İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Tip 2 Alveolar Epitel Hücrelerinin 3D Küreleri ve 2D Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Üretilmesi

Özet

Mevcut protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı tip 2 alveoler epitel benzeri hücreleri (iAT2'ler) tanımlamaktadır. Bu hücreler 3D kültürde kendini yenileyen küreler olarak kültürlenebilir veya hava-sıvı arayüzü (ALI) kültürüne uyarlanabilir.

Özet

Akciğerde, alveoler epitel çevresel uyaranlara karşı fiziksel bir bariyerdir ve homeostaz ve hastalıkta önemli bir rol oynar. Tip 2 alveoler epitel hücreleri (AT2'ler) distal akciğer epitelinin fakültatif progenitörleridir. AT2'lerin disfonksiyonu ve yaralanması çeşitli akciğer hastalıklarından kaynaklanabilir ve bunlara katkıda bulunabilir. AT2 biyolojisinin daha iyi anlaşılması, bu nedenle, akciğer biyolojisini ve hastalığını anlamak için kritik öneme sahiptir; Bununla birlikte, birincil insan AT2'lerinin izole edilmesi genellikle zordur ve tedarikte sınırlıdır. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı tip 2 alveoler epitel hücreleri (iAT2'ler), in vivo akciğer gelişimini özetleyen yönlendirilmiş bir farklılaşma protokolü ile üretilebilir. iAT2'ler besleyicisiz koşullarda büyür, insan yetişkin birincil AT2'lerle transkriptomik bir programı paylaşır ve AT2'lerin üretim, paketleme ve yüzey aktif madde salgılanması gibi temel işlevlerini yerine getirir. Bu protokol, üç boyutlu (3D) kültürde seri geçiş yoluyla kendi kendini yenileyen iAT2'leri sürdürme veya iAT2'leri hava-sıvı arayüzü (ALI) kültürüne uyarlama yöntemlerini detaylandırır. iAT2'lerin tek hücreli bir süspansiyonu, 3D çözünür bazal membran matrisinde (bundan böyle "matris" olarak anılacaktır) kaplanmadan önce üretilir ve burada tek katmanlı epitel kürelerine kendiliğinden monte edilirler. 3D kültürdeki iAT2'ler, 2D ALI kültüründe geçirilecek veya kaplanacak tek hücreli süspansiyonlara seri olarak ayrıştırılabilir. ALI kültüründe, iAT2'ler apikal yüzeyi havaya maruz kalan polarize bir tek katman oluşturur ve bu platformu çevresel maruziyetlere kolayca uygun hale getirir. Bu nedenle, bu protokol, SFTPC^tdDomates ifadesi ile belirtilen AT2 programını korurken, 15 pasaj üzerinde giriş hücresi başına 1 x 10³⁰ hücreden oluşan tükenmez bir iAT2 kaynağı üretir. Elde edilen hücreler, genetik mutasyonları incelemek, çevresel maruziyetleri modellemek veya ilaçları taramak için uygulanabilecek tekrarlanabilir ve ilgili bir platformu temsil eder.

Giriş

Akciğerde, hava yolu ve alveoler epitel hücreleri, solunan aerosoller yoluyla bulaşan patojenler ve sigara dumanı gibi zararlı uyaranlar da dahil olmak üzere solunan çevresel maruziyetlerle karşılaşan ilk kişilerdir. Tip 2 alveoler epitel hücreleri (AT2'ler), distal akciğer epitelinin fakültatif progenitörleri olduklarından, alveoler yüzey gerilimini hafifletmek için yüzey aktif maddeler ürettikleri ve inhale maruziyetlere doğuştan gelen bağışıklık tepkisini monte ettikleri için akciğer homeostazının korunmasında esastır ^1,2. Bununla birlikte, AT2 disfonksiyonu, akciğer yaralanmalarından veya SFTPC, SFTPB ve ABCA3 ^3,4,5 gibi AT2'lerde seçici olarak eksprese edilen genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanabilir. Bu genetik mutasyonları incelemek için önceki yaklaşımlar, fare modellerine⁶ veya ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına tanıtılan mühendislik ürünü, mutasyon içeren vektörlere dayanıyordu⁷. Bu nedenle, genetik ve çevresel bozulmaların fizyolojik olarak ilgili hücre tiplerinde ve üretken bir in vitro sistemde AT2'ler üzerindeki etkilerini modelleyebilen platformlara, AT2'lerin sağlık ve hastalıkta oynadığı rolü daha iyi anlamak için ihtiyaç vardır.

Havadaki maruziyetlerin modellenmesi açısından, primer hava yolu epitel hücrelerinin hava-sıvı arayüzü (ALI) kültürleri, sigara dumanı^8'e anahtar moleküler yanıtları ortaya çıkarmak ve hava yolu enfeksiyonu ^9,10'u modellemek için başarıyla kullanılmıştır. Hastalıkta önemli bir enfeksiyon veya yaralanma bölgesi olan alveoler epitel için karşılaştırılabilir bir ALI kültür sistemi, hava yolu epitel model sistemine kıyasla çok daha az gelişmiştir. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ALI'de alveoler epitel^11,12 için bir vekil olarak kültürlenmiştir^, ancak bu hücre hatları primer alveoler epitel hücrelerinden transkriptomik olarak farklıdır¹³ ve sürfaktan salgılama veya ALI ^12'de sıkı kavşaklar oluşturma yeteneği gibi anahtar hücresel mekanizmalardan yoksundur. Birincil insan AT2'leri, fibroblastların varlığında 3D kürelerde kültürlenebilir ^1,14, ancak eksplant akciğerlerinden sınırlı erişilebilirlik ve bugüne kadar çoğu kültürde yaşlanma veya hücresel fenotipi kaybetme eğilimleri de dahil olmak üzere sınırlamalara tabidir. Bu özellikler, primer AT2'nin in vitro çalışmaların yaygın olarak benimsenmesinin önünde engeller sunmaktadır, ancak birincil AT2'lerin^{15,16,17,18'in} genişletilmesi için besleyicisiz 3D kültürlerin optimize edilmesinde son zamanlarda ilerleme kaydedilmiştir.

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı tip 2 alveoler epitel hücreleri (iAT2s)¹⁹ üretmek için in vivo gelişimsel kilometre taşlarını özetlemek için yönlendirilmiş farklılaşma protokolleri geliştirilmiştir. iAT2'ler, fibroblast besleyicilerin yokluğunda, "CK + DCI^"19 olarak adlandırılan CHIR99021, KGF, deksametazon, cAMP ve 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) içeren tanımlanmış bir ortamda 3D serumsuz kültürde kendiliğinden yenilenen küreler olarak büyür ve >20 pasajları^20,21 için kültürlenebilir. Dahası, iAT2'ler insan yetişkin birincil AT2'leri ile transkriptomik bir programı paylaşır, lamel cisimler oluşturur ve yüzey aktif madde^19,21,22 üretir ve paketler. Bu protokol, hücreleri tek hücreli bir süspansiyona ayırarak iAT2'lerin seri geçişini detaylandırır. Bu noktada, iAT2'ler 3D kültürde yeniden kaplanabilir ve daha da genişletilebilir veya 2D ALI kültürü^23'te kaplanabilir. Bu yöntemler, homeostaz ve hastalık^20,22'de AT2'lerin içsel biyolojisini ^{incelemek ve daha} önce gösterildiği gibi, ölçeklenebilir, fizyolojik olarak ilgili bir platform^23,24'te bileşiklerin veya uyaranların etkilerini sorgulamak için kullanılabilir.

Protokol

İnsan iPSC hatlarının farklılaşmasını içeren tüm deneyler, Boston Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu'na (protokol H33122) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. iPSC'lere yeniden programlanmak üzere tedarik edilen dermal fibroblastlar, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi, St. Louis, MO İnsan Araştırma Koruma Ofisi'nin onayı altında, yazılı bilgilendirilmiş onamla bir donörden elde edildi.

1. Alveosfer ayrışması

1. Tablo 1'de belirtilen bileşime göre tam serumsuz farklılaşma ortamı (cSFDM) hazırlayın.
2. Hazırlanan cSFDM tabanında CK + DCI ortamını Tablo 2'ye göre hazırlayın.
3. Deneysel ihtiyaçlar için gerekli olan buz üzerinde 2D (insan embriyonik kök hücre nitelikli) ve / veya 3D (büyüme faktörü azaltılmış) matrisi çözün.
4. Tüm CK + DCI ortamını, 12 delikli bir plakada, yönlendirilmiş farklılaşma^19'dan türetilen alveosferler içeren 3D matris damlacıklarından vakum ile bir pipet veya aspire edici pipet kullanarak aspire edin.
5. Damlacık başına 1 mL dispaz (2 mg / mL) ekleyin. P1000 pipet kullanarak damlacığı yavaşça dispase içine pipetleyin. 1 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin, 30 dakika sonra bir kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
6. Ayrışmış organoidleri (Adım 1.5'ten) dispazdaki bir matris damlacığından 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Yıkamak için, 10 mL Iscove's Modified Dulbecco's Medium ekleyin (IMDM, bkz.
7. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. Süpernatantı bir pipet veya vakumla aspire edici pipet kullanarak aspire edin ve mümkün olduğunca az süpernatant bırakın.
   NOT: Tüm dispasları çıkarmak önemlidir, çünkü kalan herhangi bir dispase, hücrelerin daha sonra tohumlanacağı matrisi çözebilir. Peletin üzerinde berrak bir pus görülürse, dispase matrisi tamamen çözmemiştir ve 37 ° C'de 20-30 dakika daha pelete daha fazla dispase eklenebilir.
8. Hücreleri damlacık başına% 0.05 tripsin 1 mL'de yeniden askıya alın ve 12 delikli plakaya geri aktarın. 12-15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ayrışmayı mikroskop altında gözlemleyin. Bu aşamada hücreleri aşırı pipetlemekten kaçının.
   NOT: İnkübasyonun sonunda, hücrelerin bir P1000 pipetle 3-5 kez pipetleme yaptıktan sonra tek hücreli bir süspansiyon elde etmeleri gerekir. iAT2'lerin ALI'ye (Adım 3) geçirilmesi için, tripsinizasyon süresinin en aza indirilmesi gerekir (maksimum 12 dakika), böylece hücreler, hücre kültürü ekine kaplanmaya hazır olduğunda tek hücreli süspansiyon yerine 2-3 hücreli kümeler halinde olur.
9. Tripsinin etkisini eşit hacimde FBS içeren bir ortamla durdurun (DMEM'de% 10 ES nitelikli FBS). Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.
10. Hücreleri 10 mL IMDM ile yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.
11. Hücreleri saymak için uygun bir hacimde yeniden askıya alın ve ardından bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın (bkz.
    NOT: 400 hücre/μL'de tohumlanmış bir akıcıdan 50 μL matris damlacığından beklenen verim damlacık başına 500.000 ila 1,5 x 10⁶ hücredir.
12. 3B matriste kaplama (Adım 2) ve / veya ALI kültürü için hücre kültürü eklerine kaplama (Adım 3) yaparak alveosferler oluşturmak için iAT2 hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunu kullanın.

2.3D iAT2'lerin kaplanması

1. Saydıktan sonra (Adım 1.11), 3B matriste yeniden plakalanacak istenen hücrelerin sayısını belirleyin (12 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 50-100 μL 3D matris damlacıkları ile matrisin 400 hücresi / μL'si). Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj yapın. Bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla süpernatantı çıkarın.
2. 3B matristeki hücreleri yeniden askıya alın. Matriksin polimerleşmesini önlemek için gerekirse hızlı ve buz üzerinde yeniden askıya alın (sıcak olduğunda ortaya çıkar).
3. Kuyu başına bir adet 3D matris damlacığını önceden ısıtılmış 12 delikli bir plakaya dağıtmak için bir P200 pipet kullanın. Matris damlacığında kabarcıklar oluşmasını önlemek için pipeti dikkatlice uygulayın. Birden fazla damlacık dağıtırken hücre süspansiyonunun yerleşmesine izin vermeyin.
4. Matris damlacıklarının polimerize olmasına izin vermek için plakayı 20-30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
5. Matris damlacığını örtmek için kuyu başına 1 mL CK + DCI + 10 μM Y-27632 ortamı ekleyin (bkz.
6. 72 saat sonra, ortamı 10 μM Y-27632 olmadan CK + DCI olarak değiştirin.
7. Ortamı her 48-72 saatte bir taze CK + DCI ile değiştirin.
   NOT: iAT2'lerin tipik olarak hücre hattına ve kaplama yoğunluğuna bağlı olarak yaklaşık her 10-14 günde bir geçmesi gerekecektir.

3. iAT2'lerin ALI'ya geçirilmesi

1. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta/Besin Karışımı F-12'sindeki (DMEM/F12) 2B matrisi, üreticinin 2B matris talimatlarına göre çalışma çözeltisine seyrelterek kullanımdan 1 saat önce taze kaplanmış 6,5 mm hücre kültürü eklerini hazırlayın (bkz. Ardından, 6,5 mm hücre kültürü kesici ucu başına 100 μL seyreltilmiş matris ekleyin. Matriksin 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika veya oda sıcaklığında 1 saat boyunca polimerize olmasına izin verin.
2. Hücre kültürü eklerinden fazla matrisi bir pipet veya aspire edici pipet kullanarak vakumla aspire edin ve DMEM / F12 ile bir kez durulayın. Hücreleri eklemeden hemen önce bu yıkamayı aspire edin.
3. Saydıktan sonra, kültür eklerinde istenen sayıda hücreyi tohumlamak için gerekli hücre sayısını belirleyin (520.000 canlı hücre / cm2, 6.5 mm hücre kültürü eki başına 172.000 canlı hücreye eşdeğer). Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj yapın. Mümkün olduğunca fazla süpernatant çıkarın.
4. Hücre kültürü eki başına 100 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 ile tohumlamak için hücreleri uygun hacimde yeniden askıya alın (hücre süspansiyonu 1.720 hücre / μL olmalıdır). Hücre kültürü ekinin apikal bölmesine 100 μL ekleyin. Hücrelerin hücre kültürü eki boyunca eşit dağılımını sağlamak için plakayı çapraz bir düzende nazikçe çalkalayın ve 4x hedefinde mikroskop altında kontrol ederek bunu onaylayın.
   NOT: Tohumlama yoğunluğu kritiktir ve 6,5 mm hücre kültürü eki başına 160.000-300.000 hücre arasında değişen optimizasyon gerektirebilir. Calcein yeşili (bakınız Malzeme Tablosu) hücre geçirgen boyası hücrelere eklenebilir ve tohumlamadan sonra hücreleri görselleştirmek için ters çevrilmiş bir floresan mikroskopta görüntülenebilir.
5. Her hücre kültürü ekinin bazolateral bölmesine 500 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 ekleyin.
6. ALI'yi başlatmak için bir pipet kullanarak tohumlamadan sonra apikal CK + DCI + 10 μM Y-27632 orta 48 saat aspire edin ("hava asansörü" olarak bilinir).
   NOT: Bu noktada hücreler% 100 akıcı olmalıdır. Hücreler% 100 birleşik değilse, Adım 3.7-3.8 hala belirtilen zaman noktalarında gerçekleştirilmelidir; birleşik hücre monokatmanlarının oluşması daha uzun sürebilir.
7. 72 saat sonra Y-27632 ortamının bazolateral CK + DCI + 10 μM'sini 10 μM Y-27632 olmadan CK + DCI olarak değiştirin.
   NOT: Apikal tarafa minimum düzeyde "sızıntı" olmalıdır. Bununla birlikte, bu ilk birkaç gün içinde meydana gelirse, daha fazla sızıntı kalmayana kadar apikal tarafı günlük olarak aspire etmeye devam edin.
8. Bazolateral ortamı her 48-72 saatte bir taze CK + DCI ile değiştirin.
   NOT: ALI kültürlerinde kullanılan iAT2'ler, kaplamadan sonraki 5-14 günde maksimum olarak olgunlaştırılır.
9. Daha uzun süreli deneyler için, gerekirse hücreleri kaplama sonrası 28 güne kadar dikkatli bir izleme ile koruyun.
   NOT: Hücrelerin kesici ucun kenarından soyulması veya tek katmanda deliklerin oluşması gibi ALI başarısızlığının görünür belirtileri, kültürde aşırı uzun bir süre sonra gözlemlenebilir, bu noktada ALI artık deneyler için kullanılamaz.

Sonuçlar

iAT2'ler tek hücreli bir süspansiyona geçirildi ve daha sonra ALI kültürü için hücre kültürü ekleri üzerinde 3D matriste veya 2D olarak yeniden kaplandı (Şekil 1). Tek hücreli ayrışmadan sonra, iAT2'ler akış sitometrisi ile analiz edildi. Kısaca, kalsein mavisi canlılık boyası (1:1000) ile fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 1 fetal sığır serumunda (FBS) yeniden askıya alınan hücreler, fragman olmayanlar, singletlar ve tdTomato'lar için geçit olan bir akış sitometresinde analiz edildi. Burada, örnek olarak, kültürde zaman içinde AT2 programının görselleştirilmesi ve izlenmesi kolaylığı için endojen SFTPC lokusunu hedefleyen bir tdDomates muhabirine sahip olan SPC2 hattı (SPC2-ST-B2 klon²⁰) bulunmaktadır (Şekil 2A). iAT2 SFTPC-tdDomates ifadesi, 3B matriste küreler halinde yeniden kaplandığında (Şekil 2B) ve hücre kültürü eklerine kaplandığında (Şekil 2C) korunmuştur. Transepitelyal elektrik direnci (TEER), ALI kültürünün bütünlüğünü belirlemek için ölçülebilir (Şekil 2D). TEER'i ölçmek için, apikal odaya 100 μL CK + DCI ortamı eklenmiş bir voltohmmetre kullanıldı (Malzeme Tablosuna bakınız). Tohumlanmış hücrelerin yokluğunda Matrigel ile kaplanmış hücre kültürü ekleri boşluk olarak muamele edildi. Her kuyuda üç yerde okumalar yapıldı.

Şekil 1: Protokol iş akışının şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Protokolün temsili sonuçları. (A) 3D olarak kültürlenmiş insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı tip 2 alveoler epitel benzeri hücrelerde (iAT2'ler) SFTPC-tdDomates için temsili akış sitometrisi sonuçları. Gösterilen negatif kontrol akciğer dışı endodermdir (CD47lo). (B) Geçişten sonraki çeşitli günlerde (dpp) 3D olarak kültürlenen iAT2'lerin temsili canlı hücre görüntülemesi (SFTPC-tdDomates, ölçek çubuğu = 50 μm). (C) Hava-sıvı arayüzünde kaplanmış iAT2'lerin temsili canlı hücre görüntülemesi (SFTPC-tdDomates, ölçek çubuğu = 500 nm). (D) Hava-sıvı arayüzünde kaplanmış iAT2'lerin temsili transepitelyal elektriksel direnci. n = 3, hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Reaktif	500 mL için hacim	Son konsantrasyon
Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortamı (IMDM)	375 mL	75%
Ham'ın F-12 Besin Karışımı (F12)	125 mL	25%
B-27 (RA ile) takviyesi	5 mL	1%
N-2 takviyesi	2,5 mL	0.50%
BSA (%7.5 stok)	3,3 mL	0.05%
Primosin (50 mg/mL stok)	1 mL	100 μg/mL
Glutamax (100x stok)	5 mL	1 adet
Askorbik Asit (50 mg/mL stok)	500 μL	50 μg/mL
1-Tiyogliserol (MTG) (2 mL IMDM'de 26 μL'den)	1,5 mL	4,5 x 10-4 M

Tablo 1: Serumsuz farklılaşma ortamının (cSFDM) bileşimi.

Reaktif	Son konsantrasyon
CHIR99021	3 μM
rhKGF	10 ng/mL
Deksametazon	50 nM
8-bromoadenozin 30,50-siklik monofosfat sodyum tuzu (cAMP)	0,1 mM
3-İzobütil-1-metilksantin (IBMX)	0,1 mM

Tablo 2: CK + DCI ortamının bileşimleri.

Tartışmalar

AT2'ler akciğer homeostazını korur ve bu anahtar alveoler hücrelerin işlev bozukluğu çeşitli akciğer hastalıklarına hem neden olabilir hem de bunlardan kaynaklanabilir. Birincil insan AT2'lerine erişmenin ve izole etmenin zorluğu nedeniyle, iAT2'ler üretilir. Başka bir yerde açıklanan yönlendirilmiş farklılaşma yöntemleri²⁵ ve burada açıklanan genişleme ve hücre tohumlaması uygulanarak, herhangi bir bireyden üretilen iPSC'ler, sağlam bir şekilde kendi kendini yenileyen iAT2'lere ayırt edilebilir, böylece temel biyomedikal araştırma geliştirme çalışmaları, hastalık modellemesi, hücre bazlı tedaviler veya ilaç ekranları dahil olmak üzere biyomedikal araştırmalar için hastaya özgü hücreler sağlanır. Mevcut protokol, iAT2'leri tek hücreli bir süspansiyona ayırmak için bir yöntemi detaylandırır, bu daha sonra hücre genişlemesi için alveolosferler üretmek üzere 3D Matrigel'de yeniden kaplanabilir veya daha ileri deneyler için 2D ALI kültüründe yeniden kaplanabilir.

Protokolün hem 3D hem de ALI kültürlerinde başarılı bir şekilde geçiş ve yeniden kaplama sağlamak için birkaç kritik adımı vardır. Mekanik tritürasyon en aza indirilmelidir, çünkü aşırı pipetleme hücre canlılığını azaltabilir. Ek olarak, iAT2'lerin hem 3D hem de 2D ALI kültürlerinde tohumlama yoğunluğu kritik öneme sahiptir; 3D kültür için, genel olarak, 400 hücre / μL 3D Matrigel çoğu iPSC hattı için idealdir. Bununla birlikte, 100-500 hücre / μL arasında bir yoğunluk aralığı zaman zaman başarılı olmuştur ve yoğunluğu optimize etmek farklı hücre hatları için gerekli olabilir. ALI kültürü için, iAT2'lerin hücre kültürü ekleri üzerindeki tohumlama yoğunluğunu optimize etmek, tohumlamadan 48 saat sonra (yani, hava kaldırma gününde) birleştirilmiş bir tek katmanlı hücre elde etmek için de gereklidir. Bazı iAT2 satırları kesici uç başına daha fazla hücre gerektirir; bu nedenle, sorun giderme gerekiyorsa, 24 delikli hücre kültürü ekleri için 160.000-300.000 hücre/ekleme aralığı önerilir. 3D kültürler ayrıca, tohumlama yoğunluğunu 400 hücre / μL 3D matriste tutarak ve matris damlacık boyutunu sırasıyla 25 μL ve 20 μL'ye düşürerek 24 ve 48 kuyucuklu plakalara ölçeklendirilebilir. ALI kültürleri, her bir kesici ucu matrisin 30 μL'si ile kaplayarak, kesici uç başına 30 μL'de 80.000 hücreyi kaplayarak ve kuyu başına 150 μL bazolateral medya ile beslenerek 96 delikli hücre kültürü eklerine ölçeklendirilebilir. Tohumlama yoğunluğu ve matris ve ortam hacimlerinin diğer plaka formatları için uygun şekilde ölçeklendirilmesi ve optimize edilmesi gerekir.

Bu protokolün bir sınırlaması, ALI kaplaması için kullanılan hücrelerin iAT2 ALI'leri oluşturmak için NKX2-1 + ve SFTPC + ^19,20,21,23 olacak kadar saflaştırılması gerektiğidir ve ALI kültürü oluşumu hattan satıra değişebilir. Ek olarak, bu protokol yalnızca AT2 kültürlerinin genişlemesine ve üretilmesine izin verir ve tek bir anahtar alveolar hücre tipine dayanan indirgemeci bir model sistemi sağlar. Önemli olarak, alveolar tip 1 hücreler gibi diğer ilgili alveolar hücre tipleri bu platformlardan eksikti. Diğer gruplar, birincil insan AT2'lerini fibroblastlı veya fibroblastsız sferoidler veya organotipik kültürler olarak kültürlemede başarılı olmuşlardır 1,14,15,16,17; Bununla birlikte, birincil insan AT2'leri, ALI koşulları²⁶ olmadan normal 2D kültürde kültürlendiğinde anahtar yüzey aktif maddelerin ekspresyonunu kaybetme eğilimindedir. Ayrıca, son zamanlarda yapılan çalışmalar, iAT2'lerin taze, kültürsüz insan birincil AT2s^27'den daha yüksek proliferatif belirteçler ve daha düşük AT2 olgunlaşma belirteçleri ifade ettiğini göstermiştir. iAT2'ler ve taze birincil insan AT2'leri arasındaki bu farklılıklara rağmen, kültürlenmiş birincil AT2'lerin bile taze, kültürlenmemiş birincil AT2'lerden transkriptomik farklılıklar gösterdiğini ve böylece bu in vitro modellerin in vivo akciğer biyolojisini modellemek için çeşitli güçlü yönlere ve sınırlamalara sahip olduğu sonucuna vardık.

iAT2 platformu, hasta kaynaklı iPSC'lerden^19,20 genetik mutasyonları incelemek için uygulanabilir. Sistem ayrıca, yüksek verimli ilaç taramasına uyum sağlamak için büyük ölçüde ölçeklendirilebilir. Ek olarak, iAT2 ALI'ler viral veya bakteriyel enfeksiyon veya sigara dumanına, e-sigara buharına veya diğer aerosollere maruz kalma gibi çevresel maruziyetler için uygundur²³. Özetle, iAT2'lerin hem 3D hem de 2D ALI kültürlerini oluşturmak için kullanılan bu protokol, hastalıkla ilgili bir hücre tipinin uzun vadeli kültürüne izin verir ve bu hücrelerin birçok uygulamada kullanılmasını sağlayan fizyolojik, ölçeklenebilir bir platform sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I5879	For CKDCI
12 Well Cell Culture Plate	Corning	3513	Plates for culturing
1-Thioglycerol (MTG)	M6145	Sigma	For CKDCI
2D Matrigel (matrix) - Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	8774552	To coat ALI Transwells
3D Matrigel (matrix) - Growth Factor Reduced Matrigel	Corning	356230	To grow iAT2 spheres in
8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP)	Sigma	B7880	For CKDCI
Ascorbic Acid	A4544	Sigma	For CKDCI
B27 w/out retinoic acid	Life Technologies	12587-010	For CKDCI
Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%)	Thermo Fisher	15260037	For CKDCI
Calcein blue	Life Technologies	C1429	For live/dead discrimination in flow cytometry
Calcein green	Life Technologies	C1430	Optional visualisation of cells on cell culture insert
Cell culture inserts - Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size	Millipore-Sigma	CLS3470-48EA	ALI transwells
CHIR99021	Tocris	4423	For CKDCI
Dexamethasone	Sigma	D4902	For CKDCI
Dispase (2 mg/mL)	Thermo Fisher	354235	To dissolve matrigel
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher	11995	To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM)
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Thermo Fisher	A4192002	To wash
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher	14190	For flow cytometric analyses
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized)	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM)
Glutamax	Life Technologies	35050-061	For CKDCI
Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12)	Cellgro	10-080-CV	For CKDCI
Hemocytometer	Fisher	02-671-6	For cell counting
Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL)	Fisher Scientific	NC9392943	For CKDCI
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053	For CKDCI
Millicell ERS-2 Voltohmeter	Millipore	MERS00002	To measure trans-epithlial electrical resistance
N2 supplement	Life Technologies	17502-048	For CKDCI
Recombinant human KGF	R&D Systems	251-KG-010	For CKDCI
Retinoic acid	Sigma	R2625	For CKDCI
Trypan blue	Thermo Fisher	15250061	For cell count during passaging
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25-300-062	To dissociate iAT2 spheres
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Add to cells after passaging