armazene-o a -80 °C. Caso não realize a análise do gel, prossiga para a etapa 1.3.11.
   10. Verifique a pelota. Se stringy, repita as etapas 1.3.8-1.3.10. Se a pelota for compacta, descarte o supernasce e prossiga para a etapa 1.3.12.
       NOTA: A sônica na inclusão do tampão corporal pode ser repetida para recuperar mais proteína dos detritos celulares lysed. No entanto, muita sônica pode causar cisalhamento, o que prejudica o rendimento do MMP. O protocolo pode ser pausado nesta fase, e as pelotas celulares podem ser congeladas a -80 °C e descongeladas mais tarde.
   11. Resuspend cada pelota de uma cultura 1 L em 5 mL de Tampão de Solubilização (ver a Tabela de Materiais) por pipetação. Incubar por pelo menos 30 minutos no gelo para permitir que as proteínas solubilizem.
   12. Reserve uma fração de MMP solubilizado para análise de gel. Armazene-o a -80 °C. Caso não faça a análise do gel, prossiga para a etapa 1.3.14.
   13. Centrifugar as células por 10 min a 13.000 × g e 4 °C. NÃO DESCARTE O SUPERNATANTE.
   14. Se uma pelota se formar/permanecer após a centrifugação, despeje o sobrenatante em um tubo cônico separado de 50 mL. Resuspense a pelota em outros 5 mL de Tampão de Solubilização (por 1 L de cultura) por pipetar para cima e para baixo.
   15. Centrifugar por 10 min a 13.000 × g e 4 °C. NÃO DESCARTE O SUPERNATANTE.
   16. Repita as etapas 1.3.13 e 1.3.14 até que um pouco ou nenhuma pelota se forme após centrifugação ou apenas restos de precipitado cinza. Juntar os supernantes. Descarte ou armazene a pelota a -80 °C para sônicação adicional.

2. Purificação e recobramento de MMP

1. Purificação de afinidade de sua tag (HT)
   1. De acordo com o protocolo do fabricante, preencha uma coluna de fluxo de gravidade (veja a Tabela de Materiais) com resina Ni-NTA bem misturada (veja a Tabela de Materiais). Permita que a resina se resolva e separe do buffer de armazenamento de tal forma que uma linha distinta se forme entre as duas camadas.
      NOTA: Nunca permita que a resina seque, pois o ar penetrará na resina e prejudicará o rendimento da proteína. Entre os usos, realize o procedimento de regeneração da resina descrito na seção 2.2.
   2. Deixe o buffer de armazenamento drenar. Encha a coluna com dois volumes de cama de resina de tampão de equilíbrio HT.
   3. Escorra o tampão de equilíbrio HT e descarte. Como a coluna está drenando, centrifugar o extrato de proteína a 13.000 × g por 1 min e esterilizar o filtro usando um filtro de 0,22 μm (ver a Tabela de Materiais).
   4. Troque o recipiente de resíduos por um tubo cônico de 50 mL rotulado HT Flowthrough. Adicione o extrato de proteína preparado à coluna.
   5. Reaplique o fluxo para maximizar a vinculação.
   6. Reserve uma fração de Flowthrough Fraction para análise de gel. Armazene-o a -80 °C. Caso não realize a análise do gel, proceda à etapa 2.1.7.
   7. Lave imediatamente a resina com 15 mL de tampão de lavagem HT (veja a tabela de materiais). Colete o fluxo através de tubos cônicos de 15 mL (ver a tabela de materiais) rotulados HT Wash.
      NOTA: Os valores de absorvência a 280 nm (A280) foram obtidos via espectrofotometria e utilizados juntamente com o coeficiente de peso molecular e extinção, ε, para estimar concentrações proteicas. Para Hisx6-pro-MMP-3cd desnaturado, o peso molecular é de 29,86 kDa, e ε é de 34,38 ^{M-1 cm-1}.
   8. Em branco contra ht Wash Buffer, meça e grave o A280. Repetir as etapas 2.1.7 e 2.1.8 com frações adicionais de lavagem. Uma vez que o A280 se aproxime da linha de base e as impurezas tenham sido minimizadas, proceda à etapa 2.1.9.
   9. Reserve uma fração de Fração de Lavagem para análise de gel. Repita por várias frações de lavagem. Armazene as frações a -80 °C. Caso não faça a análise do gel, prossiga para a etapa 2.1.10.
   10. Imediatamente elute Suas proteínas marcadas adicionando 5 mL de HT Elution Buffer (ver a Tabela de Materiais). Colete o fluxo através de frações de 0,5-1 mL em tubos de microfuça rotulados de Elução HT.
   11. Reserve uma fração de Fração de Eluição para análise de gel. Repita para várias frações de eluição. Armazene as frações a -80 °C. Caso não realize a análise do gel, proceda à etapa 2.1.12.
   12. Se o A280 estiver >0,3 mg/mL, diluir a fração com o Tampão de Equilíbrio HT (consulte a Tabela de Materiais).
       NOTA: A fração elucida deve ser diluída a um A280 de 0,3 mg/mL ou menos para evitar precipitação durante a diálise. O protocolo pode ser pausado aqui e as frações agrupadas congeladas a -80 °C e descongeladas mais tarde. Caso contrário, pule esta etapa e prossiga para a etapa 2.2.1.
2. Regeneração de resina
   1. Lave a resina com dez volumes de resina de tampão de regeneração HT (ver a tabela de materiais) e dez volumes de resina de água estéril.
   2. Guarde a resina como um chorume de 50% em 20% (v/v) etanol na água.

3. Repato de proteína

NOTA: Para volumes menores, os de diálise podem ser usados com menor risco de perda amostral. A tubulação de diálise é necessária se forem utilizados volumes maiores (veja a tabela de materiais).

1. Diálise
   NOTA: A concentração proteica ideal para diálise é de ~0,3 mg/mL. Se ocorrer precipitação significativa durante a diálise, reduza o gradiente de concentração de ureia entre cada diálise usando um método de diálise stepwise e adicione etapas mais intermediárias (por exemplo, de 6 M para 5 M, e depois 5 M a 4 M, em vez de pular o estágio de 5 M). Como os ciclos de congelamento danificam a estrutura celular e proteica, é vital minimizar pausas no protocolo.
   1. De acordo com o protocolo do fabricante, use a quantidade apropriada de tubos de diálise de acordo com o volume de amostras de Fração de Eluição .
   2. Submergir as frações de MMP elucidas na tubulação de diálise em 1 L de Tampão de Diálise 1 (ver a Tabela de Materiais). Mexa a tubulação e seu conteúdo em um agitador magnético por nada menos que 8h a 4 °C.
   3. Transfira para 1 L de Tampão de Diálise 2 (consulte a Tabela de Materiais). Mexa a tubulação e seu conteúdo em um agitador magnético por nada menos que 8h a 4 °C.
   4. Transfira para 1 L de Tampão de Diálise 3 (consulte a Tabela de Materiais). Mexa a tubulação e seu conteúdo em um agitador magnético por nada menos que 8h a 4 °C.
   5. Transfira a amostra para novos tubos cônicos de 50 mL e rotule-os como MMP dialisados.
   6. Examine o tubo para precipitar. Se o precipitado tiver se formado, centrifugar a amostra por 1 min a 13.000 × g e 4 °C.
   7. Transfira o supernatante para novos tubos cônicos de 15 mL e rotule-os como MMP repostados.
   8. Reserve uma fração para análise de gel e rotule-a como MMP redobrada. Armazene-o a -80 °C. Caso não realize a análise do gel, proceda à etapa 3.1.9.
      NOTA: Se os rendimentos forem baixos, o precipitado pode ser dissolvido no Tampão de Equilíbrio HT e passos na seção 3.1 repetidos com tubos de diálise. Se a análise do gel não for realizada ou se o protocolo deve ser pausado aqui, congele as amostras a -80 °C e descongele-as mais tarde. Se os rendimentos estiverem na faixa desejada, proceda à etapa 3.2.1.
2. Reconcentração
   NOTA: Espera-se que os coeficientes de extinção para Hisx6-pro-MMP-3cd redobrados sejam os mesmos; portanto, os cálculos A280 não são afetados.
   1. Reconcentrar a amostra até 0,5 mg/mL. Use uma célula mesxida de 400 mL (ver a Tabela de Materiais) para concentrar a amostra a 15 mL. Para evitar espuma, use um tubo de reconcentrização de 50 mL para se concentrar ainda mais, se necessário.
      NOTA: Se uma forma precipitada, pode ser pelotada e dissolvida no Tampão de Equilíbrio HT. Em seguida, repita as seções 3.1 e a etapa 3.2.1. Caso contrário, continue a etapa 3.2.2.
   2. Reserve uma fração para análise de gel e rotule-a como MMP concentrada.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e as amostras congeladas a -80 °C e descongeladas mais tarde.

4. Ativação

1. Ativação do acetato aminofenilmerálico (APMA)
   NOTA: A APMA é altamente tóxica. Faça uma solução de estoque fresco de 20 mM APMA antes da ativação, e sempre trabalhe sob um capô de fumaça ao usar APMA. Descarte os resíduos da APMA em seu contêiner.
   1. Por 1 mL aliquot de MMP (1 mg/mL), adicione 50 μL de 20 mM APMA (ver a Tabela de Materiais) para alcançar uma concentração final de APMA de 1 mM. Incubar durante a noite a 37 °C.
   2. Se um precipitado se formar, centrifuse-o em velocidade máxima por 10 min a 4 °C. Armazene o supernatante em um tubo de microfuça de 1,5 mL rotulado MMP ativado. Descarte o precipitado em um recipiente marcado para resíduos de APMA.
   3. Reserve uma fração para análise de gel e rotule-o de MMP ativado.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e as amostras congeladas a -80 °C e descongeladas mais tarde. Caso não realize a análise do gel, prossiga para a etapa 4.2.1. Após a ativação, o coeficiente de peso molecular e extinção de MMP-3cd são de 19,40 kDa e 28,42 ^{M-1 cm-1}, respectivamente.
2. Desalting
   1. Remova o APMA da amostra MMP-3cd ativada com uma coluna de dessecação de 2 mL (veja a Tabela de Materiais), seguindo o protocolo do fabricante.
   2. Reserve uma fração para análise de gel e rotule-a desalada MMP. Armazene-o a -80 °C. Se não realizar a análise do gel, proceda para a seção 4.3 com as demais amostras.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui e as amostras congeladas a -80 °C e descongeladas mais tarde.
3. Executando os géis SDS-PAGE
   1. Execute todas as frações proteicas em géis SDS-PAGE: Fração não induzida, Fração Induzida, MMP Lysed, MMP Sonicated, MMP Solubilizado, Flowthrough Fraction, Wash Fraction, Elution Fraction, Refolded MMP, Concentrated MMP, Activated MMP e Desalted MMP.
4. Armazenamento a longo prazo de MMP-3
   1. Adicione 0,05% (v/v) surfactante noniônico (veja a tabela de materiais) às amostras de MMP-3cd desseladas e armazene-as a -80 °C.

Resultados

Ao executar amostras em SDS-PAGE, porque a proteína é expressa na forma de corpos de inclusão insolúveis, as frações límpidas e sônicas devem conter pouco ou nenhum extrato Hisx6-pro-MMP-3cd, uma vez que a proteína ainda não foi resolutizada em ureia. A Figura 3 compara as frações de elução de purificação his-tag de Células Hisx6-pro-MMP-3cd de células BL21(DE3) e células R2DP. As frações de elução foram agrupadas separadamente para as células BL21(DE3) e R2DP antes d...

Discussão

A produção em larga escala de MMPs solúveis, humanos e recombinantes continua sendo uma tarefa desafiadora. As células mamíferas podem expressar MMPs funcionais a altos custos e longos tempos de espera, enquanto a E. coli produz rapidamente altas quantidades de corpos de inclusão de MMP que devem ser purificados e reobsecados11,16. As células R2DP aumentam significativamente o rendimento dos organismos de inclusão de MMP, permitindo um processo d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm sterile filter	Sigma Aldrich	SLGP033RS	Used to remove some contaminants from the protein extract before purification, and prevent the Ni-NTA column from clogging
1 L Erlenmeyer flasks	Thermo Fisher Scientific	S76106F	n/a
1 L glass bottles	Thermo Fisher Scientific	06-414-1D	n/a
1.5 mL microfuge tubes	Thermo Fisher Scientific	02-682-002	n/a
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	n/a
18 G, 1-in. beveled needle	Amazon	B07S7VBHM2	Used in combination with the dialysis casette
2 mL desalting column	Thermo Fisher Scientific	89890	Removes APMA following activation
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)	Thermo Fisher Scientific	AAA1610422	n/a
250 mL conical bottle cushions	Thermo Fisher Scientific	05-538-53A	Stabilize conical bottles during large-volume centrifugation
250 mL conical bottles	Thermo Fisher Scientific	05-538-53	n/a
400 mL stirred cell	Sigma Aldrich	UFSC40001	Re-concentrates a much larger volume than the centrifugal filter unit. Rosetta2(DE3)pLysS cells produce high volumes of protein that may exceed the 15 mL limit of the centrifugal filter unit
4-aminophenylmercuric acetate (APMA)	Sigma Aldrich	A9563-5G	Activates MMP-3 by cleaving the propeptide
5 mL syringe	Thermo Fisher Scientific	NC0829167	Used in combination with the dialysis casette
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	Used for storage in many purification steps
50 mL re-concentration tube	Sigma Aldrich	UFC901024D	Used for re-concentrating protein samples after dialysis or removing contaminants
Agar	Thermo Fisher Scientific	BP1423-500	Buffer ingredient that solidifies autoclaved LB media upon cooling
Ampicillin	Thermo Fisher Scientific	BP1760-25	Antibiotic used with pET3a vector; used at 100 µg/mL in LB media
BamHI	NEB	R3136S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Calcium chloride (CaCl2)	Thermo Fisher Scientific	600-30-23	The calcium ion stabilizes MMP structure
Cell spreaders	Thermo Fisher Scientific	50-189-7544	Can be used to spread cells across a petri dish after transformation
Chloramphenicol	Thermo Fisher Scientific	22-055-125GM	Antibiotic used with pET3a vector; used at 34 µg/mL in LB media
Dialysis Buffer 1	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 4 M Urea.
Dialysis Buffer 2	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 µM ZnCl2, 2 M Urea.
Dialysis Buffer 3	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2 , 1 µM ZnCl2.
Dialysis clips	Thermo Fisher Scientific	68011	Used in combination with snakeskin dialysis tubing
Dialysis tubing	Thermo Fisher Scientific	88243	Alternative dialysis method that holds much larger sample volumes, but with higher risk of sample loss
Digest buffer	NEB	B7204S	Buffer used in digesting the pET3a vector
Disposable cuvettes	Thermo Fisher Scientific	21-200-257	Used to measure the bacterial culture OD during growth and expression
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	D107125G	Assists with protein denaturation by reducing any disulfide bonds
DNA assembly mix	NEB	E2621S	Used to ligate the Hisx6-pro-MMP-3cd PCR product and digested pET3a vector
DNase I	NEB	M0303S	Endonuclease for degrading unfavorable DNA contaminants that could later affect protein purification
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	A995-4	n/a
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	J15694-AE	Used in denaturation. Prevents oxidation and subsequent formation of disulfide bonds
Gel recovery kit	Promega	A9281	Isolates and purifies DNA from agarose gels
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G33-500	Used for making glycerol stocks, which are frozen at -80 °C
Gravity flow column	BioRad	7321010	Used for Ni-NTA purification of recombinantly His-tagged proteins
High-transformation efficiency cells	NEB	C2987	High-transformation efficiency cells with greater chance of success for cloning the N-terminal His-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd construct
HT Elution Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 250 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
HT Equilibration Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea. Adjust pH to 7.4
HT Regeneration Buffer	n/a	n/a	20 mM MES, 0.1 M NaCl. Adjust pH to 5.0
HT Wash Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M urea, 25 mM imidazole. Adjust pH to 7.4
Hydrochloric acid (HCl)	Thermo Fisher Scientific	A144C-212	Used to pH buffers
Imidazole	Thermo Fisher Scientific	AAA1022122	Mimics the histidine side group. Used to separate non-specifically binding proteins from the his-tagged target protein
Inclusion Body Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, 2% v/v Triton X 100, 0.5 M Urea. Adjust pH to 8.0
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	FERR0392	A reagent that induces target gene expression in pET3a. Make 0.5 mL 1 M aliquots, filter sterilize and store in -20 °C
LB Amp CamR media	n/a	n/a	To be poured into a sterible 1 L bottle or 1 L flask. For 1 L, add 25 g LB Broth. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Amp CamR plates	n/a	n/a	To be poured into sterile petri dishes. Pour until the petri dish lid is completely covered. 1 L of media yields 40-60 plates. For 1 L: 25 g LB Broth, 16 g Agar. Sterilize by autoclaving. Once cooled to below 50 °C, add ampicillin to 100 µg/mL and chloramphenicol to 34 µg/mL
LB Broth	Thermo Fisher Scientific	BP1426-2	Pre-mixed with tryptone, yeast extract, and sodium chloride
Lysis Buffer	n/a	n/a	50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g/mL lysozyme, 0.49% v/v Triton X-100. Adjust pH to 8.0
Lysozyme	MP Biomedicals	195303	Used in protein extraction. Enzyme that lyses bacterial cell walls
Miniprep kit	Promega	A1330	If successful, extracts the pET3a-pro-MMP-3cd construct from transformants
NdeI	NEB	R0111S	Restriction enzyme to be used with the pET3a vector
Ni-NTA resin	Thermo Fisher Scientific	PI88221	Used to bind recombinant his-tagged proteins. This strong interaction can be displaced with higher concentrations of imidazole
Nonionic surfactant	Thermo Fisher Scientific	PI28316	Storage detergent for preventing MMP aggregation. Minimizes interactions between hydrophobic residues on the MMP surface and water molecules, without disrupting catalytic activity.
PCR mix	NEB	M0492S	A PCR reagent for inserting an N-terminal his-tag into the pET3a-pro-MMP-3cd vector
pET plasmid	Addgene	n/a	The pET3a vector offers ampicillin resistance, inducible expression of a target gene, and sequencing with T7 primers
Petri dishes	VWR	25384-342	Used for plating transformants on LB agar media
R2DP cells	Novagen	714033	BL21 derivatives with enhanced expression of eukaryotic proteins. Contain tRNAs of codons found to be rare in e. coli
SOC growth media	NEB	B9020S	Non-selective growth media for rapid growth during transformation
Sodium chloride (NaCl)	Thermo Fisher Scientific	BP358-1	Used in buffers and helps with protein stability
Sodium deoxycholate	Thermo Fisher Scientific	PI89905	Detergent used in protein extraction. Lyses cell walls
Solubilization Buffer	n/a	n/a	20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Urea. Adjust pH to 8.0
Tris base	Thermo Fisher Scientific	BP152-1	Common buffer used in the physiological pH range. Temperature-sensitive
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	M1122980101	Detergent used for cell lysis
Urea	Thermo Fisher Scientific	AAJ75826A7	First chaotropic agent for disrupting protein secondary structure
Zinc chloride (ZnCl2)	Thermo Fisher Scientific	AAA162810E	Stabilizes MMP structure. The zinc ion is found in the catalytic site of MMP-3