通过质谱法对白细胞中的心磷脂进行指纹识别，以快速诊断巴特综合征

摘要

该协议显示了如何获得白细胞心磷脂的质谱"指纹"以诊断Barth综合征。单心磷脂与心磷脂比值升高的评估将 Barth 综合征患者与对照心力衰竭患者区分开来，敏感性和特异性为 100%。

摘要

心磷脂（CL）是一种在其结构中携带四个脂肪酸链的二聚体磷脂，是线粒体的脂质标记物，其中它在内膜的功能中起着至关重要的作用。其代谢物单心磷脂（MLCL）在生理上几乎不存在于动物细胞的脂质提取物中，其外观是Barth综合征（BTHS）的标志，Barth综合征是一种罕见的，经常被误诊的遗传性疾病，在婴儿期导致严重的心肌病。这里描述的方法产生"心磷脂指纹图谱"，并允许对细胞脂质谱中CL和MLCL物种的相对水平进行简单测定。在白细胞的情况下，只需要1 mL血液 即可通过 基质辅助激光解吸电离测量MLCL / CL比率 - 飞行时间/质谱（MALDI-TOF / MS），只需在抽血后2小时内。该测定方法很简单，可以很容易地整合到临床生化实验室的常规工作中，以筛查BTHS。该试验显示 BTHS 的敏感性和特异性为 100%，使其成为一种合适的诊断试验。

引言

Barth综合征（BTHS）是一种罕见的X连锁疾病，其特征为早发性心肌病，骨骼肌病，生长迟缓，中性粒细胞减少，可变线粒体呼吸链功能障碍和线粒体结构异常^{1，2，3，4，5}。BTHS的患病率为每百万男性1例，目前全世界已知病例不到250例，尽管人们普遍认为该疾病被低估了^2，6。BTHS 由定位于 Xq28.12⁷，8 的 Tafazzin （TAFAZZIN） 基因的功能丧失突变引起，导致线粒体磷脂心磷脂 （CL） 重塑不足，这一过程通常导致高度对称和不饱和的酰基组成^9，10。CL被认为是线粒体的标志性脂质，它是内膜的重要组成部分，对氧化磷酸化（即线粒体能量代谢），超复合物形成，蛋白质导入至关重要，并参与线粒体动力学，线粒体自噬和细胞凋亡^{11，12，13，14，15，16}.当TAFAZZIN功能丧失时，CL重塑失败，并且在BTHS患者的线粒体中出现特定的磷脂异常:成熟CL水平（CLm）降低，而单心磷脂（MLCL）水平升高和CL酰基组成改变（即未成熟的CL物种，CLi）发生。这导致MLCL / CL比率显着增加¹⁷。

BTHS 的诊断通常很困难，因为该疾病呈现出极其多变的临床和生化特征，并且随着时间的推移，来自同一家庭和患者内部的受影响个体之间可能有所不同^3，5。许多 BTHS 男孩的尿排泄水平非常高，3-甲基戊二酸 （3-MGCA），但随着时间的推移，患者的尿量可能正常或仅轻度升高³.然而，3-MGCA 升高是其他各种线粒体和非线粒体疾病的特征，例如 3-甲基谷氨酰辅酶 A 水合酶缺乏症（AUH 缺陷）、3-甲基戊二酸尿、肌张力障碍性耳聋、脑病、Leigh 样 （MEGDEL） 综合征、Costeff 综合征和扩张型心肌病伴共济失调 （DCMA） 综合征^18，19.因此，3-MCGA作为BTHS标志物的特异性较差以及患者的巨大变异性使得生化诊断不明确。

此外，已经描述了超过120种不同的TAFAZZIN突变导致该疾病⁵ ，因此，遗传诊断可能很复杂，缓慢且昂贵。此外，TAFAZZIN基因的分子分析在非编码或调节序列³中存在突变时可导致假阴性结果。BTHS可以通过确定（单）CL物种的相对数量和分布来明确测试，并通过TAFAZZIN基因测序确认，反之亦然。

诊断的实用测试是通过高效液相色谱（HPLC）和电喷雾电离/质谱（ESI / MS）分析在血斑^20，21中测量MLCL / CL比。单独测量 CL 水平不足以诊断，因为一些患者的 CL 水平接近正常，但 MLCL/CL 比值改变。因此，MLCL/CL 比值的测量对 BTHS 诊断具有 100% 的敏感性和特异性²¹。另一种基于HPLC和ESI / MS分析的经过验证的方法已经在白细胞²²上建立，但是用于分离先前提取的脂质的复杂色谱技术以及仪器的昂贵限制了该分析仅限于少数临床实验室。所有这些因素，加上缺乏直接的诊断测试，导致了该病症的诊断不足。

MALDI-TOF/MS是脂质分析^23，24中的另一个有效工具。这种分析技术可用于直接获得各种生物样品的脂质谱，从而跳过提取和分离步骤^{25，26，27，28，29}，包括在用于MS成像应用的组织切片³⁰。鉴于这一优势，开发了一种简单快速的诊断BTS的方法，通过分析具有MALDI-TOF / MS的完整白细胞中的线粒体CL^来诊断28。通过红细胞沉降和裂解仅从1 mL全血中分离白细胞非常简单，不需要特殊的设备或试剂。此外，描述了适用于微量白细胞的快速脂质"迷你提取"方案，以确保成功获得具有比从完整白细胞获得的具有更高信噪比（S / N）的更清晰的MS信号的光谱²⁸。这一进一步的步骤只需要很少的时间，即使在灵敏度较差的MS仪器上进行分析，也可以进行可重复的分析。总之，这里描述的分析方法需要最少的样品制备，因为可以跳过耗时且劳动密集型的色谱脂质分离，从而加快测试速度。

研究方案

在巴里（意大利）的Policlinic医院收集了健康献血者和心力衰竭患者的血液样本，而BTHS患者的样本则由布里斯托尔皇家儿童医院（英国）的国家卫生服务英国BTHS诊所获得。获得健康捐赠者，患者和父母（在适当情况下）的书面知情同意以及各自伦理委员会的批准。

注意:如果不立即使用，血液（在K-EDTA凝胶管中）可以在4°C下储存长达24-48小时。

1. 通过右旋糖酐沉降红细胞（RBC）分离白细胞

1. 将血液样本（在K-EDTA中）放在眼眶振荡器上10分钟以混合血液。
2. 在1.5 mL管中的0.9mL全血中，加入0.1mL的20%葡聚糖溶液（分子量>100 kDa，在0.9%NaCl中）。移液并轻轻分散悬浮液20次，同时避免气泡，否则气泡会将红细胞保留在管的顶部。让红细胞在室温下沉淀约1小时。
3. 使用注射器，收集黄色上清液并将其转移到15mL管中，然后在室温下以400× g 离心15分钟（无制动器，回转桶转子）。
4. 弃去上清液，并将主要含有白细胞和残留红细胞的沉淀重悬于0.6mL冰冷的双蒸馏水（ddH₂O）中。
5. 约15秒后，向细胞悬浮液中加入0.2mL 0.6 M KCl以恢复正确的渗透压。短暂的渗透性休克会裂解红细胞，使白细胞完好无损。使用 1 倍 PBS 将最终体积调节至 2.5 mL。
6. 在室温下以400× g 离心悬浮液15分钟（无制动器，回转桶转子）。弃去上清液，用2.5mL 1x PBS再次洗涤白细胞沉淀。
7. 如步骤1.6所述离心并弃去上清液。将含有白细胞的沉淀重悬于200μL灭菌的ddH₂O中。
   注意:根据作者的经验，这对应于200μg至400μg的蛋白质含量。
8. 将悬浮液在-80°C下冷冻或直接进行脂质提取，如下所示。

2. 从分离的白细胞中"小提取"脂质

1. 将20μL白细胞悬浮液（约20-40μg蛋白质）转移到1.5mL管中，并以16，000× g 旋转30秒。
2. 弃去上清液，向剩余的沉淀中加入10μLCHCl₃ ，并反复移液以促进脂质提取。
3. 最后，向CHCl₃中的沉淀中加入10μL9-氨基吖啶（9-AA）基质溶液（10mg / mL 9-AA在2-丙醇/乙腈中，60:40 v / v）。移液并反复分散以混合。
4. 将含有CHCl₃ 和9-AA中脂质的溶液在16，000× g 下旋转30秒，然后将上清液作为0.35μL的液滴（每个样品重复三个）沉积在要分析的MALDI靶标（样品板）上（"干液滴"沉积法）。
5. 让液滴风干至少10-15分钟。

3. 通过 MALDI-TOF/MS 进行脂质分析

1. 在MALDI-TOF质谱仪上一式三份获取样品的质谱。
2. 使用脂质标准品校准后（参见 材料表），将分析设置为负离子模式，并优化检测 m / z 范围从200 Th到2，000 Th进行小分子分析。
3. 将激光通量保持在阈值（CL和MLCL）以上5%以具有S / N（至少2）。
4. 使用延迟脉冲提取在反射器模式下采集光谱。对于每个质谱，平均2，000次激光射击（总和为4 x 500）。将门控矩阵抑制应用于400 Th，以防止检测器饱和。

4. 如何计算（MLCL + CLi）/CLm比率

1. 运行 MALDI-TOF/MS 仪器软件（参见 材料表）以分析采集的光谱。
2. 使用 "打开" 命令，打开" 频谱浏览器 "对话框，该对话框允许选择和加载感兴趣的频谱。
3. 在菜单栏上，单击图标 平滑质谱 和 减去质谱基线。
4. 单击 "文件>导出>质谱 "，然后选择ASCII格式，将光谱导出为包含成对数据点的两列表: m / z （x）和强度（y）。将坐标复制并粘贴到电子表格程序中（*.xls）。
5. 对每个分析样品的一式三份重复步骤4.2至4.4，将坐标粘贴到同一电子表格程序文件中，如图 1 所示（步骤1）。
6. 按照图1（步骤2）中所示的x范围，对于列出的每个物种，通过SUM函数计算y₁，y₂和y_{y 3}值的总和（一式三份）以获得峰面积（图1;步骤 3）。
7. 通过 AVERAGE 函数执行一式三份面积值的 平均值 （图 1;步骤 3）。
8. 将每个物种的平均值放在列中，如图 1 所示（步骤2）。
9. 为了仅考虑CLm 72:7物种的第一同位素，如²⁸所示，计算CLm 72:8的M + 2同位素与CLm 72:7的单同位素峰之间的重叠的同位素 校正（步骤 4）。
10. 最后，计算（MLCL + CLi）/CLm比率，如图 1 所示（步骤5）。

结果

在这项研究中，描述了一种从1 mL全血中分离白细胞并通过MALDI-TOF / MS获得CL指纹图谱的简单而快速的方法（见 图2）。 图3 显示了从对照组和BTHS幼儿获得的白细胞的代表性CL指纹图谱的比较，在CL和MLCL质量（m / z）范围内。 表1 列出了在这些质谱中检测到的CL和MLCL物种。

TAFAZZIN基因中的缺陷通常决定了BTHS特异性的...

讨论

巴特综合征是一种先天性的新陈代谢错误和一种改变生活的疾病，^{可能被低估}2^{，6。如前所述，一个促成因素可能是缺乏直接的诊断测试。在这里，描述了一种简单快捷的通过MALDI-TOF/MS测量白细胞中MLCL/CL比值的方法，用于BTHS筛选。此外，MALDI-TOF质谱仪广泛分布在世界各地的临床实验室中，不需要很高的分析专业知识31，}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin	Avanti Polar Lipids	750332	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin	Avanti Polar Lipids	710335	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	878130	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate	Avanti Polar Lipids	830845	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)	Avanti Polar Lipids	840445	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids	840033	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	190764
9-Aminoacridine hemihydrate, 98%	Acros Organics	134410010
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	360457
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8%	Merck Life Science S.r.l.	319988
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000	Merck Life Science S.r.l.	31392
Flex Analysis 3.3	Bruker Daltonics		Software
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF	Bruker Daltonics
Microsoft Excel	Microsoft Office		Software
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate	Merck Life Science S.r.l.	6505-OP
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5%	Merck Life Science S.r.l.	P3911
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0%	Merck Life Science S.r.l.	S9888