Fingerprinting von Cardiolipin in Leukozyten mittels Massenspektrometrie zur schnellen Diagnose des Barth-Syndroms

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt, wie man einen massenspektrometrischen "Fingerabdruck" von Leukozyten-Cardiolipin für die Diagnose des Barth-Syndroms erhält. Die Beurteilung des erhöhten Monolysocardiolipin-zu-Cardiolipin-Verhältnisses unterscheidet Patienten mit Barth-Syndrom von Patienten mit kontrollierter Herzinsuffizienz mit 100% Sensitivität und Spezifität.

Zusammenfassung

Cardiolipin (CL), ein dimeres Phospholipid, das vier Fettsäureketten in seiner Struktur trägt, ist der Lipidmarker der Mitochondrien, wobei es eine entscheidende Rolle bei der Funktion der inneren Membran spielt. Sein Metabolit Monolysocardiolipin (MLCL) fehlt physiologisch fast im Lipidextrakt tierischer Zellen und sein Aussehen ist das Kennzeichen des Barth-Syndroms (BTHS), einer seltenen und oft falsch diagnostizierten genetischen Erkrankung, die im Säuglingsalter eine schwere Kardiomyopathie verursacht. Die hier beschriebene Methode erzeugt einen "Cardiolipin-Fingerabdruck" und ermöglicht eine einfache Bestimmung der relativen Konzentrationen von CL- und MLCL-Spezies in zellulären Lipidprofilen. Im Falle von Leukozyten wird nur 1 ml Blut benötigt, um das MLCL/CL-Verhältnis mittels matrixgestützter Laserdesorptionsionisation - Flugzeit-/Massenspektrometrie (MALDI-TOF/MS) nur innerhalb von 2 h nach der Blutentnahme zu messen. Der Assay ist unkompliziert und kann leicht in die Routinearbeit eines klinisch-biochemischen Labors integriert werden, um auf BTHS zu screenen. Der Test zeigt eine 100% ige Sensitivität und Spezifität für BTHS und ist damit ein geeigneter diagnostischer Test.

Einleitung

Das Barth-Syndrom (BTHS) ist eine seltene X-chromosomale Erkrankung, die durch früh einsetzende Kardiomyopathie, Skelettmuskelmyopathie, Wachstumsverzögerung, Neutropenie, variable mitochondriale Atmungskettendysfunktion und abnormale mitochondriale Struktur^{gekennzeichnet ist} 1,2,3,4,5. BTHS hat eine Prävalenz von einem Fall pro Million Männer mit derzeit weniger als 250 bekannten Fällen weltweit, obwohl es allgemein anerkannt ist, dass die Krankheit unterdiagnostiziert^{ist 2,6}. BTHS resultiert aus Funktionsverlustmutationen des Tafazzin (TAFAZZIN) -Gens, die auf dem Chromosom Xq28.12^7,8 lokalisiert sind und eine mangelhafte Umgestaltung des mitochondrialen Phospholipids Cardiolipin (CL) verursachen, ein Prozess, der normalerweise zu einer hochsymmetrischen und ungesättigten Acylzusammensetzung führt ^9,10. CL wurde als Signaturlipid der Mitochondrien angesehen, wo es ein wichtiger Bestandteil der inneren Membran ist, der für die oxidative Phosphorylierung (dh den mitochondrialen Energiestoffwechsel), die Bildung von Superkomplexen, den Proteinimport und die mitochondriale Dynamik, Mitophagie und Apoptose unerlässlich ist 11,12,13,14,15,16 . Bei Verlust der Funktion von TAFAZZIN schlägt der CL-Remodeling fehl und spezifische Phospholipidanomalien treten in den Mitochondrien von BTHS-Patienten auf: Der reife CL-Spiegel (CLm) ist erniedrigt, während erhöhte Spiegel von Monolysocardiolipin (MLCL) und veränderter CL-Acylzusammensetzung (dh unreife CL-Spezies, CLi) auftreten. Dies führt zu einem dramatischen Anstieg des MLCL/CL-Verhältnisses^{um 17}.

Die Diagnose von BTHS ist oft schwierig, da die Erkrankung extrem unterschiedliche klinische und biochemische Merkmale aufweist und sich zwischen betroffenen Personen aus derselben Familie und innerhalb eines Patienten im Laufe der Zeit unterscheiden kann ^3,5. Viele BTHS-Jungen zeigen eine sehr hohe Harnausscheidung von 3-Methylglutaconsäure (3-MGCA), aber der Urinspiegel kann bei Patienten im Laufe der Zeit normal oder nur leicht erhöht^{sein 3}. Ein erhöhter 3-MGCA ist jedoch ein Merkmal verschiedener anderer mitochondrialer und nicht-mitochondrialer Erkrankungen, wie 3-Methylglutaconyl-CoA-Hydratase-Mangel (AUH-Defekt), 3-Methylglutaconsäureurie, Dystonie-Taubheit, Enzephalopathie, Leigh-like (MEGDEL) -Syndrom, Costeff-Syndrom und dilatative Kardiomyopathie mit Ataxie (DCMA) -Syndrom^18,19 . Daher machen die schlechte Spezifität von 3-MCGA als Marker für BTHS und die enorme Variabilität der Patienten die biochemische Diagnose mehrdeutig.

Darüber hinaus wurden über 120 verschiedene TAFAZZIN-Mutationen beschrieben, die die Störung⁵ verursachen, und daher kann eine genetische Diagnose kompliziert, langsam und teuer sein. Darüber hinaus kann die molekulare Analyse des TAFAZZIN-Gens zu falsch-negativen Ergebnissen führen, wenn Mutationen in nicht-kodierenden oder regulierenden Sequenzen^{vorliegen 3}. BTHS kann durch Bestimmung der relativen Mengen und Verteilung von (monolyso-)CL-Arten eindeutig getestet und durch TAFAZZIN-Gensequenzierung bestätigt werden oder umgekehrt.

Ein praktischer Test für die Diagnose ist die Messung des MLCL/CL-Verhältnisses durch High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) und Electro Spray Ionization / Mass Spectrotry (ESI/MS) Analyse im Blutfleck^20,21. Die Messung des CL-Spiegels allein ist für die Diagnose nicht ausreichend, da einige Patienten nahezu normale CL-Spiegel aufweisen, aber das MLCL/CL-Verhältnis verändert haben. Daher hat die Messung des MLCL/CL-Verhältnisses eine 100%ige Sensitivität und Spezifität für die BTHS-Diagnose²¹. Eine weitere validierte Methode, die auf HPLC- und ESI/MS-Analysen basiert, wurde auf Leukozyten²² eingerichtet, aber die komplexen chromatographischen Techniken zur Trennung von zuvor extrahierten Lipiden und die Kosten der Instrumente beschränken diese Analyse auf einige wenige klinische Laboratorien. All diese Faktoren, zusammen mit dem Fehlen eines einfachen diagnostischen Tests, haben zur Unterdiagnose der Erkrankung beigetragen.

MALDI-TOF/MS ist ein weiteres valides Werkzeug in der Lipidanalytik^23,24. Diese Analysetechnik kann verwendet werden, um direkt Lipidprofile verschiedener biologischer Proben zu erhalten, wodurch die Extraktions- und Trennschritte 25,26,27,28,29, einschließlich in Gewebeabschnitten für MS Imaging-Anwendungen 30^, übersprungen ^werden. Angesichts dieses Vorteils wurde eine einfache und schnelle Methode zur Diagnose von BTHS durch Profiling von mitochondrialer CL in intakten Leukozyten mit MALDI-TOF/MS entwickelt²⁸. Die Leukozytenisolierung aus nur 1 ml Vollblut durch Erythrozytensedimentation und Lyse ist unkompliziert und erfordert keine spezielle Ausrüstung oder Reagenzien. Darüber hinaus wurde ein schnelles Lipid-"Mini-Extraktions"-Protokoll beschrieben, das auf winzige Mengen von Leukozyten anwendbar ist, um die erfolgreiche Aufnahme von Spektren mit saubereren MS-Signalen mit einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) als bei intakten Leukozyten²⁸ zu rechtfertigen. Dieser weitere Schritt nimmt wenig Zeit in Anspruch und ermöglicht es, Analysen auch dann reproduzierbar zu machen, wenn sie an MS-Instrumenten mit geringer Empfindlichkeit durchgeführt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene analytische Methode eine minimale Probenvorbereitung erfordert, da eine zeit- und arbeitsintensive chromatographische Lipidtrennung übersprungen werden kann, wodurch der Test beschleunigt wird.

Protokoll

Blutproben von gesunden Spendern und Patienten mit Herzinsuffizienz wurden im Poliklinikum von Bari (Italien) gesammelt, während Proben von BTHS-Patienten von der BTHS-Klinik des National Health Service UK am Bristol Royal Hospital for Children (UK) erhalten wurden. Schriftliche Einverständniserklärung von gesunden Spendern, Patienten und Eltern (falls zutreffend) und Genehmigungen der jeweiligen Ethikkommissionen wurden eingeholt.

HINWEIS: Bei nicht sofortiger Anwendung kann Blut (in K-EDTA-Gelröhrchen) bei 4 °C für bis zu 24-48 h gelagert werden.

1. Isolierung von Leukozyten durch Dextransedimentation von roten Blutkörperchen (RBCs)

1. Legen Sie Blutproben (in K-EDTA) für 10 Minuten auf einen Orbitalschüttler, um Blut zu mischen.
2. Zu 0,9 ml Vollblut in einem 1,5-ml-Röhrchen fügen Sie 0,1 ml 20%ige Dextranlösung (Molekülmasse > 100 kDa, in 0,9% NaCl) hinzu. Pipette und dispergiere die Suspension sanft 20 Mal, während Luftblasen vermieden werden, die sonst RBCs an der Oberseite des Rohres zurückhalten würden. Lassen Sie RBCs bei Raumtemperatur ca. 1 h sedimentieren.
3. Sammeln und übertragen Sie mit einer Spritze den gelben Überstand in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie dann bei 400 x g für 15 Minuten bei Raumtemperatur (keine Bremse, Schwenkschaufelrotor).
4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet, das hauptsächlich Leukozyten und Rest-RBCs enthält, in 0,6 ml eiskaltem bidestilliertem Wasser (ddH₂O).
5. Nach ~15 s fügen Sie 0,2 ml 0,6 M KCl zur Zellsuspension hinzu, um die korrekte Osmolarität wiederherzustellen. Der kurze osmotische Schock wird RBC lysieren und Leukozyten intakt lassen. Stellen Sie die endgültige Lautstärke mit 1x PBS auf 2,5 ml ein.
6. Zentrifen Sie die Aufhängung bei 400 x g für 15 min bei Raumtemperatur (keine Bremse, Schwenkschaufelrotor). Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Leukozytenpellet erneut mit 2,5 ml 1x PBS.
7. Zentrifugieren Sie wie in Schritt 1.6 und verwerfen Sie den Überstand. Resuspendiert das Pellet, das Leukozyten enthält, in 200 μL sterilisiertem ddH₂O.
   HINWEIS: Nach den Erfahrungen der Autoren entspricht dies einem Proteingehalt von 200 μg bis 400 μg.
8. Die Suspension bei -80 °C einfrieren oder die Lipidextraktion wie folgt direkt durchführen.

2. "Mini-Extraktion" von Lipiden aus isolierten Leukozyten

1. Übertragen Sie 20 μL Leukozytensussuspension (ca. 20-40 μg Proteine) in ein 1,5 ml Röhrchen und drehen Sie sich bei 16.000 x g für 30 s.
2. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie dem verbleibenden Pellet 10 μL_{CHCl 3} hinzu und pipettieren Sie wiederholt, um die Lipidextraktion zu fördern.
3. Schließlich werden 10 μL 9-Aminoacridin (9-AA)-Matrixlösung (10 mg/ml 9-AA in 2-Propanol/Acetonitril, 60:40 v/v) in das Pellet in_CHCl3 gegeben. Pipettieren und wiederholt dispergieren, um zu mischen.
4. Drehen Sie die Lösung, die Lipide in CHCl₃ und 9-AA enthält, bei 16.000 x g für 30 s und legen Sie dann den Überstand als Tröpfchen von 0,35 μL (drei Replikate für jede Probe) auf dem zu analysierenden MALDI-Ziel (Probenplatte) ab (Abscheidemethode "getrocknete Tröpfchen").
5. Lassen Sie die Tröpfchen mindestens 10-15 min an der Luft trocknen.

3. Lipidanalyse mit MALDI-TOF/MS

1. Erfassen Sie Massenspektren von Proben in Verdreifachungen auf einem MALDI-TOF-Massenspektrometer.
2. Stellen Sie nach der Kalibrierung mit Lipidstandards (siehe Materialtabelle) die Analysen in den negativen Ionenmodus ein und optimieren Sie den Detektions-m /z-Bereich von 200 Th bis 2.000 Th für die Kleinmolekülanalyse.
3. Halten Sie die Laserfluenz 5% über dem Schwellenwert (von CL und MLCL), um ein S / N (mindestens 2) zu haben.
4. Erfassen Sie Spektren im Reflektormodus mit verzögerter gepulster Extraktion. Für jedes Massenspektrum durchschnittlich 2.000 einzelne Laserschüsse (Summe von 4 x 500). Wenden Sie die Gated Matrix-Unterdrückung auf 400 Th an, um eine Sättigung des Detektors zu verhindern.

4. So berechnen Sie das Verhältnis (MLCL + CLi) / CLm

1. Führen Sie die MALDI-TOF/MS-Gerätesoftware (siehe Materialtabelle) aus, um die erfassten Spektren zu analysieren.
2. Öffnen Sie mit dem Befehl Öffnen das Dialogfeld Spectrum Browser , in dem Sie das interessierende Spektrum auswählen und laden können.
3. Klicken Sie in der Menüleiste auf die Symbole Massenspektrum glätten und Massenspektrum Baseline subtrahieren.
4. Klicken Sie auf Datei > > Massenspektrum exportieren und wählen Sie das ASCII-Format für den Export des Spektrums als zweispaltige Tabelle mit Datenpunktpaaren: m/z (x) und Intensität (y). Kopieren Sie die Koordinaten und fügen Sie sie in ein Tabellenkalkulationsprogramm ein (*.xls).
5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.4 für die Triplikatoren jeder analysierten Probe, und fügen Sie die Koordinaten in dieselbe Tabellenkalkulationsprogrammdatei ein, wie in Abbildung 1 (Schritt 1) dargestellt.
6. Berechnen Sie anhand der in Abbildung 1 (Schritt 2) dargestellten x-Bereiche für jede aufgeführte Art die Summe der Werte y 1, y₂ und y₃ (dreifach) durch die Funktion SUMME, um die Peakfläche zu erhalten (Abbildung ₁; Schritt 3).
7. Führen Sie den Mittelwert der Flächenwerte der Verdreifachungen mit der Funktion MITTELWERT aus (Abbildung 1; Schritt 3).
8. Platzieren Sie die durchschnittlichen Flächenwerte für jede Art in der Spalte wie in Abbildung 1 (Schritt 2) dargestellt.
9. Um nur den ersten Isotopologen der CLm 72:7-Spezies wie in²⁸ zu betrachten, berechnen Sie die Isotopenkorrektur für die Überlappung zwischen dem M + 2-Isotopologen des CLm 72:8 und dem Monoisotopen-Peak von CLm 72:7, wie in Abbildung 1 (Schritt 4) gezeigt.
10. Berechnen Sie abschließend das Verhältnis (MLCL + CLi)/CLm, wie in Abbildung 1 (Schritt 5) dargestellt.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde eine einfache und schnelle Methode zur Isolierung von Leukozyten aus 1 ml Vollblut und zur Erlangung von CL-Fingerabdrücken durch MALDI-TOF/MS beschrieben (siehe Abbildung 2). Abbildung 3 zeigt den Vergleich des repräsentativen CL-Fingerabdrucks von Leukozyten, der von Kontrollpersonen und BTHS-Jungen im CL- und MLCL-Massenbereich (m/z) erhalten wurde. Tabelle 1 listet CL- und MLCL-Arten auf, die in diesen Masse...

Diskussion

Das Barth-Syndrom ist ein angeborener Stoffwechselfehler und eine lebensverändernde Erkrankung, die wahrscheinlich unterdiagnostiziert wird ^{2,6. Wie bereits erwähnt, kann ein beitragender Faktor das Fehlen eines einfachen diagnostischen Tests sein. Hier wurde eine einfache und schnelle Methode zur Messung des MLCL/CL-Verhältnisses durch MALDI-TOF/MS in Leukozyten für das BTHS-Screening beschrieben. Darüber hinaus sind MALDI-TOF-Massenspektrometer in kli...}

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin	Avanti Polar Lipids	750332	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin	Avanti Polar Lipids	710335	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	878130	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate	Avanti Polar Lipids	830845	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)	Avanti Polar Lipids	840445	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids	840033	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	190764
9-Aminoacridine hemihydrate, 98%	Acros Organics	134410010
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	360457
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8%	Merck Life Science S.r.l.	319988
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000	Merck Life Science S.r.l.	31392
Flex Analysis 3.3	Bruker Daltonics		Software
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF	Bruker Daltonics
Microsoft Excel	Microsoft Office		Software
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate	Merck Life Science S.r.l.	6505-OP
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5%	Merck Life Science S.r.l.	P3911
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0%	Merck Life Science S.r.l.	S9888