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이 프로토콜은 인간 혈장에서 성상세포 유래 세포외 소포체(ADEV)의 농축을 설명합니다. 이는 폴리머 침전에 의한 EV의 분리를 기반으로 하며, ADEV의 ACSA-1 기반 면역 캡처를 기반으로 합니다. ADEV의 분석은 액체 생검에 의해 비침습적으로 살아있는 환자의 염증 경로 변화를 연구할 수 있는 단서를 제공할 수 있습니다.
세포외 소포체(EV)는 세포 통신 및 폐기물 제거를 위해 모든 세포에서 분비되는 생물학적 나노 입자입니다. 그들은 생리학적, 병리학적 조건에서 다른 세포에 작용하고 화물을 다른 세포로 이동시킴으로써 광범위한 기능에 참여합니다. EV는 생체 유체에 존재한다는 점을 감안할 때 질병 과정을 연구하기 위한 훌륭한 자원이며 바이오마커 발견을 위한 액체 생검으로 간주될 수 있습니다. EV 분석의 매력적인 측면은 기원 세포의 마커를 기반으로 선택할 수 있으므로 화물에 있는 특정 조직의 환경을 반영할 수 있다는 것입니다. 그러나 EV 절연 방법과 관련된 주요 단점 중 하나는 방법론적 합의와 표준화된 프로토콜이 부족하다는 것입니다. 성상세포(astrocyte)는 뇌에서 필수적인 역할을 하는 신경교세포(glial cell)입니다. 신경퇴행성 질환에서 성상세포 반응은 EV 화물 및 비정상적인 세포 통신을 변경하여 질병 진행을 촉진/향상시킬 수 있습니다. 따라서 성상교세포 EV의 분석은 바이오마커 및 잠재적인 질병 표적의 발견으로 이어질 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 혈장에서 성상세포 유래 EV(ADEV)를 농축하는 2단계 방법을 설명합니다. 첫째, EV는 폴리머 기반 침전을 통해 제세된 플라즈마에서 농축됩니다. 그 다음에는 자기 마이크로 비드를 사용한 ACSA-1 기반 면역 캡처를 통해 ADEV를 농축하며, 여기서 재현탁된 EV는 자기장에 배치된 기둥에 적재됩니다. 자기 라벨링된 ACSA-1+ EV는 컬럼 내에 유지되고 다른 EV는 통과합니다. 자석에서 컬럼이 제거되면 ADEV가 용리되어 저장 및 분석할 준비가 됩니다. 성상세포 마커의 농축을 검증하기 위해 신경교세포섬유산단백질(GFAP) 또는 세포 내 기원의 기타 특정 성상세포 마커를 용리액에서 측정하고 플로우 스루(flow-through)와 비교할 수 있습니다. 이 프로토콜은 성상세포 관련 마커를 검사하기 위한 플랫폼으로 사용할 수 있는 혈장에서 ADEV를 농축하는 쉽고 시간 효율적인 방법을 제안합니다.
세포외 소포체(EV)는 모든 유형의 세포에서 분비되는 막질 나노입자의 이질적인 그룹으로, 단백질, 지질 및 핵산을 운반합니다1. 미세소포체(100-1000 nm), 엑소좀(30-100 nm) 및 자가사멸체(1000-5000 nm)가 주요 EV 유형을 구성하며, 원산지 2,3에 따라 구별됩니다. EV는 항원 제시 및 면역 반응4, 수용체 재생, 대사 산물 제거5,세포 소통6과 같은 중요한 생리적 과정을 조절합니다. 이러한 과정의 조절은 EV 세포막에 풍부한 단백질과 수용 세포의 표적 사이의 직접 결합 및/또는 수용 세포의 세포질에서 화물의 내재화 및 방출을 통해 발생할 수 있습니다7. EV는 필수적인 세포 기능을 수행하지만 암 및 신경학 분야에서 병리학적 관점에서 점점 더 많은 관심을 받고 있습니다. 실제로, 여러 연구에 따르면 EV는 종양 세포 이동을 촉진하는 데 도움이 될 수 있습니다 8,9 또는 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환에서 종자 독성 단백질 응집체10,11.
EV는 기원 세포와 관련된 세포 표면 마커를 기반으로 생체 유체에서 선택하고 농축할 수 있으므로 화물에 있는 특정 조직의 환경을 반영합니다 12,13,14,15,16,17,18,19,20. 또한 혈액, 뇌척수액(CSF), 타액, 소변 및 모유에 존재한다는 점을 감안할 때 EV는 진단을 위한 탁월한 비침습적 도구이며 바이오마커 발견을 위한 액체 생검으로 간주될 수 있습니다. 이것은 CSF 이외의 접근 가능한 유체에서 뇌 분석물을 연구하는 어려움이 있다는 점을 감안할 때 신경학에서 특별한 관심을 끌고 있습니다.
성상세포(astrocyte)는 신경-혈관 소통(neuro-vascular communication)의 교차점에 있기 때문에 점점 더 많은 관심을 받고 있다21. 생리학적 조건 하에서, 그들은 혈액-뇌 장벽의 보존, 신경 전달 물질의 재활용, 뉴런 및 기타 신경교세포에 대한 영양분 및 성장 인자의 공급을 담당합니다 22,23,24 뿐만 아니라 전염증 상태에서 항염증 상태로 또는 그 반대로 신진대사 가소성을 감안할 때 신경 면역 방어 25,26,27. 성상세포가 조절 기능을 수행하는 중요한 메커니즘은 EV를 통한 의사소통입니다28,29. 반응성 성상세포작용은 알츠하이머병,30 다계통 위축증(MSA), 진행성 핵상마비(PSP)31 및 근위축성 측삭 경화증(ALS)32과 같은 여러 신경퇴행성 질환의 주요 특징입니다. 성상세포 반응성은 전기차 화물의 변화, 염증 매개체의 방출 및 비정상적인 세포 통신을 유발할 수 있으며, 따라서 병리학의 확산을 촉진하고 신경 퇴행을 유발할 수 있습니다10,11. 따라서 성상세포 유래 EV(ADEV)와 그 화물의 변화를 연구하는 것은 비침습적 방식으로 신경퇴행성 과정을 조사할 수 있는 매력적인 자원입니다.
현재 EV의 격리를 위한 여러 방법론이 존재하며, 각 방법론에는 해당 장점과 단점이 있습니다33. 관심의 최종 응용 프로그램에 따라 특정 용도에 더 적합한 방법을 고려하는 것이 중요합니다. 신경학 분야에서, 더 구체적으로 말하자면, 성상세포 연구에서는 고분자 기반 침전 후 면역 캡처가 주로 사용되는 방법이었습니다 12,18,19,20,34. 그러나 동일한 접근 방식을 적용하더라도 EV 분리에 적용된 여러 단계의 연구 간에 이질성이 남아 있습니다. 따라서 성상교세포 EV 연구를 촉진하고 재현성을 연구하기 위해 명확하고 단계적으로 표준화된 방법론이 필요합니다. 폴리머 기반 침전은 복잡한 장비가 필요하지 않은 빠르고 간단한 절차라는 점을 감안할 때 바이오마커 스크리닝을 용이하게 하여 생물학적 활성에 영향을 주지 않고 EV의 높은 수율로 이어집니다35.
본 프로토콜은 인간 혈장에서 ADEV를 농축하기 위한 상세하고 간단한 2단계 방법을 설명합니다. 이는 총 EV 분획의 폴리머 기반 침전을 기반으로 한 후 성상교세포 EV의 면역 캡처를 기반으로 합니다. 성상세포의 중요한 기능을 감안할 때, ADEV 분석은 비침습적 방식으로 연구할 수 있는 바이오마커 및 뇌 염증 경로의 발견에 빛을 비출 수 있습니다.
이 프로토콜에 설명된 연구는 스페인 바르셀로나에 있는 Sant Pau Initiative on Neurodegeneration(SPIN) 코호트의 남녀 건강한 성인 기증자(연령 범위 65.9-81.3세, 여성 45.5%)의 인간 혈장 샘플로 수행되었습니다. 참가자들은 정보에 입각한 동의를 했습니다. 이 연구는 헬싱키 선언과 스페인 법에 포함된 의학 연구에 대한 국제 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 산트 파우 연구 윤리 위원회(Sant Pau Research Ethics Committee, CEIC)는 SPIN 코호트(#16/2013)에서 인간 혈장 샘플의 수집 및 보관을 위한 프로토콜을 검토하고 승인했습니다.
1. 인간 플라즈마에서 성상세포 EV의 농축
참고: 이 프로토콜에는 인간 혈장 샘플의 사용이 포함됩니다. 이 프로토콜에 사용된 시약 및 실험실 재료에 대한 모든 세부 정보는 재료 표에 포함되어 있습니다. 이 절차에는 특별한 장비가 필요하지 않지만, 각 제조업체에서 개별적으로 지정한 대로 각 시약의 안전성 고려 사항을 검토하십시오.
그림 1: 성상교세포 유래 EV의 농축을 위한 2단계 절차의 개략도 . 첫 번째 단계에서 EV는 폴리머 기반 침전 및 원심분리 단계를 통해 제세된 인간 플라즈마에서 농축됩니다. 전체 EV 재현탁 후, 비오틴화 항 GLAST(ACSA-1) 항체 및 항비오틴 자성 마이크로비드를 사용한 면역 캡처로 성상세포 EV를 선택합니다. 약어: ACSA-1 = 성상세포 세포 표면 항원-1; ADEVs = 성상세포 유래 세포외 소포체; DPBS = Dulbecco의 인산염 완충 식염수; EVs = 세포외 소포체; GLAST = 글루타메이트-아스파르테이트 수송체; ADEV 없음 = 비성상세포 세포외 소포체; EVs 없음 = 세포외 소포체 없음(EV-고갈 혈장); PIC = 프로테아제 억제제 칵테일; RT = 실온. BioRender로 만든 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 프로토콜 검증
3. 데이터 분석
건강한 기증자로부터 채취한 혈장에서 ADEV를 분리하는 작업이 성공적으로 이루어졌습니다. 총 EV 분획을 얻기 위해 폴리머 기반 침전 방법을 사용한 다음 자기 마이크로비드를 사용한 면역 캡처를 수행하여 ADEV를 얻었습니다.
면역 포획 단계 전 총 EV 분획에 대한 웨스턴 블롯 분석은 EV 제제에 칼넥신(calnexin, 세포 오염 마커)이 부족하고 알릭스(Alix)와 ...
EV는 진단 및 치료 가능성으로 인해 생물 의학 연구에 대한 큰 관심을 얻고 있습니다. 현재 EV 격리 방법과 관련된 주요 단점 중 하나는 방법론적 합의와 표준화된 프로토콜이 부족하다는 것입니다. 이 연구는 폴리머 기반 침전 및 GLAST 면역 캡처 를 통해 인간 혈장에서 성상 세포 EV를 농축하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.
EV를 체액에서 ...
Belbin 박사는 제출된 연구 외에 ADx NeuroSciences로부터 개인 수수료를 받았다고 보고했습니다. Alcolea 박사는 제출된 논문 외에 Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. 및 Esteve로부터 자문 위원회 서비스에 대한 개인 회비를 받았다고 보고했습니다. Lleó 박사는 제출된 연구 외에도 Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols 및 Nutricia의 컨설턴트 또는 자문 위원회에서 활동했습니다. Fortea 박사는 제출된 논문 외에 AC Immune, Novartis, Lundbeck, Roche, Fujirebio 및 Biogen으로부터 자문 위원회, 심사 위원회 또는 연사 명예 봉사에 대한 개인 수수료를 받았다고 보고했습니다. Alcolea, Belbin, LLeó 및 Fortea 박사는 신경퇴행성 질환의 시냅토병증 마커에 대한 특허를 보유하고 있다고 보고합니다(ADx, EPI8382175.0 라이선스). 다른 공개는 보고되지 않았습니다. 다른 모든 저자는 더 이상 공개할 것이 없습니다.
저자는 시료 취급 및 준비를 위해 Soraya Torres, Shaimaa El Bounasri El Bennadi 및 Oriol Sanchez Lopez의 도움을 받은 것에 감사를 표합니다. 또한 바르셀로나 재료 과학 연구소(Barcelona Materials Science Institute)의 ICTS "NANBIOSIS", unit 6(Unit of CIBER in Bioingineering, Biomaterials & Nanomedicine)의 José Amable Bernabé, Universitat Autonoma de Barcelona의 전자 현미경 유닛의 Marti de Cabo Jaume, Sant Pau Biomedical Research Institute(IIB-Sant Pau)의 유세포 분석 플랫폼의 Marta Soler Castany 박사와 Lia Ros Blanco의 협력에 감사드립니다. IIB-Sant Pau의 지질 관련 질환 병태생리학 그룹의 Joan Carles Escolà-Gil 박사가 각각 NTA, cryo-EM, Luminex 및 ApoB 측정에 도움을 주었습니다.
저자는 Jérôme Lejeune Foundation(프로젝트 #1941 및 #1913을 MFI 및 MCI), Instituto de Salud Carlos III(PI20/01473을 JF로, PI20/01330을 AL로, PI18/00435를 DA로, INT19/00016을 DA로), National Institute of Health(1R01AG056850-01A1, R21AG056974 및 R01AG061566에서 JF), Alzheimer's Association 및 Global Brain Health Institute(GBHI_ALZ-18-543740에서 MCI)의 재정적 지원을 인정합니다. 전두측두엽 퇴행 협회(The Association for Frontotemporal Degeneration, Clinical Research Postdoctoral Fellowship, AFTD 2019–2021)에서 ODI, 카탈로니아 신경학 협회(Societat Catalana de Neurologia, Premi Beca Fundació SCN 2020에서 MCI). 이 작업은 CIBERNED 프로그램(프로그램 1, 알츠하이머병에서 AL까지 및 SIGNAL 연구)의 지원도 받았습니다. SS는 Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Ciencia e Innovación (Gobierno de España)으로부터 박사후 연구원 "Juan de la Cierva-Incorporación"(IJC2019-038962-I)을 받았습니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-Alix primary antibody for Western blotting | EMD Millipore | ABC40 | |
µMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-602 | The µMACS Separator is used in combination with µ Columns and MACS MicroBeads. |
Anti-calnexin primary antibody for Western blotting | Genetex | GTX109669 | |
Anti-CD9 primary antibody for Western blotting | Cell Signaling | 13174 | |
Blocker BSA (10%) 200 mL | Thermo Fisher | 37525 | |
Bransonic 1510E-MT Ultrasonic bath | Branson | ||
COBAS 6000 autoanalyzer | Roche Diagnostics | Analyzer for immunoturbidimetric determination of ApoB; commercial autoanalyzer | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
Digital Micrograph 1.8 | micrograph software | ||
Dulbecco's PBS Mg++, Ca++ free 500 mL | Thermo Fisher | 14190144 | |
EveryBlot Blocking Buffer | BioRad | 12010020 | |
Exoquick (exosome precipitation solution 5 mL) + Thrombin | System Bioscience | EXOQ5TM-1 | ExoQuick 20 mL can also be purchased (EXOQ20A-1) |
Gatan 895 USC 4000 | camera | ||
GeneGnome XRQ chemiluminiscence imaging system | Syngene | ||
Human CD81 antigen (CD81) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL004960HU | |
Human Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL017673HU | |
Immun-Blot PVDF Membrane | BioRad | 1620177 | |
JEOL 2011 transmission electron microscope | JEOL LTD | Equipped with a CCD Gatan 895 USC 4000 camera (Gatan 626, Gatan, Pleasanton, USA) | |
Lavender EDTA BD Vacutainer K2E tubes | Becton dickinson | 367525 | |
Leica EM GP | Leica Microsystem | commercial plunge freezer | |
Low binding microtubes 1,5 mL | Deltalab | 4092.3NS | |
MACS µ Columns with plungers | Miltenyi Biotec | 130-110-905 | µ Columns with plungers are especially designed for isolation of exosomes from body fluids |
MACS Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MAGPIX plate reader | Luminex Corporation | 80-073 | Luminex's xMAP multiplexing unit (Luminex xPonent v 4.3 software) |
MicroBead Kit100 μL Anti-GLAST (ACSA-1)-Biotin, human, mouse, rat – small size; 100 μL Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-095- 825 | |
MILLIPLEX MAP Kit Human cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A magnetic bead panel | EMD Millipore | HCYTA-60K-25 | |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 25 mL | Thermo Fisher | 78503 | For certain applications like Western blot, more aggressive lysis buffers can be used (e.g. RIPA) |
MultiSkan SkyHigh Microplate Spectrophotometer | Thermofisher | A51119500C | |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NTA; 3.4 version | |
Pierce Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher | 78441 | |
Polypropylene syringe (G29) | PeroxFarma | 1mL syringe; 0.33x12mm-G29x1/2" | |
Secondary anti-rabbit antibody | Thermo Fisher | 10794347 | |
Simoa GFAP Discovery Kit | Quanterix | 102336 | |
Simoa, SR-X instrument | Quanterix | SR-X Ultra-Sensitive Biomarker Detection System; commercial biomarker detection technology | |
Specific Protein Test Apolipoprotein B - APOB (100 det) COBAS C/CI | Roche Diagnostics | 3032574122 | |
SuperSignal West Femto | Thermo Fisher | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) HRP substrate |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 |
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