Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, Barth sendromunun teşhisi için lökosit kardiyolipinin kütle spektrometrik "parmak izinin" nasıl elde edileceğini göstermektedir. Yüksek monolizokardiyolipin-kardiyolipin oranının değerlendirilmesi, Barth sendromlu hastaları %100 duyarlılık ve özgüllüğü olan kontrol kalp yetmezliği hastalarından ayırmaktadır.

Özet

Yapısında dört yağ asidi zinciri taşıyan dimerik bir fosfolipid olan kardiyolipin (CL), mitokondrinin lipit belirtecidir ve burada iç zarın işleyişinde çok önemli bir rol oynar. Metaboliti monolizokardiyolipin (MLCL), hayvan hücrelerinin lipit ekstraktında fizyolojik olarak neredeyse yoktur ve görünümü, bebeklik döneminde ciddi kardiyomiyopatiye neden olan nadir ve sıklıkla yanlış teşhis edilen bir genetik hastalık olan Barth sendromunun (BTHS) ayırt edici özelliğidir. Burada açıklanan yöntem bir "kardiyolipin parmak izi" oluşturur ve hücresel lipit profillerinde CL ve MLCL türlerinin göreceli seviyelerinin basit bir analizine izin verir. Lökositler söz konusu olduğunda, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyonu - uçuş süresi / kütle spektrometrisi ( MALDI-TOF / MS) yoluyla MLCL / CL oranını ölçmek için sadece 1 mL kan gerekir. Tahlil basittir ve BTHS'yi taramak için bir klinik biyokimya laboratuvarının rutin çalışmalarına kolayca entegre edilebilir. Test, BTHS için% 100 duyarlılık ve özgüllük gösterir ve bu da onu uygun bir tanı testi haline getirir.

Giriş

Barth sendromu (BTH), erken başlangıçlı kardiyomiyopati, iskelet kası miyopatisi, büyüme gecikmesi, nötropeni, değişken mitokondriyal solunum zinciri disfonksiyonu ve anormal mitokondriyal yapı 1,2,3,4,5 ile karakterize nadir görülen X'e bağlı bir hastalıktır. BTHS, şu anda dünya çapında bilinen 250'den az vaka ile milyon erkek başına bir vaka prevalansına sahiptir, ancak hastalığın 2,6 tanısının az olduğu yaygın olarak kabul edilmektedir. BTHS, X....

Protokol

Sağlıklı donörlerin ve kalp yetmezliği hastalarının kan örnekleri Bari Poliklinik Hastanesi'nde (İtalya) toplanırken, BTHS hastalarının örnekleri Bristol Royal Çocuk Hastanesi'ndeki (İngiltere) Ulusal Sağlık Hizmeti İngiltere BTHS kliniği tarafından elde edildi. Sağlıklı donörlerin, hastaların ve ebeveynlerin (uygun olduğunda) yazılı bilgilendirilmiş onamları ve ilgili etik kurulların onayları alınmıştır.

NOT: Hemen kullanılmazsa, kan (K-EDTA jel tüpünde) 4 ° C'de 24-48 saate kadar saklanabilir.

1. Kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) dekstran sedimantasyonu ile lökositlerin izolasyonu

  1. Ka....

Sonuçlar

Bu çalışmada, lökositlerin 1 mL tam kandan izole edilmesi ve MALDI-TOF/MS ile CL parmak izinin alınması için basit ve hızlı bir yöntem tanımlanmıştır (bkz. Şekil 2). Şekil 3 , kontrol deneklerinden ve BTHS genç erkeklerinden elde edilen lökositlerin temsili CL parmak izinin CL ve MLCL kütle (m / z) aralığında karşılaştırılmasını göstermektedir. Tablo 1 , bu kütle spektrumlarında tespit edilen CL ve MLCL t.......

Tartışmalar

Barth sendromu, doğuştan gelen bir metabolizma hatası ve 2,6'nın az teşhis edilmesi muhtemel olan yaşamı değiştiren bir durumdur. Daha önce de belirtildiği gibi, katkıda bulunan bir faktör, basit bir tanı testinin olmaması olabilir. Burada, BTHS taraması için lökositlerde MLCL / CL oranını MALDI-TOF / MS ile ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem tanımlanmıştır. Ayrıca, MALDI-TOF kütle spektrometreleri dünya çapında klinik l.......

Açıklamalar

Tüm yazarlar, çalışmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan eder.

Teşekkürler

BTHS'li bireylere ve ailelerine araştırmamıza katıldıkları için minnettarız. Barth Sendromu Vakfı ABD ve Barth Sendromu İngiltere Vakfı'na destekleri ve Bristol'deki yıllık toplantıda kan örneklerinin toplanmasına yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Barth Sendromu Vakfı ABD, Barth Italia Onlus ve Apulia Bölgesi tarafından finanse edilmiştir.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipinAvanti Polar Lipids750332Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipinAvanti Polar Lipids710335Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids878130Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphateAvanti Polar Lipids830845Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)Avanti Polar Lipids840445Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serineAvanti Polar Lipids840033Lipid standard for MALDI-TOF calibration
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5%Merck Life Science S.r.l.190764
9-Aminoacridine hemihydrate, 98%Acros Organics134410010
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5%Merck Life Science S.r.l.360457
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8%Merck Life Science S.r.l.319988
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000Merck Life Science S.r.l.31392
Flex Analysis 3.3Bruker DaltonicsSoftware
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRFBruker Daltonics
Microsoft ExcelMicrosoft OfficeSoftware
OmniPur 10X PBS Liquid ConcentrateMerck Life Science S.r.l.6505-OP
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5%Merck Life Science S.r.l.P3911
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0%Merck Life Science S.r.l.S9888

Referanslar

  1. Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
  2. Steward, C. G., et al.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır