Cardiolipina de impressão digital em leucócitos por espectrometria de massa para um diagnóstico rápido da Síndrome de Barth

Resumo

Este protocolo mostra como obter uma "impressão digital" espectrométrica em massa de cardiolipina leucócito para o diagnóstico da síndrome de Barth. A avaliação da elevada razão monolysocardiolipina para cardiolipina discrimina pacientes com síndrome de Barth do controle de pacientes com 100% de sensibilidade e especificidade.

Resumo

Cardiolipina (CL), um fosfolipídio dimérico que carrega quatro cadeias de ácidos graxos em sua estrutura, é o marcador lipídico das mitocôndrias, onde desempenha um papel crucial no funcionamento da membrana interna. Seu monolitotolácito metabolita (MLCL) é fisiologicamente quase ausente no extrato lipídudo das células animais e sua aparência é a marca registrada da síndrome de Barth (BTHS), uma doença genética rara e muitas vezes mal diagnosticada que causa cardiomiopatia grave na infância. O método descrito aqui gera uma "impressão digital cardiolipina" e permite um simples ensaio dos níveis relativos das espécies cl e MLCL em perfis lipídicos celulares. No caso dos leucócitos, apenas 1 mL de sangue é necessário para medir a razão MLCL/CL através da ionização de desorpção a laser assistida por matriz - espectrometria de tempo de voo/massa (MALDI-TOF/MS) apenas dentro de 2h da retirada de sangue. O ensaio é simples e pode ser facilmente integrado ao trabalho de rotina de um laboratório de bioquímica clínica para triagem de BTHS. O teste mostra 100% de sensibilidade e especificidade para BTHS, tornando-se um teste diagnóstico adequado.

Introdução

A síndrome de Barth (BTHS) é uma doença rara ligada a X caracterizada por cardiomiopatia precoce, miopatia muscular esquelética, atraso no crescimento, neutropenia, disfunção variável da cadeia respiratória mitocondrial e estrutura mitocondrial anormal 1,2,3,4,5. O BTHS tem uma prevalência de um caso por milhão de homens com atualmente menos de 250 casos conhecidos em todo o mundo, embora seja amplamente aceito que a doença seja subdiagnosmada ^2,6. O BTHS resulta de mutações de perda de função do gene Tafazzin (TAFAZZIN) localizado ao cromossomo Xq28.12 ^7,8 causando remodelação deficiente da cardiolipina fosfolipídida mitocondrial (CL), um processo que normalmente leva a uma composição de acilho altamente simétrica e insaturada ^9,10. A CL tem sido considerada a assinatura lipídica das mitocôndrias, onde é um importante constituinte da membrana interna, vital para fosforilação oxidativa (ou seja, metabolismo de energia mitocondrial), formação de supercomplexo, importação de proteínas e envolvido em dinâmica mitocondrial, mitofagia e apoptose 11,12,13,14, ^15,16 . Após a perda de função do TAFAZZIN, falhas de remodelação cl e anormalidades fosfolipíides específicas surgem em mitocôndrias de pacientes com BTHS: o nível de CL maduro (CLm) é diminuído, enquanto ocorrem níveis aumentados de monosocardiolipina (MLCL) e composição acilia alterada da CL (ou seja, espécies cl imaturas, CLi). Isso traz um aumento dramático da relação MLCL/CL¹⁷.

O diagnóstico de BTHS é muitas vezes difícil, pois o transtorno apresenta características clínicas e bioquímicas extremamente variáveis e pode diferir entre indivíduos afetados da mesma família e dentro de um paciente ao longo do tempo ^3,5. Muitos meninos BTHS mostram um nível muito alto de excreção urinária de ácido 3-metilglutrónico (3-MGCA), mas o nível de urina pode ser normal ou apenas levemente aumentado em pacientes ao longo do tempo³. No entanto, o aumento do 3-MGCA é uma característica de vários outros distúrbios mitocondriais e não mitocondriais, como deficiência de hidratação 3-metilglutaconyl-CoA (defeito de AUH), aciduria 3-metilglutacónica, dystonia-surdez, encefalopatia, síndrome de Leigh-like (MEGDEL), síndrome de Costeff e cardiomiopatia dilatada com síndrome de ataxia (DCMA)^18,19 . Assim, a baixa especificidade do 3-MCGA como marcador para o BTHS e a enorme variabilidade nos pacientes tornam ambíguo o diagnóstico bioquímico.

Além disso, mais de 120 mutações diferentes de TAFAZZIN foram descritas causando o transtorno⁵ e, portanto, um diagnóstico genético pode ser complicado, lento e caro. Além disso, a análise molecular do gene TAFAZZIN pode levar a resultados falso-negativos na presença de mutações em sequências não codificadoras ou reguladoras³. O BTHS pode ser inequivocamente testado determinando as quantidades relativas e distribuição de espécies (monolyso-)CL e confirmado pelo sequenciamento genético TAFAZZIN ou vice-versa.

Um teste prático para diagnóstico é a medição da razão MLCL/CL por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) e Análise de Ionização de Spray Eletro / Espectrometria de Massa (ESI/MS) na mancha de sangue^20,21. A medição do nível de CL por si só não é adequada para o diagnóstico, pois alguns pacientes têm níveis quase normais de CL, mas alteraram a razão MLCL/CL. Portanto, a medição da razão MLCL/CL tem 100% de sensibilidade e especificidade para o diagnóstico de BTHS²¹. Outro método validado baseado na análise do HPLC e do ESI/MS foi criado nos leucócitos²², mas as complexas técnicas cromatográficas para separação de lipídios previamente extraídos e a disquete dos instrumentos restringem essa análise a alguns laboratórios clínicos. Todos esses fatores, juntamente com a falta de um teste diagnóstico simples, contribuíram para o subdiagnóstico da condição.

MALDI-TOF/MS é uma ferramenta mais válida na análise lipídica^23,24. Esta técnica analítica pode ser utilizada para obter diretamente perfis lipídes de várias amostras biológicas, pulando assim as etapas de extração e separação ^{25,26,27,28,29}, inclusive em seções de tecido para aplicações ^{de imagem em MS 30}. Dada essa vantagem, foi desenvolvido^um método simples e rápido para diagnosticar BTHS por meio de perfil de CL mitocondrial em leucócitos intactos com MALDI-TOF/MS. O isolamento leucócito de apenas 1 mL de sangue inteiro por sedimentação eritrócito é simples e não requer equipamentos especiais ou reagentes. Além disso, um protocolo rápido de "mini-extração" lipídide aplicável a quantidades minúsculas de leucócitos foi descrito para justificar a aquisição bem sucedida de espectros com sinais de MS mais limpos com uma maior relação sinal-ruído (S/N) do que naqueles obtidos de leucócitos intactos²⁸. Este passo adicional leva pouco tempo e permite que as análises sejam reprodutíveis mesmo quando realizadas em instrumentos de ESM com baixa sensibilidade. Em resumo, o método analítico aqui descrito requer uma preparação mínima da amostra, pois a separação cromatográfica cromatgráfica demorada e intensiva em mão-de-obra pode ser ignorada, acelerando assim o teste.

Protocolo

Amostras de sangue de doadores saudáveis e pacientes com insuficiência cardíaca foram coletadas no Hospital Policlínica de Bari (Itália), enquanto amostras de pacientes com BTHS foram obtidas pela clínica BTHS do National Health Service UK no Bristol Royal Hospital for Children (Reino Unido). Foram obtidos consentimentos por escrito de doadores, pacientes e pais saudáveis (quando apropriado) e aprovações pelos respectivos comitês de ética.

NOTA: Se não for usado imediatamente, o sangue (no tubo de gel K-EDTA) pode ser armazenado a 4 °C por até 24-48 h.

1. Isolamento de leucócitos por sedimentação dextran de glóbulos vermelhos (RBCs)

1. Coloque amostras de sangue (em K-EDTA) em um agitador orbital por 10 minutos para misturar sangue.
2. A 0,9 mL de sangue inteiro em um tubo de 1,5 mL, adicione 0,1 mL de solução dextran de 20% (massa molecular > 100 kDa, em 0,9% NaCl). Pipeta e disperse a suspensão suavemente 20 vezes, evitando bolhas de ar que de outra forma manteriam RBCs na parte superior do tubo. Deixe os RBCs sedimentarem por cerca de 1h à temperatura ambiente.
3. Usando uma seringa, colete e transfira o supernanato amarelo para um tubo de 15 mL e, em seguida, centrífuga a 400 x g por 15 min à temperatura ambiente (sem freio, rotor de balde de balanço).
4. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota contendo principalmente leucócitos e RBCs residuais em 0,6 mL de água bi-destilada gelada (ddH₂O).
5. Após ~15 s, adicione 0,2 mL de 0,6 M KCl à suspensão da célula para restaurar a osmolaridade correta. O curto choque osmótico vai lise RBC e deixar leucócitos intactos. Ajuste o volume final para 2,5 mL com PBS 1x.
6. Centrifugar a suspensão a 400 x g por 15 min a temperatura ambiente (sem freio, rotor de balde de balanço). Descarte o supernatante e lave a pelota de leucócito novamente com 2,5 mL de 1x PBS.
7. Centrifugar como na etapa 1.6 e descartar o supernatante. Resuspend a pelota contendo leucócitos em 200 μL de ddH₂O esterilizado.
   NOTA: Na experiência dos autores, isso corresponde a um teor proteico que varia de 200 μg a 400 μg.
8. Congele a suspensão a -80 °C ou realize diretamente a extração lipídica da seguinte forma.

2. "Mini-extração" de lipídios de leucócitos isolados

1. Transfira 20 μL de suspensão de leucócitos (cerca de 20-40 μg de proteínas) para um tubo de 1,5 mL e gire a 16.000 x g para 30 s.
2. Descarte o supernasce, adicione 10 μL de CHCl₃ à pelota restante e pipeta repetidamente para promover a extração lipídica.
3. Por fim, adicione 10 μL de solução matricial 9-aminoacridina (9-AA) (10 mg/mL 9-AA em 2-propanol/acetonitrilo, 60:40 v/v) à pelota em CHCl₃. Pipeta e dispersar repetidamente para misturar.
4. Gire a solução contendo lipídios em CHCl₃ e 9-AA a 16.000 x g para 30 s e, em seguida, deposite o supernatante como gotículas de 0,35 μL (três réplicas para cada amostra) no alvo MALDI (placa amostral) a ser analisado (método de deposição 'gotícula seca').
5. Deixe as gotículas secarem pelo menos por 10-15 min.

3. Análise lipídica por MALDI-TOF/MS

1. Adquira espectros de massa de amostras em triplicados em um espectrômetro de massa MALDI-TOF.
2. Após a calibração com padrões lipídes (ver Tabela de Materiais), defina as análises no modo íon negativo e otimize a faixa de detecção m/z de 200 de dezembro a 2.000 th para análise de pequenas moléculas.
3. Mantenha a fluência de laser 5% acima do limiar (de CL e MLCL) para ter um S/N (pelo menos 2).
4. Adquira espectros no modo refletor usando extração pulsada atrasada. Para cada espectro de massa, em média 2.000 tiros a laser únicos (soma de 4 x 500). Aplique supressão de matriz fechada em 400 de dezembro para evitar a saturação do detector.

4. Como calcular a razão (MLCL + CLi)/CLm

1. Execute o software de instrumentos MALDI-TOF/MS (ver Tabela de Materiais) para analisar o espectro adquirido.
2. Usando o comando Abrir , abra a caixa de diálogo do Navegador de Espectro que permite selecionar e carregar o espectro de interesse.
3. Na barra de menu, clique nos ícones Smooth Mass Spectrum e Subtract Mass Spectrum Baseline.
4. Clique em Arquivo > Export > Mass Spectrum e escolha o formato ASCII para exportar o espectro como uma tabela de duas colunas com pares de pontos de dados: m/z (x) e intensidade (y). Copie e cole as coordenadas em um programa de planilha (*.xls).
5. Repetir as etapas 4.2 a 4.4 para os triplicados de cada amostra analisada, colando as coordenadas no mesmo arquivo do programa de planilhas mostrado na Figura 1 (Etapa 1).
6. Seguindo as faixas x mostradas na Figura 1 (Etapa 2) para cada espécie listada, calcule a soma de y₁, y₂ e y₃ valores (triplicados) pela função SUM para obter a área de pico (Figura 1; Passo 3).
7. Realizar a média dos valores da área de triplicados por função MÉDIA (Figura 1; Passo 3).
8. Coloque os valores médios da área para cada espécie na coluna, conforme mostrado na Figura 1 (Passo 2).
9. A fim de considerar apenas o primeiro isotopologue da espécie CLm 72:7 como em²⁸, calcule a correção isotópica para a sobreposição entre o isotopologue M + 2 do CLm 72:8 e o pico monoisotópico de CLm 72:7 como mostrado na Figura 1 (Passo 4).
10. Por fim, calcule a razão (MLCL + CLi)/CLm como mostrado na Figura 1 (Passo 5).

Resultados

Neste estudo, foi descrito um método simples e rápido para isolar leucócitos a partir de 1 mL de sangue inteiro e obter impressões digitais cl por MALDI-TOF/MS (ver Figura 2). A Figura 3 mostra a comparação da impressão digital cl representativa dos leucócitos, obtidas de sujeitos de controle e meninos BTHS, na faixa de massa CL e MLCL (m/z). A Tabela 1 lista as espécies CL e MLCL detectadas nestes espectros de massa.

Discussão

A síndrome de Barth é um erro inato do metabolismo e uma condição que muda a vida que provavelmente será subdiagnosticada ^{2,6. Como mencionado anteriormente, um fator contribuinte pode ser a falta de um teste diagnóstico simples. Aqui, foi descrito um método simples e rápido para medir a razão MLCL/CL por MALDI-TOF/MS em leucócitos para triagem BTHS. Além disso, os espectrômetros de massa MALDI-TOF são amplamente distribuídos entre laboratório...}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin	Avanti Polar Lipids	750332	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin	Avanti Polar Lipids	710335	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	878130	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate	Avanti Polar Lipids	830845	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)	Avanti Polar Lipids	840445	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids	840033	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	190764
9-Aminoacridine hemihydrate, 98%	Acros Organics	134410010
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	360457
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8%	Merck Life Science S.r.l.	319988
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000	Merck Life Science S.r.l.	31392
Flex Analysis 3.3	Bruker Daltonics		Software
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF	Bruker Daltonics
Microsoft Excel	Microsoft Office		Software
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate	Merck Life Science S.r.l.	6505-OP
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5%	Merck Life Science S.r.l.	P3911
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0%	Merck Life Science S.r.l.	S9888