Fotostatinler Kullanılarak Canlı Preimplantasyon Fare Embriyosundaki Mikrotübül Sitoiskeletinin Spatiotemporal Subcellular Manipülasyonu

Özet

Temel ve uygulamalı araştırmalarda yaygın olarak kullanılan tipik mikrotübül inhibitörleri, hücreler üzerinde geniş kapsamlı etkilere sahiptir. Son zamanlarda, fotostatinler, mikrotübüllerin anlık, geri dönüşümlü, mekansal olarak hassas manipülasyonunu yapabilen bir fotodeğiştirilebilir mikrotübül inhibitörleri sınıfı olarak ortaya çıkmıştır. Bu adım adım protokol, fotostatinlerin 3D canlı preimplantasyon fare embriyosunda uygulanmasını detaylandırır.

Özet

Mikrotübül sitoiskeleti bir hücrenin çerçevesini oluşturur ve hücre içi taşıma, hücre bölünmesi ve sinyal iletimi için temeldir. Her yerde bulunan mikrotübül ağının geleneksel farmakolojik bozulması, örneğin nokodazol kullanarak, herhangi bir hücre için yıkıcı sonuçlar doğurabilir. Geri dönüşümlü olarak foto-değiştirilebilir mikrotübül inhibitörleri, ilaç etkilerinin mekansal olarak geçici olarak kontrol edilen bir şekilde uygulanmasını sağlayarak sınırlamaların üstesinden gelme potansiyeline sahiptir. Böyle bir ilaç ailesi, azobenzen bazlı fotostatinlerdir (PST'ler). Bu bileşikler karanlık koşullarda inaktiftir ve UV ışığı ile aydınlatıldıktan sonra, β-tübülinin kolşisin bağlanma bölgesine bağlanırlar ve mikrotübül polimerizasyonunu ve dinamik dönüşü bloke ederler. Burada, PST'lerin 3 boyutlu (3D) canlı preimplantasyon fare embriyosunda uygulanması, mikrotübül ağını hücre altı düzeyde bozmak için ortaya konmuştur. Bu protokol, deney düzeneği için talimatların yanı sıra canlı hücre konfokal mikroskopisi kullanan PST'ler için ışık aktivasyonu ve deaktivasyon parametreleri sağlar. Bu, tekrarlanabilirliği sağlar ve başkalarının bu prosedürü araştırma sorularına uygulamalarını sağlar. PST'ler gibi yenilikçi fotoanahtarlar, dinamik hücre içi mikrotübül ağının anlaşılmasını ilerletmek ve hücre iskeletini gerçek zamanlı olarak invaziv olmayan bir şekilde manipüle etmek için güçlü araçlar olarak gelişebilir. Ayrıca, PST'ler organoidler, blastoidler veya diğer türlerin embriyoları gibi diğer 3D yapılarda yararlı olabilir.

Giriş

Mikrotübül mimarisi, farklı işlevleri desteklemek için farklı hücre tipleri arasında büyük farklılıklar gösterir ^1,2. Büyüme ve büzülmenin dinamik doğası, hücre dışı ve hücre içi ipuçlarına hızlı adaptasyona ve bir hücrenin sürekli değişen ihtiyaçlarına cevap vermeye izin verir. Bu nedenle, hücresel kimlikte önemli bir rol oynayan "morfolojik parmak izi" olarak düşünülebilir.

Küçük molekül inhibitörleri kullanılarak mikrotübül sitoiskeletinin farmakolojik olarak hedeflenmesi, gelişim biyolojisi, kök hücre biyolojisi, kanser biyolojisi ve nörobiyolojide^çok say....

Protokol

Deneyler Monash Hayvan Etiği Komitesi tarafından 19143 hayvan etiği numarası altında onaylanmıştır. Hayvanlar, etik kurallara sıkı sıkıya bağlı kalarak hayvan tesisinde (Monash Hayvan Araştırma Platformu) belirli patojensiz hayvan evi koşullarında barındırılmıştır.

1. Preimplantasyon fare embriyo toplama

1. Kurumsal hayvan etiği kurallarına uygun olarak, daha önce^16,18'de tanımlandığı gibi fareleri süperovülat ve çiftleştirin.
   NOT: Canlı embriyo toplama için en yaygın kullanılan suşlar C57BL/6 veya FVB/N farelerdir. Burada gösterilen tüm veriler FVB/N fare....

Sonuçlar

Protokol doğrultusunda, preimplantasyon fare embriyolarına, kırmızı floresan dDomates (EB3-dDomates) ile etiketlenmiş EB3 için cRNA ile mikroenjekte edildi. Bu, EB3 polimerize edici mikrotübüle bağlandığı için büyüyen mikrotübüllerin görselleştirilmesini sağlar artı²⁴ uçları.

Deneyler, fare embriyosu 16 hücreden oluştuğunda döllenmeden 3 gün sonra (E3) gerçekleştirildi. Araştırılacak bilimsel soruya bağlı olarak başka herhangi bir pr.......

Tartışmalar

Mikrotübül ağı, bir hücrenin temel iç işleyişinin ayrılmaz bir parçasıdır. Sonuç olarak, bu, canlı organizmalarda mikrotübül dinamiklerini manipüle etmede zorluklar ortaya koymaktadır, çünkü ağdaki herhangi bir bozulma, hücresel fonksiyonun tüm yönleri için yaygın sonuçlara sahip olma eğilimindedir. Foto-değiştirilebilir mikrotübül hedefleme bileşiklerinin ortaya çıkışı, mikrotübül büyüme inhibisyonu^9'un indüksiyonu ve tersine çevrilmesi için üstün k.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube	Sigma-Aldrich	A5177	For mouth aspiration apparatus
Chamber slides - LabTek	Thermo Fisher Scientific	NUN155411
cRNA encoding for EB3-dTomato	N/A	N/A	Prepared according to manufacturers instructions using mMessage in vitro Transcription kit
Culture dishes - 35mm	Thermo Fisher Scientific	150560
Human chorionic growth hormone	Sigma-Aldrich	C8554
Human Tubal Fluid (HTF) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B071
Imaris Image Analysis Software	Bitplane
Immersion Oil W 2010	Carl Zeiss	444969-0000-000	For use with microscope immersion objective
LED torch - Red light	Celestron	93588
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Mice - wild-type FVB/N, males and females	N/A	N/A	Females 8-9 weeks old. Males 2-6 months old.
Microcapillary Pipettes - Kimble	Sigma-Aldrich	Z543306	For mouth aspiration apparatus
Microinjection buffer	N/A	N/A	5 mM Tris, 5 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4
Mineral oil	Origio	ART-4008-5P
mMessage In vitro Transcription kit	Thermo Fisher Scientific	AM1340
NanoDrop Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
Potassium Simplex Optimised Medium (KSOM) medium	Cosmo-Bio	CSR-R-B074
Pregnant mare serum gonadotrophin	Prospec Bio	HOR-272
PST-1P	N/A	N/A	Borowiak, M. et al., Photoswitchable Inhibitors of Microtubule Dynamics Optically Control Mitosis and Cell Death. Cell. 162 (2), 403-411, doi:10.1016/j.cell.2015.06.049, (2015).
RNA purification kit	Sangon	B511361-0100
Ultrapure water	Sigma-Aldrich	W1503
ZEN Black Software	Carl Zeiss