Fingerprinting Cardiolipin nei leucociti mediante spettrometria di massa per una diagnosi rapida della sindrome di Barth

Riepilogo

Questo protocollo mostra come ottenere una "impronta digitale" spettrometrica di massa della cardiolipina leucocitaria per la diagnosi della sindrome di Barth. La valutazione dell'elevato rapporto tra monolisocardiolipina e cardiolipina discrimina i pazienti con sindrome di Barth dai pazienti con insufficienza cardiaca di controllo con sensibilità e specificità al 100%.

Abstract

La cardiolipina (CL), un fosfolipide dimerico che trasporta quattro catene di acidi grassi nella sua struttura, è il marcatore lipidico dei mitocondri, in cui svolge un ruolo cruciale nel funzionamento della membrana interna. Il suo metabolita monolysocardiolipin (MLCL) è fisiologicamente quasi assente nell'estratto lipidico delle cellule animali e il suo aspetto è il segno distintivo della sindrome di Barth (BTHS), una malattia genetica rara e spesso mal diagnosticata che causa una grave cardiomiopatia nell'infanzia. Il metodo qui descritto genera una "impronta digitale cardiolipina" e consente un semplice dosaggio dei livelli relativi delle specie CL e MLCL nei profili lipidici cellulari. Nel caso dei leucociti, è necessario solo 1 mL di sangue per misurare il rapporto MLCL/CL tramite ionizzazione laser di desorbimento assistita da matrice - tempo di volo/spettrometria di massa (MALDI-TOF/MS) entro appena 2 ore dal prelievo di sangue. Il test è semplice e può essere facilmente integrato nel lavoro di routine di un laboratorio di biochimica clinica per lo screening per BTHS. Il test mostra una sensibilità e una specificità al 100% per BTHS, rendendolo un test diagnostico adatto.

Introduzione

La sindrome di Barth (BTHS) è una rara malattia legata all'X caratterizzata da cardiomiopatia ad esordio precoce, miopatia del muscolo scheletrico, ritardo della crescita, neutropenia, disfunzione variabile della catena respiratoria mitocondriale e struttura mitocondriale anormale 1,2,3,4,5. BTHS ha una prevalenza di un caso per milione di maschi con attualmente meno di 250 casi noti in tutto il mondo, anche se è ampiamente accettato che la malattia è sottodiagnosticata ^2,6. BTHS deriva da mutazioni per perdita di funzione del gene Tafazzin (TAFAZZIN) localizzate sul cromosoma Xq28.12 ^7,8 che causano un rimodellamento carente della cardiolipina fosfolipidica mitocondriale (CL), un processo che normalmente porta ad una composizione acilica altamente simmetrica e insatura ^9,10. La CL è stata considerata il lipide caratteristico dei mitocondri, dove è un importante costituente della membrana interna, vitale per la fosforilazione ossidativa (cioè il metabolismo energetico mitocondriale), la formazione di supercomplessi, l'importazione di proteine e coinvolto nella dinamica mitocondriale, nella mitofagia e nell'apoptosi 11,12,13,14,15,16 . In caso di perdita di funzione di TAFAZZIN, il rimodellamento della CL fallisce e si verificano anomalie specifiche dei fosfolipidi nei mitocondri dei pazienti con BTHS: il livello di CL maturo (CLm) è diminuito, mentre si verificano livelli aumentati di monolisocardiolipina (MLCL) e composizione acilica CL alterata (cioè specie di CL immature, CLi). Ciò comporta un drammatico aumento del rapporto MLCL/CL¹⁷.

La diagnosi di BTHS è spesso difficile, in quanto il disturbo presenta caratteristiche cliniche e biochimiche estremamente variabili e può differire tra gli individui affetti della stessa famiglia e all'interno di un paziente nel tempo ^3,5. Molti ragazzi BTHS mostrano un livello molto elevato di escrezione urinaria di acido 3-metilglutaconico (3-MGCA), ma il livello delle urine può essere normale o solo lievemente aumentato nei pazienti nel tempo³. Tuttavia, l'aumento della 3-MGCA è una caratteristica di vari altri disturbi mitocondriali e non mitocondriali, come il deficit di idratasi 3-metilglutaconil-CoA (difetto AUH), aciduria 3-metilglutaconica, distonia-sordità, encefalopatia, sindrome di Leigh-like (MEGDEL), sindrome di Costeff e cardiomiopatia dilatativa con atassia (DCMA)^{sindrome 18,19} . Quindi, la scarsa specificità del 3-MCGA come marcatore per BTHS e l'enorme variabilità nei pazienti rendono ambigua la diagnosi biochimica.

Inoltre, sono state descritte oltre 120 diverse mutazioni di TAFAZZIN che causano il disturbo⁵ e, pertanto, una diagnosi genetica può essere complicata, lenta e costosa. Inoltre, l'analisi molecolare del gene TAFAZZIN può portare a risultati falsi negativi in presenza di mutazioni in sequenze non codificanti o regolatrici³. I BTHS possono essere testati in modo inequivocabile determinando le quantità relative e la distribuzione delle specie (monolyso-)CL e confermati dal sequenziamento del gene TAFAZZIN o viceversa.

Un test pratico per la diagnosi è la misurazione del rapporto MLCL/CL mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e ionizzazione elettro-spray / spettrometria di massa (ESI/MS) nella macchia ematica^20,21. La misurazione del livello di CL da sola non è adeguata per la diagnosi in quanto alcuni pazienti hanno livelli quasi normali di CL ma un rapporto MLCL/CL alterato. Pertanto, la misurazione del rapporto MLCL/CL ha una sensibilità e una specificità del 100% per la diagnosi di BTHS²¹. Un altro metodo validato basato sull'analisi HPLC ed ESI/MS è stato messo a punto sui leucociti²², ma le complesse tecniche cromatografiche per la separazione dei lipidi precedentemente estratti e la costosità degli strumenti limitano questa analisi a pochi laboratori clinici. Tutti questi fattori, insieme alla mancanza di un test diagnostico diretto, hanno contribuito alla sottodiagnosi della condizione.

MALDI-TOF/MS è un ulteriore valido strumento nell'analisi lipidica^23,24. Questa tecnica analitica può essere utilizzata per ottenere direttamente profili lipidici di vari campioni biologici, saltando così le fasi di estrazione e separazione 25,26,27,28,29, anche nelle sezioni tissutali per applicazioni di MS Imaging³⁰. Dato questo vantaggio, è stato sviluppato un metodo semplice e veloce per diagnosticare la BTHS profilando la CL mitocondriale nei leucociti intatti con MALDI-TOF/MS²⁸. L'isolamento dei leucociti da solo 1 mL di sangue intero mediante eritrosedimentazione e lisi è semplice e non richiede attrezzature o reagenti speciali. Inoltre, è stato descritto un protocollo di "mini-estrazione" lipidica veloce applicabile a piccole quantità di leucociti per garantire il successo dell'acquisizione di spettri con segnali MS più puliti con un rapporto segnale-rumore (S / N) più elevato rispetto a quelli ottenuti da leucociti intatti²⁸. Questo ulteriore passo richiede poco tempo e consente di riprodurre le analisi anche se eseguite su strumenti MS con scarsa sensibilità. In sintesi, il metodo analitico qui descritto richiede una preparazione minima del campione perché la separazione dei lipidi cromatografici dispendiosa in termini di tempo e laboriosa può essere saltata, accelerando così il test.

Protocollo

Campioni di sangue di donatori sani e pazienti con insufficienza cardiaca sono stati raccolti presso l'Ospedale Policlinico di Bari (Italia), mentre campioni di pazienti BTHS sono stati ottenuti dalla clinica BTHS del Servizio Sanitario Nazionale del Regno Unito presso il Bristol Royal Hospital for Children (Regno Unito). Sono stati ottenuti il consenso informato scritto di donatori, pazienti e genitori sani (se del caso) e le approvazioni dei rispettivi comitati etici.

NOTA: Se non utilizzato immediatamente, il sangue (in tubo gel K-EDTA) può essere conservato a 4 °C per un massimo di 24-48 ore.

1. Isolamento dei leucociti mediante sedimentazione destrana dei globuli rossi (RBC)

1. Mettere campioni di sangue (in K-EDTA) su uno shaker orbitale per 10 minuti per mescolare il sangue.
2. A 0,9 mL di sangue intero in un tubo da 1,5 mL, aggiungere 0,1 mL di soluzione di destrano al 20% (massa molecolare > 100 kDa, in NaCl allo 0,9%). Pipettare e disperdere delicatamente la sospensione 20 volte evitando bolle d'aria che altrimenti manterrebbero i globuli rossi nella parte superiore del tubo. Lasciare sedimentare i globuli rossi per circa 1 ora a temperatura ambiente.
3. Usando una siringa, raccogliere e trasferire il surnatante giallo in un tubo da 15 ml, quindi centrifugare a 400 x g per 15 minuti a temperatura ambiente (senza freno, rotore a benna oscillante).
4. Scartare il surnatante e risospesere il pellet contenente principalmente leucociti e globuli rossi residui in 0,6 mL di acqua bi-distillata ghiacciata (ddH₂O).
5. Dopo ~ 15 s, aggiungere 0,2 mL di 0,6 M KCl alla sospensione cellulare per ripristinare la corretta osmolarità. Il breve shock osmotico farà lisare i globuli rossi e lascerà intatti i leucociti. Regolare il volume finale a 2,5 ml con 1x PBS.
6. Centrifugare la sospensione a 400 x g per 15 minuti a temperatura ambiente (senza freno, rotore a benna oscillante). Scartare il surnatante e lavare nuovamente il pellet leucocitario con 2,5 ml di 1x PBS.
7. Centrifugare come al punto 1.6 ed scartare il surnatante. Risospesso il pellet contenente leucociti in 200 μL di ddH₂O sterilizzato.
   NOTA: Nell'esperienza degli autori, questo corrisponde a un contenuto proteico che va da 200 μg a 400 μg.
8. Congelare la sospensione a -80 °C o eseguire direttamente l'estrazione lipidica come segue.

2. "Mini-estrazione" di lipidi da leucociti isolati

1. Trasferire 20 μL di sospensione leucocitaria (circa 20-40 μg di proteine) in un tubo da 1,5 ml e ruotare a 16.000 x g per 30 s.
2. Scartare il surnatante, aggiungere 10 μL di CHCl₃ al pellet rimanente e pipettare ripetutamente per promuovere l'estrazione dei lipidi.
3. Infine, aggiungere 10 μL di soluzione di matrice di 9-aminoacridina (9-AA) (10 mg/mL 9-AA in 2-propanolo/acetonitrile, 60:40 v/v) al pellet in CHCl₃. Pipettare e disperdere ripetutamente per mescolare.
4. Far girare la soluzione contenente lipidi in CHCl₃ e 9-AA a 16.000 x g per 30 s, quindi depositare il surnatante come goccioline da 0,35 μL (tre repliche per ciascun campione) sul bersaglio MALDI (piastra campione) da analizzare (metodo di deposizione di goccioline essiccate).
5. Lasciare asciugare le goccioline all'aria almeno per 10-15 min.

3. Analisi lipidica di MALDI-TOF/MS

1. Acquisire spettri di massa di campioni in triplicati su uno spettrometro di massa MALDI-TOF.
2. Dopo la calibrazione con standard lipidici (vedi Tabella dei materiali), impostare le analisi in modalità ioni negativi e ottimizzare l'intervallo di rilevamento m/z da 200 Th a 2.000 Th per l'analisi di piccole molecole.
3. Mantenere la fluenza laser del 5% al di sopra della soglia (di CL e MLCL) per avere un S/N (almeno 2).
4. Acquisire spettri in modalità riflettore utilizzando l'estrazione pulsata ritardata. Per ogni spettro di massa, in media 2.000 colpi laser singoli (somma di 4 x 500). Applicare la soppressione della matrice gated a 400 Th per evitare la saturazione del rilevatore.

4. Come calcolare il rapporto (MLCL + CLi)/CLm

1. Eseguire il software dello strumento MALDI-TOF/MS (vedere Tabella dei materiali) per analizzare gli spettri acquisiti.
2. Utilizzando il comando Apri , aprire la finestra di dialogo Spectrum Browser che consente di selezionare e caricare lo spettro di interesse.
3. Nella barra dei menu, fare clic sulle icone Smooth Mass Spectrum e Subtract Mass Spectrum Baseline.
4. Fare clic su File > Esporta > spettro di massa e scegliere il formato ASCII per esportare lo spettro come una tabella a due colonne con coppie di punti dati: m / z (x) e intensità (y). Copia e incolla le coordinate in un programma di fogli di calcolo (*.xls).
5. Ripetere i passaggi da 4.2 a 4.4 per i triplicati di ciascun campione analizzato, incollando le coordinate nello stesso file di programma del foglio di calcolo come illustrato nella Figura 1 (Passaggio 1).
6. Seguendo gli intervalli x mostrati nella Figura 1 (Fase 2) per ciascuna specie elencata, calcolare la somma dei valori y₁, y₂ e y₃ (triplicati) mediante la funzione SOMMA per ottenere l'area del picco (Figura 1; Passo 3).
7. Eseguire la media dei valori dell'area triplicati mediante la funzione MEDIA (Figura 1; Passo 3).
8. Inserire i valori medi dell'area per ciascuna specie nella colonna, come illustrato nella Figura 1 (Passaggio 2).
9. Per considerare solo il primo isotopologo della specie CLm 72:7 come in²⁸, calcola la correzione isotopica per la sovrapposizione tra l'isotopologo M + 2 del CLm 72:8 e il picco monoisotopico di CLm 72:7 come mostrato in Figura 1 (Step 4).
10. Infine, calcolare il rapporto (MLCL + CLi)/CLm come mostrato nella Figura 1 (Fase 5).

Risultati

In questo studio è stato descritto un metodo semplice e rapido per isolare i leucociti da 1 mL di sangue intero e ottenere l'impronta digitale CL mediante MALDI-TOF/MS (vedere Figura 2). La Figura 3 mostra il confronto tra l'impronta digitale CL rappresentativa dei leucociti, ottenuta da soggetti di controllo e giovani ragazzi BTHS, nell'intervallo di massa CL e MLCL (m/z). La Tabella 1 elenca le specie CL e MLCL rilevate in questi spe...

Discussione

La sindrome di Barth è un errore congenito del metabolismo e una condizione che cambia la vita che è probabile che sia sotto-diagnosticata ^{2,6. Come accennato in precedenza, un fattore che contribuisce può essere la mancanza di un test diagnostico semplice. Qui, è stato descritto un metodo semplice e veloce per misurare il rapporto MLCL / CL da MALDI-TOF / MS nei leucociti per lo screening BTHS. Inoltre, gli spettrometri di massa MALDI-TOF sono ampiament...}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin	Avanti Polar Lipids	750332	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin	Avanti Polar Lipids	710335	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	878130	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate	Avanti Polar Lipids	830845	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)	Avanti Polar Lipids	840445	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids	840033	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	190764
9-Aminoacridine hemihydrate, 98%	Acros Organics	134410010
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	360457
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8%	Merck Life Science S.r.l.	319988
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000	Merck Life Science S.r.l.	31392
Flex Analysis 3.3	Bruker Daltonics		Software
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF	Bruker Daltonics
Microsoft Excel	Microsoft Office		Software
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate	Merck Life Science S.r.l.	6505-OP
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5%	Merck Life Science S.r.l.	P3911
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0%	Merck Life Science S.r.l.	S9888