Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Bu protokol, Barth sendromunun teşhisi için lökosit kardiyolipinin kütle spektrometrik "parmak izinin" nasıl elde edileceğini göstermektedir. Yüksek monolizokardiyolipin-kardiyolipin oranının değerlendirilmesi, Barth sendromlu hastaları %100 duyarlılık ve özgüllüğü olan kontrol kalp yetmezliği hastalarından ayırmaktadır.
Yapısında dört yağ asidi zinciri taşıyan dimerik bir fosfolipid olan kardiyolipin (CL), mitokondrinin lipit belirtecidir ve burada iç zarın işleyişinde çok önemli bir rol oynar. Metaboliti monolizokardiyolipin (MLCL), hayvan hücrelerinin lipit ekstraktında fizyolojik olarak neredeyse yoktur ve görünümü, bebeklik döneminde ciddi kardiyomiyopatiye neden olan nadir ve sıklıkla yanlış teşhis edilen bir genetik hastalık olan Barth sendromunun (BTHS) ayırt edici özelliğidir. Burada açıklanan yöntem bir "kardiyolipin parmak izi" oluşturur ve hücresel lipit profillerinde CL ve MLCL türlerinin göreceli seviyelerinin basit bir analizine izin verir. Lökositler söz konusu olduğunda, matris yardımlı lazer desorpsiyon iyonizasyonu - uçuş süresi / kütle spektrometrisi ( MALDI-TOF / MS) yoluyla MLCL / CL oranını ölçmek için sadece 1 mL kan gerekir. Tahlil basittir ve BTHS'yi taramak için bir klinik biyokimya laboratuvarının rutin çalışmalarına kolayca entegre edilebilir. Test, BTHS için% 100 duyarlılık ve özgüllük gösterir ve bu da onu uygun bir tanı testi haline getirir.
Barth sendromu (BTH), erken başlangıçlı kardiyomiyopati, iskelet kası miyopatisi, büyüme gecikmesi, nötropeni, değişken mitokondriyal solunum zinciri disfonksiyonu ve anormal mitokondriyal yapı 1,2,3,4,5 ile karakterize nadir görülen X'e bağlı bir hastalıktır. BTHS, şu anda dünya çapında bilinen 250'den az vaka ile milyon erkek başına bir vaka prevalansına sahiptir, ancak hastalığın 2,6 tanısının az olduğu yaygın olarak kabul edilmektedir. BTHS, X....
Sağlıklı donörlerin ve kalp yetmezliği hastalarının kan örnekleri Bari Poliklinik Hastanesi'nde (İtalya) toplanırken, BTHS hastalarının örnekleri Bristol Royal Çocuk Hastanesi'ndeki (İngiltere) Ulusal Sağlık Hizmeti İngiltere BTHS kliniği tarafından elde edildi. Sağlıklı donörlerin, hastaların ve ebeveynlerin (uygun olduğunda) yazılı bilgilendirilmiş onamları ve ilgili etik kurulların onayları alınmıştır.
NOT: Hemen kullanılmazsa, kan (K-EDTA jel tüpünde) 4 ° C'de 24-48 saate kadar saklanabilir.
1. Kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) dekstran sedimantasyonu ile lökositlerin izolasyonu
Bu çalışmada, lökositlerin 1 mL tam kandan izole edilmesi ve MALDI-TOF/MS ile CL parmak izinin alınması için basit ve hızlı bir yöntem tanımlanmıştır (bkz. Şekil 2). Şekil 3 , kontrol deneklerinden ve BTHS genç erkeklerinden elde edilen lökositlerin temsili CL parmak izinin CL ve MLCL kütle (m / z) aralığında karşılaştırılmasını göstermektedir. Tablo 1 , bu kütle spektrumlarında tespit edilen CL ve MLCL t.......
Barth sendromu, doğuştan gelen bir metabolizma hatası ve 2,6'nın az teşhis edilmesi muhtemel olan yaşamı değiştiren bir durumdur. Daha önce de belirtildiği gibi, katkıda bulunan bir faktör, basit bir tanı testinin olmaması olabilir. Burada, BTHS taraması için lökositlerde MLCL / CL oranını MALDI-TOF / MS ile ölçmek için basit ve hızlı bir yöntem tanımlanmıştır. Ayrıca, MALDI-TOF kütle spektrometreleri dünya çapında klinik l.......
Tüm yazarlar, çalışmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan eder.
BTHS'li bireylere ve ailelerine araştırmamıza katıldıkları için minnettarız. Barth Sendromu Vakfı ABD ve Barth Sendromu İngiltere Vakfı'na destekleri ve Bristol'deki yıllık toplantıda kan örneklerinin toplanmasına yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Barth Sendromu Vakfı ABD, Barth Italia Onlus ve Apulia Bölgesi tarafından finanse edilmiştir.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır