Prise d’empreintes digitales de la cardiolipine dans les leucocytes par spectrométrie de masse pour un diagnostic rapide du syndrome de Barth

Résumé

Ce protocole montre comment obtenir une « empreinte » spectrométrique de masse de la cardiolipine leucocytaire pour le diagnostic du syndrome de Barth. L’évaluation du rapport élevé entre la monolysocardiolipine et la cardiolipine distingue les patients atteints du syndrome de Barth des patients témoins atteints d’insuffisance cardiaque avec une sensibilité et une spécificité de 100%.

Résumé

La cardiolipine (CL), un phospholipide dimérique portant quatre chaînes d’acides gras dans sa structure, est le marqueur lipidique des mitochondries, dans lequel elle joue un rôle crucial dans le fonctionnement de la membrane interne. Son métabolite monolysocardiolipine (MLCL) est physiologiquement presque absent dans l’extrait lipidique des cellules animales et son apparition est la marque du syndrome de Barth (BTHS), une maladie génétique rare et souvent mal diagnostiquée qui provoque une cardiomyopathie sévère dans la petite enfance. La méthode décrite ici génère une « empreinte cardiolipine » et permet un dosage simple des niveaux relatifs des espèces CL et MLCL dans les profils lipidiques cellulaires. Dans le cas des leucocytes, seulement 1 mL de sang est nécessaire pour mesurer le rapport MLCL/CL via l’ionisation de désorption laser assistée par matrice - spectrométrie temps de vol/spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS) juste à moins de 2 h du prélèvement sanguin. Le test est simple et peut être facilement intégré dans le travail de routine d’un laboratoire de biochimie clinique pour dépister le BTHS. Le test montre une sensibilité et une spécificité de 100% pour le BTHS, ce qui en fait un test de diagnostic approprié.

Introduction

Le syndrome de Barth (BTHS) est une maladie rare liée à l’X caractérisée par une cardiomyopathie précoce, une myopathie musculaire squelettique, un retard de croissance, une neutropénie, un dysfonctionnement variable de la chaîne respiratoire mitochondriale et une structure mitochondriale anormale 1,2,3,4,5. BTHS a une prévalence d’un cas par million d’hommes avec actuellement moins de 250 cas connus dans le monde, bien qu’il soit largement admis que la maladie est ^{sous-diagnostiquée 2,6}. BTHS résulte de mutations de perte de fonction du gène Tafazzin (TAFAZZIN) localisé sur le chromosome Xq28.12 ^7,8 provoquant un remodelage déficient de la cardiolipine phospholipide mitochondriale (CL), un processus qui conduit normalement à une composition acyle hautement symétrique et insaturée ^9,10. Cl a été considéré comme le lipide signature des mitochondries, où il est un constituant important de la membrane interne, vital pour la phosphorylation oxydative (c’est-à-dire le métabolisme énergétique mitochondrial), la formation supercomplexe, l’importation de protéines et impliqué dans la dynamique mitochondriale, la mitophagie et l’apoptose 11,12,13,14,15,16 . Lors de la perte de fonction de TAFAZZIN, le remodelage de la CL échoue et des anomalies phospholipidiques spécifiques apparaissent dans les mitochondries des patients BTHS: le niveau de CL mature (CLm) est diminué, tandis que des niveaux accrus de monolysocardiolipine (MLCL) et une composition altérée de CL acyl (c’est-à-dire des espèces cl immatures, CLi) se produisent. Cela entraîne une augmentation spectaculaire du ratio MLCL/CL¹⁷.

Le diagnostic de BTHS est souvent difficile, car le trouble présente des caractéristiques cliniques et biochimiques extrêmement variables et peut différer entre les personnes touchées de la même famille et au sein d’un patient au fil du temps ^3,5. De nombreux garçons BTHS montrent un niveau très élevé d’excrétion urinaire de l’acide 3-méthylglutaconique (3-MGCA), mais le niveau d’urine peut être normal ou seulement légèrement augmenté chez les patients au cours du temps³. Cependant, l’augmentation de la 3-MGCA est une caractéristique de divers autres troubles mitochondriaux et non mitochondriaux, tels que le déficit en 3-méthylglutaconyl-CoA hydratase (défaut AUH), l’acidurie 3-méthylglutaconique, la dystonie-surdité, l’encéphalopathie, le syndrome de Leigh-like (MEGDEL), le syndrome de Costeff et la cardiomyopathie dilatée avec syndrome d’ataxie (DCMA)^18,19 . Par conséquent, la faible spécificité du 3-MCGA en tant que marqueur du BTHS et l’énorme variabilité chez les patients rendent le diagnostic biochimique ambigu.

De plus, plus de 120 mutations différentes de TAFAZZIN ont été décrites à l’origine du trouble⁵ et, par conséquent, un diagnostic génétique peut être compliqué, lent et coûteux. De plus, l’analyse moléculaire du gène TAFAZZIN peut conduire à des résultats faussement négatifs en présence de mutations dans des séquences non codantes ou régulatrices³. Le BTHS peut être testé sans ambiguïté en déterminant les quantités relatives et la distribution des espèces de (monolyso-)CL et confirmé par le séquençage du gène TAFAZZIN ou vice versa.

Un test pratique pour le diagnostic est la mesure du rapport MLCL / CL par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et électro-pulvérisation ionisation / spectrométrie de masse (ESI / MS) analyse dans la tache de sang ^20,21. La mesure du niveau de CL seul n’est pas adéquate pour le diagnostic car certains patients ont des niveaux presque normaux de CL mais un rapport MLCL / CL modifié. Par conséquent, la mesure du rapport MLCL/CL a une sensibilité et une spécificité de 100% pour le diagnostic BTHS²¹. Une autre méthode validée basée sur l’analyse HPLC et ESI/MS a été mise en place sur les leucocytes²², mais les techniques chromatographiques complexes de séparation des lipides précédemment extraits et le coût des instruments limitent cette analyse à quelques laboratoires cliniques. Tous ces facteurs, ainsi que l’absence d’un test de diagnostic simple, ont contribué au sous-diagnostic de la maladie.

MALDI-TOF/MS est un autre outil valable dans l’analyse des lipides^23,24. Cette technique analytique peut être utilisée pour obtenir directement les profils lipidiques de divers échantillons biologiques, sautant ainsi les étapes d’extraction et de séparation 25,26,27,28,29, y compris dans les coupes de tissus pour les applications d’imagerie MS ³⁰. Compte tenu de cet avantage, une méthode simple et rapide de diagnostic du BTHS par profilage de la CL mitochondriale dans des leucocytes intacts avec MALDI-TOF/MS a été développée²⁸. L’isolement des leucocytes à partir de seulement 1 mL de sang total par sédimentation érythrocytaire et lyse est simple et ne nécessite pas d’équipement ou de réactifs spéciaux. De plus, un protocole de « mini-extraction » rapide des lipides applicable à des quantités infimes de leucocytes a été décrit comme justifiant l’acquisition réussie de spectres ayant des signaux MS plus propres avec un rapport signal/bruit (S/N) plus élevé que dans ceux obtenus à partir de leucocytes intacts²⁸. Cette étape supplémentaire prend peu de temps et permet aux analyses d’être reproductibles même lorsqu’elles sont effectuées sur des instruments MS peu sensibles. En résumé, la méthode d’analyse décrite ici nécessite une préparation minimale de l’échantillon, car la séparation chromatographique des lipides, longue et laborieuse, peut être ignorée, accélérant ainsi le test.

Protocole

Des échantillons de sang de donneurs sains et de patients atteints d’insuffisance cardiaque ont été prélevés à l’hôpital policlinique de Bari (Italie), tandis que des échantillons de patients BTHS ont été prélevés par la clinique BTHS du National Health Service UK au Bristol Royal Hospital for Children (Royaume-Uni). Le consentement éclairé écrit des donneurs, des patients et des parents en bonne santé (le cas échéant) et les approbations des comités d’éthique respectifs ont été obtenus.

REMARQUE: S’il n’est pas utilisé immédiatement, le sang (dans un tube de gel K-EDTA) peut être conservé à 4 ° C jusqu’à 24-48 h.

1. Isolement des leucocytes par sédimentation dextran des globules rouges (GR)

1. Mettre des échantillons de sang (en K-EDTA) sur un agitateur orbital pendant 10 minutes pour mélanger le sang.
2. À 0,9 mL de sang total dans un tube de 1,5 mL, ajouter 0,1 mL de solution de dextran à 20 % (masse moléculaire > 100 kDa, dans du NaCl à 0,9 %). Pipettez et dispersez doucement la suspension 20 fois tout en évitant les bulles d’air qui, autrement, retiendraient les globules rouges au sommet du tube. Laisser les globules rouges sédimenter pendant environ 1 h à température ambiante.
3. À l’aide d’une seringue, prélever et transférer le surnageant jaune dans un tube de 15 mL, puis centrifuger à 400 x g pendant 15 min à température ambiante (pas de frein, rotor à godet oscillant).
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille contenant principalement des leucocytes et des globules rouges résiduels dans 0,6 mL d’eau bidividée glacée (ddH₂O).
5. Après ~15 s, ajouter 0,2 mL de 0,6 M KCl à la suspension cellulaire pour restaurer l’osmolarité correcte. Le court choc osmotique va lyser les globules rouges et laisser les leucocytes intacts. Réglez le volume final à 2,5 mL avec 1x PBS.
6. Centrifuger la suspension à 400 x g pendant 15 min à température ambiante (pas de frein, rotor à godet oscillant). Jetez le surnageant et lavez à nouveau la pastille de leucocyte avec 2,5 mL de 1x PBS.
7. Centrifuger comme à l’étape 1.6 et jeter le surnageant. Remettre en suspension la pastille contenant des leucocytes dans 200 μL de ddH₂O stérilisé.
   NOTE: Dans l’expérience des auteurs, cela correspond à une teneur en protéines allant de 200 μg à 400 μg.
8. Congelez la suspension à -80 °C ou effectuez directement l’extraction des lipides comme suit.

2. " Mini-extraction " des lipides à partir de leucocytes isolés

1. Transférer 20 μL de suspension de leucocytes (environ 20 à 40 μg de protéines) dans un tube de 1,5 mL et tourner à 16 000 x g pendant 30 s.
2. Jeter le surnageant, ajouter 10 μL de CHCl₃ à la pastille restante et pipeter à plusieurs reprises pour favoriser l’extraction des lipides.
3. Enfin, ajouter 10 μL de solution matricielle de 9-aminoacridine (9-AA) (10 mg/mL 9-AA dans du 2-propanol/acétonitrile, 60:40 v/v) à la pastille dans CHCl₃. Pipette et dispersion répétée pour mélanger.
4. Faire tourner la solution contenant des lipides dans CHCl₃ et 9-AA à 16 000 x g pendant 30 s, puis déposer le surnageant sous forme de gouttelettes de 0,35 μL (trois répliques pour chaque échantillon) sur la cible MALDI (plaque d’échantillonnage) à analyser (méthode de dépôt de gouttelettes séchées).
5. Laissez sécher les gouttelettes à l’air libre au moins pendant 10-15 min.

3. Analyse lipidique par MALDI-TOF/MS

1. Acquérir les spectres de masse d’échantillons en triples sur un spectromètre de masse MALDI-TOF.
2. Après étalonnage avec des étalons lipidiques (voir Tableau des matériaux), réglez les analyses en mode ions négatifs et optimisez la plage de détection m/z de 200 Th à 2 000 Th pour l’analyse de petites molécules.
3. Gardez la fluence laser 5% au-dessus du seuil (de CL et MLCL) pour avoir un S / N (au moins 2).
4. Acquérir des spectres en mode réflecteur en utilisant l’extraction pulsée retardée. Pour chaque spectre de masse, en moyenne 2 000 prises de vue laser simples (somme de 4 x 500). Appliquez la suppression de matrice fermée à 400 Th pour éviter la saturation du détecteur.

4. Comment calculer le rapport (MLCL + CLi)/CLm

1. Exécutez le logiciel d’instrument MALDI-TOF/MS (voir Tableau des matériaux) pour analyser les spectres acquis.
2. À l’aide de la commande Ouvrir , ouvrez la boîte de dialogue Navigateur de spectre qui permet de sélectionner et de charger le spectre d’intérêt.
3. Dans la barre de menus, cliquez sur les icônes Smooth Mass Spectrum et Subtract Mass Spectrum Baseline.
4. Cliquez sur File > Export > Mass Spectrum et choisissez le format ASCII pour exporter le spectre sous la forme d’un tableau à deux colonnes avec des paires de points de données: m / z (x) et intensité (y). Copiez et collez les coordonnées dans un tableur (*.xls).
5. Répétez les étapes 4.2 à 4.4 pour les trois exemplaires de chaque échantillon analysé, en collant les coordonnées dans le même fichier de tableur comme illustré à la figure 1 (étape 1).
6. En suivant les plages x illustrées à la figure 1 (étape 2) pour chaque espèce répertoriée, calculez la somme des valeurs y₁, y₂ et y₃ (triplicates) par la fonction SUM pour obtenir la zone de crête (Figure 1; Étape 3).
7. Effectuer la moyenne des valeurs de surface des triples par fonction MOYENNE (Figure 1; Étape 3).
8. Placez les valeurs moyennes de la superficie pour chaque espèce dans la colonne comme illustré à la figure 1 (étape 2).
9. Afin de ne considérer que le premier isotopologue de l’espèce CLm 72:7 comme dans²⁸, calculer la correction isotopique pour le chevauchement entre l’isotopologue M + 2 du CLm 72:8 et le pic monoisotopique de CLm 72:7 comme le montre la figure 1 (étape 4).
10. Enfin, calculez le rapport (MLCL + CLi)/CLm comme illustré à la figure 1 (étape 5).

Résultats

Dans cette étude, une méthode simple et rapide pour isoler les leucocytes de 1 mL de sang total et obtenir l’empreinte CL par MALDI-TOF/MS a été décrite (voir la figure 2). La figure 3 montre la comparaison des empreintes CL représentatives des leucocytes, obtenues chez des sujets témoins et de jeunes garçons BTHS, dans la gamme de masse CL et MLCL (m / z). Le tableau 1 énumère les espèces CL et MLCL détectées dans ces sp...

Discussion

Le syndrome de Barth est une erreur innée du métabolisme et une condition qui change la vie et qui est susceptible d’être sous-diagnostiquée ^{2,6. Comme mentionné précédemment, un facteur contributif peut être l’absence d’un test de diagnostic simple. Ici, une méthode simple et rapide pour mesurer le rapport MLCL/CL par MALDI-TOF/MS dans les leucocytes pour le dépistage du BTHS a été décrite. De plus, les spectromètres de masse MALDI-TOF s...}

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin	Avanti Polar Lipids	750332	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin	Avanti Polar Lipids	710335	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	878130	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate	Avanti Polar Lipids	830845	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)	Avanti Polar Lipids	840445	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids	840033	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	190764
9-Aminoacridine hemihydrate, 98%	Acros Organics	134410010
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	360457
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8%	Merck Life Science S.r.l.	319988
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000	Merck Life Science S.r.l.	31392
Flex Analysis 3.3	Bruker Daltonics		Software
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF	Bruker Daltonics
Microsoft Excel	Microsoft Office		Software
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate	Merck Life Science S.r.l.	6505-OP
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5%	Merck Life Science S.r.l.	P3911
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0%	Merck Life Science S.r.l.	S9888