Erzeugung von 3D-Kugeln und 2D-Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen von humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten alveolären Epithelzellen vom Typ 2

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete alveoläre Epithel-ähnliche Zellen (iAT2s) vom Typ 2. Diese Zellen können als selbsterneuernde Kugeln in 3D-Kultur kultiviert oder an die Luft-Flüssigkeits-Interface-Kultur (ALI) angepasst werden.

Zusammenfassung

In der Lunge ist das Alveolarepithel eine physikalische Barriere gegen Umweltreize und spielt eine wesentliche Rolle bei Homöostase und Erkrankungen. Typ 2 alveoläre Epithelzellen (AT2s) sind die fakultativen Vorläufer des distalen Lungenepithels. Funktionsstörungen und Verletzungen von AT2s können von verschiedenen Lungenerkrankungen herrühren und dazu beitragen. Ein besseres Verständnis der AT2-Biologie ist daher entscheidend für das Verständnis der Lungenbiologie und -krankheit; Primäre menschliche AT2 sind jedoch im Allgemeinen schwer zu isolieren und in der Versorgung begrenzt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, können humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete Typ 2 alveoläre Epithelzellen (iAT2s) durch ein gerichtetes Differenzierungsprotokoll erzeugt werden, das die In-vivo-Lungenentwicklung rekapituliert. iAT2s wachsen unter feederfreien Bedingungen, teilen sich ein transkriptomisches Programm mit menschlichen primären AT2s für Erwachsene und führen Schlüsselfunktionen von AT2s wie Produktion, Verpackung und Sekretion von Tensiden aus. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Aufrechterhaltung selbsterneuernder iAT2s durch serielles Passieren in dreidimensionaler (3D) Kultur oder Anpassung von iAT2s an die Luft-Flüssigkeits-Schnittstelle (ALI)-Kultur. Eine Einzelzellsuspension von iAT2s wird vor der Beschichtung in einer 3D-Solubilisierungsmembranmatrix (im Folgenden als "Matrix" bezeichnet) erzeugt, wo sie sich selbst zu einschichtigen Epithelkugeln zusammensetzen. iAT2s in 3D-Kultur können seriell in Einzelzellsuspensionen dissoziiert werden, um in 2D-ALI-Kultur durchgelassen oder plattiert zu werden. In der ALI-Kultur bilden iAT2s eine polarisierte Monoschicht, wobei die apikale Oberfläche der Luft ausgesetzt ist, wodurch diese Plattform leicht für Umwelteinflüsse zugänglich ist. Daher erzeugt dieses Protokoll einen unerschöpflichen Vorrat an iAT2s und produziert mehr als 1 x 10³⁰ Zellen pro Eingangszelle über 15 Passagen unter Beibehaltung des AT2-Programms, das durch^{SFTPC tdTomato-Expression} angezeigt wird. Die resultierenden Zellen stellen eine reproduzierbare und relevante Plattform dar, die angewendet werden kann, um genetische Mutationen zu untersuchen, Umweltexpositionen zu modellieren oder Medikamente zu screenen.

Einleitung

In der Lunge sind die Atemwege und die Alveolarepithelzellen die ersten, die inhalativen Umweltbelastungen ausgesetzt sind, einschließlich Krankheitserregern, die über inhalative Aerosole und schädliche Reize wie Zigarettenrauch übertragen werden. Typ 2 Alveolarepithelzellen (AT2s) sind für die Aufrechterhaltung der Lungenhomöostase unerlässlich, da sie die fakultativen Vorläufer des distalen Lungenepithels sind, Tenside zur Linderung der alveolären Oberflächenspannung produzieren und die angeborene Immunantwort auf inhalative Expositionen aufbauen ^1,2. AT2-Dysfunktion kann jedoch aus Lungenverletzungen oder Mutationen in Genen resultieren, die selektiv in AT2s exprimiert werden, wie SFTPC, SFTPB und ABCA3 3,4,5. Bisherige Ansätze zur Untersuchung dieser genetischen Mutationen stützten sich auf Mausmodelle⁶ oder konstruierte, mutationshaltige Vektoren, die in unsterbliche Zelllinien⁷ eingeführt wurden. Daher werden Plattformen benötigt, die die Auswirkungen genetischer und umweltbedingter Störungen auf AT2s in den physiologisch relevanten Zelltypen und in einem produktiven In-vitro-System modellieren können, um die Rolle von AT2 für Gesundheit und Krankheit besser zu verstehen.

In Bezug auf die Modellierung von Luftexpositionen wurden Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen (ALI) von primären Atemwegsepithelzellen erfolgreich eingesetzt, um wichtige molekulare Reaktionen auf Zigarettenrauch⁸ aufzudecken und eine Atemwegsinfektion zu modellieren ^9,10. Ein vergleichbares ALI-Kultursystem für das Alveolarepithel, eine Schlüsselstelle der Infektion oder Verletzung von Krankheiten, ist im Vergleich zum Atemwegsepithelmodellsystem viel weniger entwickelt. Immortalisierte Zelllinien wurden bei ALI als Stellvertreter für das Alveolarepithel^11,12 kultiviert, aber diese Zelllinien unterscheiden sich transkriptomisch von primären alveolären Epithelzellen 13 und haben keine wichtige zelluläre Maschinerie, wie die Fähigkeit^, Tenside abzusondern oder Engstellen bei ALI ¹² zu bilden. Primäre menschliche AT2s können in Gegenwart von Fibroblasten ^1,14 in 3D-Kugeln kultiviert werden, unterliegen jedoch Einschränkungen, einschließlich der begrenzten Zugänglichkeit von explantierten Lungen und ihrer Tendenz, den zellulären Phänotyp in den meisten Kulturen zu seneszieren oder zu verlieren. Diese Merkmale stellen Hindernisse für die weit verbreitete Einführung primärer AT2-In-vitro-Studien dar, obwohl in jüngster Zeit Fortschritte bei der Optimierung von feederfreien 3D-Kulturen für die Expansion von primären AT2s^15,16,17,18 erzielt wurden.

Gerichtete Differenzierungsprotokolle wurden entwickelt, um in vivo Entwicklungsmeilensteine zu rekapitulieren, um humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC)-abgeleitete Typ 2 alveoläre Epithelzellen (iAT2s)¹⁹ zu erzeugen. iAT2s wachsen als selbsterneuernde Kugeln in 3D-serumfreier Kultur in einem definierten Medium, das CHIR99021, KGF, Dexamethason, cAMP und 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) enthält, genannt "CK + DCI"¹⁹, in Abwesenheit von Fibroblasten-Feedern und können für >20 Passagen^20,21 kultiviert werden. Darüber hinaus teilen sich iAT2s ein transkriptomisches Programm mit menschlichen primären AT2s für Erwachsene, bilden lamellare Körper und produzieren und verpacken Tensid ^19,21,22. Dieses Protokoll beschreibt die serielle Übertragung von iAT2s, indem die Zellen zu einer Einzelzellensuspension dissoziiert werden. An dieser Stelle können iAT2s in 3D-Kultur neu plattiert und erweitert oder in 2D-ALI-Kultur²³ plattiert werden. Diese Methoden können verwendet werden, um die intrinsische Biologie von AT2s in Homöostase und Krankheit 20,22 zu untersuchen und die Wirkungen von Verbindungen oder Reizen in einer skalierbaren, physiologisch relevanten Plattform^23,24 zu untersuchen^, wie zuvor gezeigt wurde.

Protokoll

Alle Experimente zur Differenzierung menschlicher iPSC-Linien wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Review Board der Boston University (Protokoll H33122) durchgeführt. Die dermalen Fibroblasten, die für die Reprogrammierung zu iPSCs beschafft wurden, wurden von einem Spender mit schriftlicher Einverständniserklärung unter Genehmigung des Human Research Protection Office der Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, erhalten. Reprogrammierte iPS-Zellen wurden am Zentrum für Regenerative Medizin der Boston University und am Boston Medical Center, Boston, MA, erzeugt.

1. Dissoziation der Alveolosphäre

1. Es werden vollständige serumfreie Differenzierungsmedien (cSFDM) gemäß der in Tabelle 1 genannten Zusammensetzung hergestellt.
2. Bereiten Sie CK + DCI-Medien in der vorbereiteten cSFDM-Basis gemäß Tabelle 2 vor.
3. Tauwetter Sie 2D- (humane embryonale Stammzell-qualifizierte) und/oder 3D-Matrix (wachstumsfaktorreduziert) auf Eis, je nach Bedarf für die experimentellen Bedürfnisse.
4. Absaugen Sie das gesamte CK + DCI-Medium mit einer Pipette oder einer Ansaugpipette mit Vakuum aus den 3D-Matrixtröpfchen, die Alveolosphären enthalten, abgeleitet von der gerichteten Differenzierung¹⁹, in einer 12-Well-Platte.
5. Fügen Sie 1 ml Dispase (2 mg / ml) pro Tröpfchen hinzu. Pipetten Sie den Tröpfchen vorsichtig mit einer P1000-Pipette in die Dispase. Bei 37 °C für 1 h inkubieren und nach 30 min einmal auf und ab pipettieren.
6. Die dissoziierten Organoide (aus Schritt 1.5) werden von einem Matrixtröpfchen in der Dispase in ein 15 ml konisches Röhrchen übertragen. Zum Waschen fügen Sie 10 ml Modified Dulbecco's Medium von Iscove hinzu (IMDM, siehe Materialtabelle).
7. Zentrifüchte bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette oder einer Ansaugpipette mit Vakuum ab, wobei so wenig Überstand wie möglich verbleibt.
   HINWEIS: Es ist wichtig, alle Dispase zu entfernen, da jede verbleibende Dispase die Matrix auflösen kann, in die die Zellen anschließend gesät werden. Wenn ein klarer Dunst über dem Pellet zu sehen ist, hat die Dispase die Matrix nicht vollständig aufgelöst, und dem Pellet kann für weitere 20-30 min bei 37 ° C mehr Dispase hinzugefügt werden.
8. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 0,05% Trypsin pro Tröpfchen und übertragen Sie zurück auf die 12-Well-Platte. Bei 37 °C für 12-15 min inkubieren. Beobachten Sie die Dissoziation unter einem Mikroskop. Vermeiden Sie es, die Zellen in diesem Stadium zu überpipettieren.
   HINWEIS: Am Ende der Inkubation müssen die Zellen eine Einzelzellsuspension erreichen, nachdem sie 3-5 Mal mit einer P1000-Pipette pipettiert wurden. Für die Weitergabe von iAT2s an ALI (Schritt 3) muss die Trypsinisierungszeit minimiert werden (maximal 12 min), so dass sich die Zellen in 2-3-Zell-Klumpen und nicht in Einzelzellsuspension befinden, wenn sie für die Beschichtung auf den Zellkultureinsatz bereit sind.
9. Stoppen Sie die Wirkung von Trypsin mit einem gleichen Volumen an FBS-haltigem Medium (10% ES-qualifiziertes FBS in DMEM). Zentrifüchte bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
10. Waschen Sie die Zellen mit 10 ml IMDM. Zentrifüchte bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
11. Suspendieren Sie die Zellen in einem geeigneten Volumen für die Zählung und zählen Sie dann die Zellen mit einem Hämozytometer (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Von einem konfluierenden 50-μL-Matrixtröpfchen, das mit 400 Zellen / μL ausgesät ist, beträgt der erwartete Ertrag 500.000 bis 1,5 x 10⁶ Zellen pro Tröpfchen.
12. Verwenden Sie die Einzelzellsuspension von iAT2-Zellen, um Alveolosphären durch Plattieren in der 3D-Matrix (Schritt 2) und/oder Plattieren auf Zellkultureinsätzen für die ALI-Kultur (Schritt 3) zu erzeugen.

2.3D Beschichtung von iAT2s

1. Bestimmen Sie nach dem Zählen (Schritt 1.11) die Anzahl der gewünschten Zellen, die in der 3D-Matrix neu beschichtet werden sollen (400 Zellen/μL der Matrix mit 50-100 μL 3D-Matrixtröpfchen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte). Zentrifen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich mit einer Pipette.
2. Suspendieren Sie die Zellen in der 3D-Matrix. Resuspendieren Sie bei Bedarf schnell und auf Eis, um zu verhindern, dass die Matrix polymerisiert (was beim Erwärmen auftritt).
3. Verwenden Sie eine P200-Pipette, um einen 3D-Matrixtropfen pro Vertiefung in eine vorgewärmte 12-Well-Platte zu dosieren. Pipette vorsichtig, um Blasen im Matrixtröpfchen zu vermeiden. Lassen Sie nicht zu, dass sich die Zellsuspension bei der Abgabe mehrerer Tröpfchen absetzt.
4. Legen Sie die Platte für 20-30 Minuten in einen 37 ° C-Inkubator, damit die Matrixtröpfchen polymerisieren können.
5. Fügen Sie 1 ml CK + DCI + 10 μM Y-27632-Medium (siehe Materialtabelle) pro Vertiefung hinzu, um das Matrixtröpfchen abzudecken.
6. Wechseln Sie nach 72 h auf CK + DCI ohne 10 μM Y-27632.
7. Ersetzen Sie das Medium alle 48-72 h durch frisches CK + DCI.
   HINWEIS: iAT2s müssen in der Regel etwa alle 10-14 Tage durchlaufen werden, abhängig von der Zelllinie und der Beschichtungsdichte.

3. Weitergabe von iAT2s an ALI

1. Bereiten Sie frisch beschichtete 6,5-mm-Zellkultureinsätze 1 h vor der Verwendung vor, indem Sie die 2D-Matrix in Dulbeccos modifizierter Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) gemäß den Anweisungen des Herstellers für die 2D-Matrix (siehe Materialtabelle) zu einer Arbeitslösung verdünnen. Fügen Sie dann 100 μL der verdünnten Matrix pro 6,5 mm Zellkultureinsatz hinzu. Lassen Sie die Matrix in einem 37 °C Inkubator für 30 Minuten oder bei Raumtemperatur für 1 h polymerisieren.
2. Die überschüssige Matrix aus den Zellkultureinsätzen mit einer Pipette oder einer Ansaugpipette mit Vakuum absaugen und einmal mit DMEM/F12 abspülen. Saugen Sie diese Wäsche unmittelbar vor dem Hinzufügen der Zellen ab.
3. Bestimmen Sie nach dem Zählen die Anzahl der erforderlichen Zellen, um die gewünschte Anzahl von Zellen in den Kultureinsätzen zu säen (520.000 lebende Zellen/cm², entsprechend 172.000 lebende Zellen pro 6,5 mm Zellkultureinsatz). Zentrifen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich.
4. Resuspendieren Sie die Zellen im entsprechenden Volumen mit 100 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 pro Zellkultureinsatz (Zellsuspension sollte 1.720 Zellen/μL betragen). 100 μL in das apikale Kompartiment des Zellkultureinsatzes geben. Rühren Sie die Platte vorsichtig in einem Kreuzmuster, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen über den Zellkultureinsatz zu gewährleisten, und bestätigen Sie dies, indem Sie unter einem Mikroskop auf 4x Objektiv überprüfen.
   HINWEIS: Die Aussaatdichte ist kritisch und erfordert möglicherweise eine Optimierung, die von 160.000 bis 300.000 Zellen pro 6,5 mm Zellkultureinsatz reicht. Calceingrün (siehe Tabelle der Materialien) zelldurchlässiger Farbstoff kann den Zellen zugesetzt und auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden, um die Zellen nach der Aussaat sichtbar zu machen.
5. 500 μL CK + DCI + 10 μM Y-27632 in das basolaterale Kompartiment jedes Zellkultureinsatzes geben.
6. Aspirationsapikales CK + DCI + 10 μM Y-27632 mittel 48 h nach der Aussaat mit einer Pipette zur Initiierung von ALI (bekannt als "Lufttransport").
   HINWEIS: Die Zellen sollten zu diesem Zeitpunkt zu 100% konfluent sein. Wenn die Zellen nicht zu 100% konfluent sind, sollten die Schritte 3.7-3.8 immer noch zu den angegebenen Zeitpunkten durchgeführt werden. Die Bildung konfluenter Zellmonoschichten kann länger dauern.
7. Ändern Sie das basolaterale CK + DCI + 10 μM des Y-27632-Mediums nach 72 h in CK + DCI ohne 10 μM Y-27632.
   HINWEIS: Es sollte minimal, wenn überhaupt, "Leck" von Medium auf die apikale Seite geben. Wenn dies jedoch in den ersten Tagen der Fall ist, aspirieren Sie die apikale Seite täglich weiter, bis keine weitere Leckage auftritt.
8. Ersetzen Sie das basolaterale Medium alle 48-72 h durch frisches CK + DCI.
   HINWEIS: Die in ALI-Kulturen verwendeten iAT2s sind maximal 5-14 Tage nach der Beschichtung gereift.
9. Pflegen Sie die Zellen mit sorgfältiger Überwachung für bis zu 28 Tage nach der Beschichtung, falls erforderlich, für längeres Experimentieren.
   HINWEIS: Sichtbare Anzeichen eines ALI-Versagens, wie das Abschälen der Zellen vom Rand des Inserts oder die Bildung von Löchern in der Monoschicht, können nach einer überlangen Zeit in der Kultur beobachtet werden, zu welchem Zeitpunkt der ALI nicht mehr für Experimente verwendbar ist.

Ergebnisse

Die iAT2s wurden in eine Einzelzellsuspension überführt und dann in 3D-Matrix oder in 2D auf Zellkultureinsätzen für die ALI-Kultur neu plattiert (Abbildung 1). Nach der Einzelzelldissoziation wurden die iAT2s mittels Durchflusszytometrie analysiert. Kurz gesagt, die Zellen, die in 1% fetalem Rinderserum (FBS) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit calcinblauem Viabilitätsfarbstoff (1:1000) resuspendiert wurden, wurden auf einem Durchflusszytometer, Gating für Nicht-Fragmente, Singulette und tdTomato analysiert. Hier als Beispiel ist die SPC2-Linie (SPC2-ST-B2-Klon 20), die einen tdTomato-Reporter hat, der auf den endogenen SFTPC-Locus ausgerichtet ist, um die Visualisierung und Verfolgung des AT2-Programms im Laufe der Zeit in Kultur zu erleichtern (Abbildung 2A). Der iAT2 SFTPC-tdTomato-Ausdruck wurde beibehalten, wenn er in der 3D-Matrix als Kugeln neu plattiert wurde (Abbildung 2B) und wenn er auf Zellkultureinsätzen plattiert wurde (Abbildung 2C). Der transepitheliale elektrische Widerstand (TEER) kann gemessen werden, um die Integrität der ALI-Kultur zu bestimmen (Abbildung 2D). Zur Messung von TEER wurde ein Voltrohmenmessgerät verwendet (siehe Materialtabelle), wobei der apikalen Kammer 100 μL CK + DCI-Medium hinzugefügt wurden. Die Zellkultureinsätze, die in Abwesenheit von ausgesäten Zellen mit Matrigel beschichtet waren, wurden als Rohlinge behandelt. Die Messwerte wurden an drei Stellen in jedem Brunnen durchgeführt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Protokollworkflows. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse des Protokolls. (A) Repräsentative Durchflusszytometrieergebnisse für SFTPC-tdTomato in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten alveolären Epithel-ähnlichen Zellen (iAT2s), die in 3D kultiviert wurden. Die gezeigte Negativkontrolle ist ein Nicht-Lungenendoderm (CD47lo). (B) Repräsentative Lebendzellbildgebung von in 3D kultivierten iAT2s an verschiedenen Tagen nach der Passage (dpp) (SFTPC-tdTomato, Skalenbalken = 50 μm). (C) Repräsentative Lebendzellbildgebung von iAT2s, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche plattiert sind (SFTPC-tdTomato, Skalenbalken = 500 nm). (D) Repräsentativer transepithelialer elektrischer Widerstand von iAT2s, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche plattiert sind. n = 3, Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Reagenzien	Volumen für 500 ml	Endkonzentration
Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM)	375 ml	75%
Schinken F-12 Nährstoffmischung (F12)	125 ml	25%
B-27 (mit RA) Ergänzung	5 ml	1%
N-2 Ergänzung	2,5 ml	0.50%
BSA (7,5% Lagerbestand)	3,3 ml	0.05%
Primocin (50 mg/ml Brühe)	1 ml	100 μg/ml
Glutamax (100x Lagerbestand)	5 ml	1x
Ascorbinsäure (50 mg/ml Vorrat)	500 μL	50 μg/ml
1-Thioglycerin (MTG) (ab 26 μL in 2 mL IMDM)	1,5 ml	4,5 x 10-4 m

Tabelle 1: Zusammensetzung des vollständigen serumfreien Differenzierungsmediums (cSFDM).

Reagenz	Endkonzentration
CHIR99021	3 μM
rhKGF	10 ng/ml
Dexamethason	50 nM
8-Bromoakenosin 30,50-cyclisches Monophosphat-Natriumsalz (cAMP)	0,1 mM
3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)	0,1 mM

Tabelle 2: Zusammensetzungen der CK + DCI-Medien.

Diskussion

AT2s erhalten die Lungenhomöostase, und eine Funktionsstörung dieser wichtigen Alveolarzellen kann verschiedene Lungenerkrankungen verursachen und daraus resultieren. Aufgrund der Schwierigkeit, auf primäre menschliche AT2s zuzugreifen und sie zu isolieren, werden iAT2s erzeugt. Durch die Anwendung der an anderer Stelle beschriebenen gerichteten Differenzierungsmethoden²⁵ und der hier beschriebenen Expansion und Zellaussaat können aus jedem Individuum erzeugte iPS-Zellen in robust selbsterneuernde iAT2s differenziert werden, wodurch patientenspezifische Zellen für die biomedizinische Forschung bereitgestellt werden, einschließlich grundlegender biomedizinischer Forschungsentwicklungsstudien, Krankheitsmodellierung, zellbasierter Therapien oder Arzneimittelscreenings. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Dissoziation von iAT2s zu einer Einzelzellsuspension, die dann in 3D-Matrigel neu plattiert werden kann, um Alveolosphären für die Zellexpansion zu erzeugen, oder in 2D-ALI-Kultur für weitere Experimente neu plattiert werden kann.

Das Protokoll umfasst mehrere wichtige Schritte, um eine erfolgreiche Weitergabe und Neuplattierung sowohl in 3D- als auch in ALI-Kulturen sicherzustellen. Mechanische Verreibungen müssen minimiert werden, da übermäßiges Pipettieren die Lebensfähigkeit der Zellen verringern kann. Darüber hinaus ist die Seeding-Dichte von iAT2s sowohl in 3D- als auch in 2D-ALI-Kulturen von entscheidender Bedeutung. Für die 3D-Kultur sind im Allgemeinen 400 Zellen / μL 3D-Matrigel für die meisten iPSC-Linien optimal. Ein Bereich von Dichten von 100-500 Zellen / μL war jedoch manchmal erfolgreich, und eine Optimierung der Dichte kann für verschiedene Zelllinien erforderlich sein. Für die ALI-Kultur ist die Optimierung der Aussaatdichte von iAT2s auf den Zellkultureinsätzen ebenfalls unerlässlich, um eine konfluierende Monoschicht von Zellen 48 h nach der Aussaat (d.h. am Tag der Luftbrücke) zu erreichen. Einige iAT2-Zeilen erfordern mehr Zellen pro Einfüge. Wenn also eine Fehlerbehebung erforderlich ist, wird ein Bereich von 160.000-300.000 Zellen / Einsatz für 24-Well-Zellkultureinsätze empfohlen. 3D-Kulturen können auch auf 24- und 48-Well-Platten skaliert werden, indem die Aussaatdichte bei 400 Zellen / μL der 3D-Matrix beibehalten und die Matrixtröpfchengröße auf 25 μL bzw. 20 μL reduziert wird. ALI-Kulturen können auf 96-Well-Zellkultur-Inserts skaliert werden, indem jeder Einsatz mit 30 μL der Matrix beschichtet, 80.000 Zellen in 30 μL pro Einsatz plattiert und mit 150 μL basolateralen Medien pro Vertiefung gefüttert wird. Die Aussaatdichte sowie die Matrix- und Medienvolumina müssen entsprechend für andere Plattenformate skaliert und optimiert werden.

Eine Einschränkung dieses Protokolls besteht darin, dass die für die ALI-Beschichtung verwendeten Zellen ausreichend gereinigt sein müssen, um NKX2-1 + und SFTPC + ^19,20, ^21,23 zu sein, um iAT2-ALI zu bilden^, und die ALI-Kulturbildung kann von Zeile zu Linie variieren. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll die Erweiterung und Generierung von AT2-only-Kulturen und bietet ein reduktionistisches Modellsystem, das auf einem einzigen alveolären Zelltyp basiert. Wichtig ist, dass andere relevante alveoläre Zelltypen, wie z.B. alveoläre Typ-1-Zellen, auf diesen Plattformen fehlten. Andere Gruppen hatten Erfolg bei der Kultivierung von primären menschlichen AT2s als Sphäroide oder organotypische Kulturen mit oder ohne Fibroblasten 1,14,15,16,17; Primäre menschliche AT2s neigen jedoch dazu, ihre Expression von Schlüsseltensiden zu verlieren, wenn sie in normaler 2D-Kultur ohne ALI-Bedingungen kultiviert werden²⁶. Darüber hinaus haben jüngste Arbeiten gezeigt, dass iAT2s höhere proliferative Marker und niedrigere AT2-Reifungsmarker exprimieren als frische, unkultivierte menschliche primäre AT2s²⁷. Trotz dieser Unterschiede zwischen iAT2s und frischen primären menschlichen AT2s fanden wir heraus, dass selbst kultivierte primäre AT2s transkriptomische Unterschiede zu frischen, unkultivierten primären AT2s²⁷ aufwiesen, und folgerten daher, dass diese In-vitro-Modelle verschiedene Stärken und Einschränkungen für die Modellierung der In-vivo-Lungenbiologie aufweisen.

Die iAT2-Plattform kann angewendet werden, um genetische Mutationen von patientenabgeleiteten iPS-Zellen^19,20 zu untersuchen. Das System könnte auch erheblich skaliert werden, um ein Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz zu ermöglichen. Darüber hinaus eignen sich iAT2 ALIs für Umwelteinflüsse wie virale oder bakterielle Infektionen oder die Exposition gegenüber Zigarettenrauch, E-Zigarettendampf oder anderen Aerosolen²³. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll zur Erzeugung von 3D- und 2D-ALI-Kulturen von iAT2s eine Langzeitkultur eines krankheitsrelevanten Zelltyps ermöglicht und eine physiologische, skalierbare Plattform bietet, die den Einsatz dieser Zellen in vielen Anwendungen ermöglicht.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I5879	For CKDCI
12 Well Cell Culture Plate	Corning	3513	Plates for culturing
1-Thioglycerol (MTG)	M6145	Sigma	For CKDCI
2D Matrigel (matrix) - Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	8774552	To coat ALI Transwells
3D Matrigel (matrix) - Growth Factor Reduced Matrigel	Corning	356230	To grow iAT2 spheres in
8-bromoadenosine 30,50-cyclic monophosphate sodium salt (cAMP)	Sigma	B7880	For CKDCI
Ascorbic Acid	A4544	Sigma	For CKDCI
B27 w/out retinoic acid	Life Technologies	12587-010	For CKDCI
Bovine Serum Albumin (BSA) (7.5%)	Thermo Fisher	15260037	For CKDCI
Calcein blue	Life Technologies	C1429	For live/dead discrimination in flow cytometry
Calcein green	Life Technologies	C1430	Optional visualisation of cells on cell culture insert
Cell culture inserts - Costar 6.5 mm Clear Transwells with 0.4 µm pore size	Millipore-Sigma	CLS3470-48EA	ALI transwells
CHIR99021	Tocris	4423	For CKDCI
Dexamethasone	Sigma	D4902	For CKDCI
Dispase (2 mg/mL)	Thermo Fisher	354235	To dissolve matrigel
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher	11995	To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM)
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Thermo Fisher	A4192002	To wash
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher	14190	For flow cytometric analyses
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone charaterized)	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	To make trypsin inactivation media (10% FBS in DMEM)
Glutamax	Life Technologies	35050-061	For CKDCI
Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12)	Cellgro	10-080-CV	For CKDCI
Hemocytometer	Fisher	02-671-6	For cell counting
Invivogen Primocin 1 G (50 mg/mL)	Fisher Scientific	NC9392943	For CKDCI
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Thermo Fisher	12440053	For CKDCI
Millicell ERS-2 Voltohmeter	Millipore	MERS00002	To measure trans-epithlial electrical resistance
N2 supplement	Life Technologies	17502-048	For CKDCI
Recombinant human KGF	R&D Systems	251-KG-010	For CKDCI
Retinoic acid	Sigma	R2625	For CKDCI
Trypan blue	Thermo Fisher	15250061	For cell count during passaging
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco	25-300-062	To dissociate iAT2 spheres
Y-27632 dihydrochloride	Tocris	1254	Add to cells after passaging