Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Bu protokol, insan plazmasından astrosit kaynaklı hücre dışı veziküllerin (ADEV'ler) zenginleştirilmesini tanımlar. EV'lerin polimer çökeltme ile ayrılmasına ve ardından ADEV'lerin ACSA-1 tabanlı immüno-yakalanmasına dayanır. ADEV'lerin analizi, sıvı biyopsi ile non-invaziv olarak yaşayan hastaların inflamatuar yolaklarındaki değişiklikleri incelemek için ipuçları sunabilir.
Hücre dışı veziküller (EV'ler), hücresel iletişim ve atıkların giderilmesi için tüm hücreler tarafından salgılanan biyolojik nanopartiküllerdir. Fizyolojik ve patolojik durumlarda diğer hücrelere etki ederek ve yüklerini onlara aktararak çok çeşitli işlevlere katılırlar. Biyosıvılardaki varlıkları göz önüne alındığında, EV'ler hastalık süreçlerini incelemek için mükemmel bir kaynağı temsil eder ve biyobelirteç keşfi için sıvı bir biyopsi olarak kabul edilebilir. EV analizinin çekici bir yönü, menşe hücrelerinin belirteçlerine dayalı olarak seçilebilmeleri ve böylece kargolarındaki belirli bir dokunun ortamını yansıtabilmeleridir. Bununla birlikte, EV izolasyon yöntemleriyle ilgili en büyük handikaplardan biri, metodolojik fikir birliklerinin ve standartlaştırılmış protokollerin olmamasıdır. Astrositler, beyinde önemli rollere sahip glial hücrelerdir. Nörodejeneratif hastalıklarda, astrosit reaktivitesi, EV kargosunun değişmesine ve anormal hücresel iletişime yol açarak hastalığın ilerlemesini kolaylaştırabilir / artırabilir. Bu nedenle, astrosit EV'lerin analizi, biyobelirteçlerin ve potansiyel hastalık hedeflerinin keşfedilmesine yol açabilir. Bu protokol, insan plazmasından astrosit türevli EV'lerin (ADEV'ler) zenginleştirilmesi için 2 aşamalı bir yöntemi tanımlar. İlk olarak, EV'ler polimer bazlı çökeltme yoluyla defibrine plazmadan zenginleştirilir. Bunu, yeniden askıya alınan EV'lerin manyetik bir alana yerleştirilmiş bir kolona yüklendiği manyetik mikro boncuklarla ACSA-1 tabanlı immüno-yakalama yoluyla ADEV'lerin zenginleştirilmesi takip eder. Manyetik olarak etiketlenmiş ACSA-1+ EV'ler sütun içinde tutulurken, diğer EV'ler içinden akar. Kolon mıknatıstan çıkarıldıktan sonra, ADEV'ler ayrıştırılır ve depolama ve analiz için hazır hale gelir. Astrosit belirteçlerinin zenginleşmesini doğrulamak için, glial fibriler asidik protein (GFAP) veya hücre içi kökenli diğer spesifik astrositik belirteçler elüatta ölçülebilir ve akış ile karşılaştırılabilir. Bu protokol, astrositle ilgili belirteçleri incelemek için bir platform olarak kullanılabilecek plazmadan ADEV'leri zenginleştirmek için kolay, zaman açısından verimli bir yöntem önermektedir.
Hücre dışı veziküller (EV'ler), proteinleri, lipitleri ve nükleik asitleri taşıyan her tür hücre tarafından salgılanan heterojen bir membranöz nanopartikül grubudur1. Mikroveziküller (100-1000 nm), eksozomlar (30-100 nm) ve apoptotik cisimler (1000-5000 nm), menşe yerleri 2,3 ile ayırt edilen ana EV tiplerini oluşturur. EV'ler, antijen sunumu ve bağışıklık tepkileri4, reseptör geri dönüşümü, metabolit eliminasyonu5 ve hücresel iletişim6 gibi önemli fizyolojik süreçleri düzenler. Bu süreçlerin düzenlenmesi, EV hücre zarında zenginleştirilmiş proteinler ile alıcı hücrelerdeki hedefler arasında doğrudan bağlanma ve/veya kargolarının alıcı hücrenin sitoplazmasında içselleştirilmesi ve serbest bırakılması yoluyla gerçekleşebilir7. EV'ler temel hücresel işlevleri yerine getirirken, kanser ve nöroloji alanlarında patolojik bir bakış açısıyla artan bir ilgi görmüşlerdir. Gerçekten de, birkaç çalışma, EV'lerin Alzheimer hastalığı10,11 gibi nörodejeneratif hastalıklarda tümör hücresi göçünü 8,9 teşvik etmeye veya tohum toksik protein agregatlarına yardımcı olabileceğini göstermiştir.
EV'ler, menşe hücreleriyle ilgili hücre yüzeyi belirteçlerine dayalı olarak biyosıvılardan seçilebilir ve zenginleştirilebilir, böylece kargolarındaki belirli bir dokunun ortamını yansıtır 12,13,14,15,16,17,18,19,20. Ek olarak, kan, beyin omurilik sıvısı (BOS), tükürük, idrar ve anne sütündeki varlıkları göz önüne alındığında, EV'ler tanı için mükemmel, invaziv olmayan bir araçtır ve biyobelirteç keşfi için sıvı biyopsi olarak kabul edilebilir. Bu, BOS dışındaki erişilebilir sıvılarda beyin analitlerini incelemenin zorlukları göz önüne alındığında, nörolojiye özel bir ilgi alanıdır.
Astrositler, nöro-vasküler iletişimin kesişme noktasında oldukları için artan ilgi kazanmıştır21. Fizyolojik koşullar altında, kan-beyin bariyerinin korunmasından, nörotransmiterlerin geri dönüşümünden, nöronlara ve diğer glial hücrelere besin ve büyüme faktörlerinin sağlanmasından 22,23,24 ve ayrıca pro-inflamatuardan anti-enflamatuar durumlara kadar metabolik plastisiteleri göz önüne alındığında nöro-immün savunmadan sorumludurlar ve bunun tersi de geçerlidir 25,26,27. Astrositlerin düzenleyici işlevlerini yerine getirdikleri önemli bir mekanizma, EV'ler aracılığıyla iletişimdir28,29. Reaktif astrositoz, Alzheimer hastalığı,30 çoklu sistem atrofisi (MSA), ilerleyici supranükleer palsi (PSP)31 ve amyotrofik lateral skleroz (ALS)32 gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıkların önemli bir özelliğidir. Astrosit reaktivitesi, EV kargosunun değişmesine, inflamatuar mediatörlerin salınmasına ve anormal hücresel iletişime yol açabilir, böylece patolojinin yayılmasını kolaylaştırabilir ve nörodejenerasyonayol açabilir 10,11. Bu nedenle, astrositten türetilmiş EV'leri (ADEV'ler) ve kargolarındaki değişiklikleri incelemek, nörodejeneratif süreçleri invaziv olmayan bir şekilde incelemek için çekici bir kaynaktır.
Şu anda, EV'lerin izolasyonu için her biri kendine özgü avantaj ve dezavantajlara sahip çeşitli metodolojiler mevcuttur33. İlgilenilen nihai uygulamaya bağlı olarak, belirli bir kullanım için hangi yöntemin daha uygun olduğunu düşünmek önemlidir. Nöroloji alanında ve daha spesifik olarak, astrosit çalışmalarında, polimer bazlı çökeltme ve ardından immünocapture, ağırlıklı olarak kullanılan yöntemolmuştur 12,18,19,20,34. Bununla birlikte, aynı yaklaşım uygulandığında bile, EV izolasyonu için uygulanan farklı adımlardaki çalışmalar arasında heterojenlik devam etmektedir. Bu nedenle, astrosit EV çalışmalarını ve tekrarlanabilirliği incelemek için açık, adım adım standartlaştırılmış bir metodolojiye ihtiyaç vardır. Polimer bazlı çökeltme, karmaşık ekipman gerektirmeyen hızlı ve basit bir prosedür olduğu için biyobelirteç taramasını kolaylaştırır ve biyolojik aktivitelerini etkilemeden yüksek EV verimine yol açar35.
Mevcut protokol, ADEV'lerin insan plazmasından zenginleştirilmesi için ayrıntılı, basit, iki aşamalı bir yöntemi tanımlamaktadır. Toplam EV fraksiyonunun polimer bazlı bir çökeltilmesine ve ardından astrosit EV'lerin immüno-yakalanmasına dayanır. Astrositlerin önemli işlevleri göz önüne alındığında, ADEV'lerin analizi, invaziv olmayan bir şekilde incelenebilecek biyobelirteçlerin ve beyin inflamatuar yollarının keşfi için ışık tutabilir.
Bu protokolde açıklanan araştırma, Sant Pau Nörodejenerasyon Girişimi (SPIN) kohortundan, Barselona, İspanya'dan her iki cinsiyetten sağlıklı yetişkin donörlerden (yaş aralığı 65.9-81.3 yıl, %45.5 kadın) alınan insan plazma örnekleri ile gerçekleştirilmiştir36. Katılımcılar bilgilendirilmiş onam verdiler. Çalışma, Helsinki Bildirgesi'nde yer alan tıbbi araştırmalar için uluslararası etik yönergeler ve İspanyol yasalarına uygun olarak yürütülmüştür. Sant Pau Araştırma Etik Komitesi (CEIC), SPIN kohortundan insan plazma örneklerinin toplanması ve saklanması için protokolü gözden geçirdi ve onayladı (#16/2013).
1. Astrosit EV'lerin insan plazmasından zenginleştirilmesi
NOT: Bu protokol, insan plazma örneklerinin kullanımını içerir. Bu protokolde kullanılan reaktifler ve laboratuvar materyali ile ilgili tüm detaylar Malzeme Tablosunda yer almaktadır. Bu prosedür için özel bir ekipman gerekmez, ancak lütfen her üretici tarafından ayrı ayrı belirtildiği şekilde her bir reaktifin güvenlik hususlarını gözden geçirin.
Şekil 1: Astrositten türetilmiş EV'lerin zenginleştirilmesi için iki aşamalı prosedürün şematik gösterimi. İlk adımda, EV'ler defibrine insan plazmasından polimer bazlı çökeltme ve santrifüjleme adımları ile zenginleştirilir. Total EV resüspansyonundan sonra, astrosit EV'ler daha sonra biyotinile anti-GLAST (ACSA-1) antikorları ve anti-biyotin manyetik mikroboncuklar ile immünocapture ile seçilir. Kısaltmalar: ACSA-1 = astrosit hücre yüzeyi antijeni-1; ADEV'ler = astrosit kaynaklı hücre dışı veziküller; DPBS = Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu; EV'ler = hücre dışı veziküller; GLAST = glutamat-aspartat taşıyıcı; ADEV yok = astrositik olmayan hücre dışı veziküller; EV yok = Hücre dışı vezikül yok (EV tükenmiş plazma); PIC = proteaz inhibitörü kokteyli; RT = oda sıcaklığı. BioRender ile oluşturulan figür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Protokol doğrulaması
3. Veri analizi
Sağlıklı vericilerden toplanan plazmadan ADEV'lerin izolasyonu başarıyla gerçekleştirildi. Toplam EV fraksiyonunu elde etmek için polimer bazlı bir çökeltme yöntemi kullanıldı, ardından ADEV'leri elde etmek için manyetik mikro boncuklarla bir immüno-yakalama yapıldı.
İmmüno-yakalama adımından önce toplam EV fraksiyonunun Western blot analizi, EV preparatlarında kalneksin (hücresel kontaminasyon belirteci) eksikliğini ve Alix ve trans...
EV'ler, teşhis ve tedavi potansiyelleri nedeniyle biyomedikal araştırmalara büyük ilgi görmüştür. Şu anda, EV izolasyon yöntemleriyle ilgili en büyük handikaplardan biri, metodolojik fikir birliği ve standartlaştırılmış protokollerin olmamasıdır. Bu çalışma, astrosit EV'lerin polimer bazlı çökeltme ve GLAST immünocapture yoluyla insan plazmasından zenginleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar.
EV'lerin vücut...
Dr. Belbin, gönderilen çalışmanın dışında ADx NeuroSciences'tan kişisel ücretler aldığını bildirdi. Dr. Alcolea, sunulan çalışmanın dışında Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. ve Esteve'den danışma kurulu hizmetleri ve/veya onursal konuşmacı için kişisel ücretler aldığını bildirdi. Dr. Lleó, sunulan çalışmanın dışında Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols ve Nutricia için danışman olarak veya danışma kurullarında görev yapmıştır. Dr. Fortea, sunulan çalışmanın dışında AC Immune, Novartis, Lundbeck, Roche, Fujirebio ve Biogen'den danışma kurullarında, yargı komitelerinde veya konuşmacı onurlarında hizmet için kişisel ücretler aldığını bildirdi. Dr. Alcolea, Belbin, LLeó ve Dr. Fortea, nörodejeneratif hastalıkta sinaptopati belirteçleri için bir patente sahip olduklarını bildirmektedir (ADx, EPI8382175.0 lisanslıdır). Başka bir açıklama bildirilmedi. Diğer tüm yazarların ifşa edecek başka bir şeyi yoktur.
Yazarlar, numune işleme ve hazırlama konusunda Soraya Torres, Shaimaa El Bounasri El Bennadi ve Oriol Sanchez Lopez'in yardımlarına teşekkür etmek isterler. Ayrıca, Barselona Malzeme Bilimi Enstitüsü ICTS "NANBIOSIS", ünite 6'dan (Biyoing, Biyomalzemeler ve Nanotıpta CIBER Birimi) José Amable Bernabé, Universitat Autonoma de Barcelona'daki Elektron Mikroskobu Birimi'nden Marti de Cabo Jaume, Sant Pau Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (IIB-Sant Pau) Akış Sitometrisi Platformu'ndan Dr. Marta Soler Castany ve Lia Ros Blanco'nun işbirliğini de takdir etmek isteriz. ayrıca IIB-Sant Pau'daki lipid ile ilişkili hastalıkların patofizyolojisi grubundan Dr. Joan Carles Escolà-Gil, sırasıyla NTA, cryo-EM, Luminex ve ApoB tayinlerinde yardım için.
Yazarlar, Jérôme Lejeune Vakfı'ndan (Proje #1941 ve #1913'ten MFI ve MCI'ye), Instituto de Salud Carlos III'ten (PI20/01473'ten JF'ye, PI20/01330'dan AL'ye, PI18/00435'ten DA'ya ve INT19/00016'dan DA'ya), Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden (1R01AG056850-01A1, R21AG056974 ve JF'ye R01AG061566), Alzheimer Derneği ve Küresel Beyin Sağlığı Enstitüsü'nden (GBHI_ALZ-18-543740'tan MCI'ye), Frontotemporal Dejenerasyon Derneği (Klinik Araştırma Doktora Sonrası Bursu, AFTD 2019–2021) ODI'ye ve Societat Catalana de Neurologia'ya (Premi Beca Fundació SCN 2020'den MCI'ye). Bu çalışma aynı zamanda CIBERNED programı (Program 1, Alzheimer Hastalığından AL'ye ve SIGNAL çalışması) tarafından da desteklenmiştir. SS, Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Ciencia e Innovación (Gobierno de España) tarafından "Juan de la Cierva-Incorporación" (IJC2019-038962-I) Doktora Sonrası hibesi almıştır.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-Alix primary antibody for Western blotting | EMD Millipore | ABC40 | |
µMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-602 | The µMACS Separator is used in combination with µ Columns and MACS MicroBeads. |
Anti-calnexin primary antibody for Western blotting | Genetex | GTX109669 | |
Anti-CD9 primary antibody for Western blotting | Cell Signaling | 13174 | |
Blocker BSA (10%) 200 mL | Thermo Fisher | 37525 | |
Bransonic 1510E-MT Ultrasonic bath | Branson | ||
COBAS 6000 autoanalyzer | Roche Diagnostics | Analyzer for immunoturbidimetric determination of ApoB; commercial autoanalyzer | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
Digital Micrograph 1.8 | micrograph software | ||
Dulbecco's PBS Mg++, Ca++ free 500 mL | Thermo Fisher | 14190144 | |
EveryBlot Blocking Buffer | BioRad | 12010020 | |
Exoquick (exosome precipitation solution 5 mL) + Thrombin | System Bioscience | EXOQ5TM-1 | ExoQuick 20 mL can also be purchased (EXOQ20A-1) |
Gatan 895 USC 4000 | camera | ||
GeneGnome XRQ chemiluminiscence imaging system | Syngene | ||
Human CD81 antigen (CD81) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL004960HU | |
Human Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL017673HU | |
Immun-Blot PVDF Membrane | BioRad | 1620177 | |
JEOL 2011 transmission electron microscope | JEOL LTD | Equipped with a CCD Gatan 895 USC 4000 camera (Gatan 626, Gatan, Pleasanton, USA) | |
Lavender EDTA BD Vacutainer K2E tubes | Becton dickinson | 367525 | |
Leica EM GP | Leica Microsystem | commercial plunge freezer | |
Low binding microtubes 1,5 mL | Deltalab | 4092.3NS | |
MACS µ Columns with plungers | Miltenyi Biotec | 130-110-905 | µ Columns with plungers are especially designed for isolation of exosomes from body fluids |
MACS Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MAGPIX plate reader | Luminex Corporation | 80-073 | Luminex's xMAP multiplexing unit (Luminex xPonent v 4.3 software) |
MicroBead Kit100 μL Anti-GLAST (ACSA-1)-Biotin, human, mouse, rat – small size; 100 μL Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-095- 825 | |
MILLIPLEX MAP Kit Human cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A magnetic bead panel | EMD Millipore | HCYTA-60K-25 | |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 25 mL | Thermo Fisher | 78503 | For certain applications like Western blot, more aggressive lysis buffers can be used (e.g. RIPA) |
MultiSkan SkyHigh Microplate Spectrophotometer | Thermofisher | A51119500C | |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NTA; 3.4 version | |
Pierce Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher | 78441 | |
Polypropylene syringe (G29) | PeroxFarma | 1mL syringe; 0.33x12mm-G29x1/2" | |
Secondary anti-rabbit antibody | Thermo Fisher | 10794347 | |
Simoa GFAP Discovery Kit | Quanterix | 102336 | |
Simoa, SR-X instrument | Quanterix | SR-X Ultra-Sensitive Biomarker Detection System; commercial biomarker detection technology | |
Specific Protein Test Apolipoprotein B - APOB (100 det) COBAS C/CI | Roche Diagnostics | 3032574122 | |
SuperSignal West Femto | Thermo Fisher | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) HRP substrate |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır