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Method Article
Este protocolo descreve o enriquecimento de vesículas extracelulares derivadas de astrócitos (ADEVs) a partir de plasma humano. Baseia-se na separação de EVs por precipitação de polímeros, seguida de imunocaptura de ADEVs baseada em ACSA-1. A análise de ADEVs pode oferecer pistas para estudar alterações nas vias inflamatórias de pacientes vivos, de forma não invasiva por biópsia líquida.
As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas biológicas secretadas por todas as células para comunicação celular e eliminação de resíduos. Eles participam de uma vasta gama de funções, agindo e transferindo suas cargas para outras células em condições fisiológicas e patológicas. Dada a sua presença em biofluidos, os EVs representam um excelente recurso para o estudo de processos patológicos e podem ser considerados uma biópsia líquida para a descoberta de biomarcadores. Um aspecto atraente da análise de EV é que eles podem ser selecionados com base em marcadores de sua célula de origem, refletindo assim o ambiente de um tecido específico em sua carga. No entanto, uma das principais desvantagens relacionadas aos métodos de isolamento de VE é a falta de consensos metodológicos e protocolos padronizados. Os astrócitos são células gliais com papéis essenciais no cérebro. Em doenças neurodegenerativas, a reatividade dos astrócitos pode levar a uma carga EV alterada e comunicação celular aberrante, facilitando/aumentando a progressão da doença. Assim, a análise de EVs de astrócitos pode levar à descoberta de biomarcadores e potenciais alvos de doenças. Este protocolo descreve um método de 2 etapas de enriquecimento de EVs derivados de astrócitos (ADEVs) a partir de plasma humano. Primeiro, os EVs são enriquecidos a partir de plasma desfibrinado por meio de precipitação à base de polímeros. Isso é seguido pelo enriquecimento de ADEVs por meio de imunocaptura baseada em ACSA-1 com microesferas magnéticas, onde EVs ressuspensos são carregados em uma coluna colocada em um campo magnético. Os EVs ACSA-1+ marcados magneticamente são retidos dentro da coluna, enquanto outros EVs fluem. Uma vez que a coluna é removida do ímã, os ADEVs são eluídos e estão prontos para armazenamento e análise. Para validar o enriquecimento de marcadores de astrócitos, a proteína glial fibrilar ácida (GFAP), ou outros marcadores astrocíticos específicos de origem intracelular, podem ser medidos no eluato e comparados com o fluxo. Este protocolo propõe um método fácil e eficiente em termos de tempo para enriquecer ADEVs a partir de plasma que pode ser usado como uma plataforma para examinar marcadores relevantes para astrócitos.
As vesículas extracelulares (VEs) são um grupo heterogêneo de nanopartículas membranosas secretadas por todos os tipos de células, carregando proteínas, lipídios e ácidos nucléicos1. Microvesículas (100-1000 nm), exossomos (30-100 nm) e corpos apoptóticos (1000-5000 nm) constituem os principais tipos de EV, distinguidos por seu local de origem 2,3. As EVs regulam processos fisiológicos importantes, como apresentação de antígenos e respostas imunes4, reciclagem de receptores, eliminação de metabólitos5 e comunicação celular6. A regulação desses processos pode ocorrer por ligação direta entre proteínas enriquecidas na membrana celular EV e alvos em células receptoras e/ou pela internalização e liberação de sua carga no citoplasma da célulareceptora 7. Embora os EVs desempenhem funções celulares essenciais, eles ganharam interesse crescente de uma perspectiva patológica nos campos do câncer e da neurologia. De fato, vários estudos mostraram que as EVs podem ajudar a promover a migração de células tumorais 8,9 ou semear agregados de proteínas tóxicas em doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer10,11.
As EVs podem ser selecionadas e enriquecidas a partir de biofluidos com base em marcadores de superfície celular relacionados à sua célula de origem, refletindo assim o ambiente de um tecido específico em sua carga 12,13,14,15,16,17,18,19,20. Além disso, dada a sua presença no sangue, líquido cefalorraquidiano (LCR), saliva, urina e leite materno, as EVs representam uma excelente ferramenta não invasiva para o diagnóstico e podem ser consideradas uma biópsia líquida para a descoberta de biomarcadores. Isso é de especial interesse em neurologia, dadas as dificuldades de estudar analitos cerebrais em fluidos acessíveis que não sejam o LCR.
Os astrócitos ganharam interesse crescente, pois estão na interseção da comunicação neurovascular21. Em condições fisiológicas, são responsáveis pela preservação da barreira hematoencefálica, pela reciclagem de neurotransmissores, pelo fornecimento de nutrientes e fatores de crescimento aos neurônios e outras células gliais 22,23,24 e pela defesa neuroimune, dada a sua plasticidade metabólica de estados pró-inflamatórios a anti-inflamatórios e vice-versa 25,26,27. Um mecanismo importante pelo qual os astrócitos cumprem suas funções regulatórias é a comunicação por meio de EVs28,29. A astrocitose reativa é uma característica importante de várias doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer,30 atrofia de múltiplos sistemas (AMS), paralisia supranuclear progressiva (PSP)31 e esclerose lateral amiotrófica (ELA)32. A reatividade dos astrócitos pode levar a carga EV alterada, liberação de mediadores inflamatórios e comunicação celular aberrante, facilitando a disseminação da patologia e levando à neurodegeneração10,11. Portanto, estudar EVs derivados de astrócitos (ADEVs) e mudanças em sua carga é um recurso atraente para examinar processos neurodegenerativos de maneira não invasiva.
Atualmente, existem várias metodologias para o isolamento de VEs, cada uma com suas vantagens e desvantagens correspondentes33. É essencial considerar qual método é mais adequado para um uso específico, dependendo da aplicação final de interesse. No campo da neurologia, e mais especificamente, em estudos de astrócitos, a precipitação à base de polímeros seguida de imunocaptura tem sido o método predominantemente utilizado 12,18,19,20,34. No entanto, mesmo quando se aplica a mesma abordagem, permanece heterogeneidade entre os estudos nas diferentes etapas aplicadas para o isolamento de EV. Portanto, há necessidade de uma metodologia padronizada clara e passo a passo para facilitar os estudos de EV de astrócitos e a reprodutibilidade do estudo. A precipitação à base de polímeros facilita a triagem de biomarcadores, pois é um procedimento rápido e simples que não requer equipamentos complexos, levando a um alto rendimento de EVs sem afetar sua atividade biológica35.
O presente protocolo descreve um método detalhado, simples e de duas etapas para o enriquecimento de ADEVs a partir de plasma humano. Baseia-se em uma precipitação à base de polímero da fração EV total, seguida por uma imunocaptura de EVs de astrócitos. Dadas as importantes funções dos astrócitos, a análise de ADEVs pode lançar luz para a descoberta de biomarcadores e vias inflamatórias cerebrais que podem ser estudadas de maneira não invasiva.
A pesquisa descrita neste protocolo foi realizada com amostras de plasma humano de doadores adultos saudáveis de ambos os sexos (faixa etária de 65,9 a 81,3 anos, 45,5% do sexo feminino), da coorte Sant Pau Initiative on Neurodegeneration (SPIN), Barcelona, Espanha36. Os participantes deram consentimento informado. O estudo foi realizado seguindo as diretrizes éticas internacionais para pesquisa médica contidas na declaração de Helsinque e na lei espanhola. O Comitê de Ética em Pesquisa de Sant Pau (CEIC) revisou e aprovou o protocolo para coleta e armazenamento de amostras de plasma humano da coorte SPIN (#16/2013).
1. Enriquecimento de EVs de astrócitos a partir de plasma humano
NOTA: Este protocolo envolve o uso de amostras de plasma humano. Todos os detalhes sobre reagentes e material de laboratório usados neste protocolo estão incluídos na Tabela de Materiais. Nenhum equipamento especial é necessário para este procedimento, no entanto, revise as considerações de segurança de cada reagente, conforme especificado individualmente por cada fabricante.
Figura 1: Representação esquemática do procedimento de duas etapas para o enriquecimento de EVs derivados de astrócitos. Na primeira etapa, os EVs são enriquecidos a partir de plasma humano desfibrinado por etapas de precipitação e centrifugação à base de polímeros. Após a ressuspensão total do EV, os EVs de astrócitos são então selecionados por imunocaptura com anticorpos anti-GLAST biotinilados (ACSA-1) e microesferas magnéticas anti-biotina. Abreviaturas: ACSA-1 = antígeno-1 da superfície celular dos astrócitos; ADEVs = vesículas extracelulares derivadas de astrócitos; DPBS = solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco; EVs = vesículas extracelulares; GLAST = transportador de glutamato-aspartato; Sem ADEVs = vesículas extracelulares não astrocíticas; Sem EVs = Sem vesículas extracelulares (plasma empobrecido em EV); PIC = coquetel de inibidores de protease; RT = temperatura ambiente. Figura criada com BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Validação do protocolo
3. Análise dos dados
O isolamento de ADEVs do plasma coletado de doadores saudáveis foi realizado com sucesso. Um método de precipitação à base de polímero foi empregado para obter a fração EV total, seguido de uma imunocaptura com microesferas magnéticas para obter ADEVs.
A análise de Western blot da fração EV total antes da etapa de imunocaptura indicou a falta de calnexina (marcador de contaminação celular) e a presença de Alix e da proteína transmembrana CD9 na...
Os EVs ganharam forte interesse na pesquisa biomédica devido ao seu potencial diagnóstico e terapêutico. Atualmente, uma das principais desvantagens relacionadas aos métodos de isolamento de VE é a falta de consenso metodológico e protocolos padronizados. Este estudo fornece um protocolo detalhado para o enriquecimento de EVs de astrócitos a partir de plasma humano por meio de precipitação à base de polímero e imunocaptura de GLAST.
Existem...
O Dr. Belbin relatou ter recebido honorários pessoais da ADx NeuroSciences fora do trabalho enviado. O Dr. Alcolea relatou ter recebido honorários pessoais por serviços de conselho consultivo e/ou honorários de palestrante da Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. e Esteve fora do trabalho submetido. O Dr. Lleó atuou como consultor ou em conselhos consultivos da Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols e Nutricia fora do trabalho submetido. O Dr. Fortea relatou ter recebido honorários pessoais por serviços nos conselhos consultivos, comitês de adjudicação ou honorários de palestrantes da AC Immune, Novartis, Lundbeck, Roche, Fujirebio e Biogen fora do trabalho enviado. Os Drs. Alcolea, Belbin, LLeó e Fortea relatam possuir uma patente para marcadores de sinaptopatia em doenças neurodegenerativas (licenciada para ADx, EPI8382175.0). Nenhuma outra divulgação foi relatada. Todos os outros autores não têm mais nada a divulgar.
Os autores gostariam de agradecer a ajuda de Soraya Torres, Shaimaa El Bounasri El Bennadi e Oriol Sanchez Lopez para o manuseio e preparação das amostras. Agradecemos também a colaboração de José Amable Bernabé, do ICTS "NANBIOSIS", unidade 6 (Unidade de CIBER em Bioingineering, Biomateriais e Nanomedicina) do Instituto de Ciência dos Materiais de Barcelona, Marti de Cabo Jaume da Unidade de Microscopia Eletrônica da Universitat Autonoma de Barcelona, Dra. Marta Soler Castany e Lia Ros Blanco da Plataforma de Citometria de Fluxo do Instituto de Pesquisa Biomédica de Sant Pau (IIB-Sant Pau), bem como ao Dr. Joan Carles Escolà-Gil, do grupo de Fisiopatologia de doenças relacionadas a lipídios do IIB-Sant Pau, pela ajuda nas determinações de NTA, crio-EM, Luminex e ApoB, respectivamente.
Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação Jérôme Lejeune (Projeto # 1941 e # 1913 para MFI e MCI), Instituto de Salud Carlos III (PI20 / 01473 para JF, PI20 / 01330 para AL, PI18 / 00435 para DA e INT19 / 00016 para DA), o Instituto Nacional de Saúde (1R01AG056850-01A1, R21AG056974 e R01AG061566 para JF), a Associação de Alzheimer e o Instituto Global de Saúde do Cérebro (GBHI_ALZ-18-543740 para MCI), a Associação para a Degeneração Frontotemporal (Bolsa de Pós-Doutorado em Pesquisa Clínica, AFTD 2019–2021) para ODI, e a Societat Catalana de Neurologia (Premi Beca Fundació SCN 2020 para MCI). Este trabalho também foi apoiado pelo programa CIBERNED (Programa 1, Doença de Alzheimer para AL e estudo SIGNAL. SS é bolsista de pós-doutorado "Juan de la Cierva-Incorporación" (IJC2019-038962-I) da Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Ciencia e Innovación (Gobierno de España).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-Alix primary antibody for Western blotting | EMD Millipore | ABC40 | |
µMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-602 | The µMACS Separator is used in combination with µ Columns and MACS MicroBeads. |
Anti-calnexin primary antibody for Western blotting | Genetex | GTX109669 | |
Anti-CD9 primary antibody for Western blotting | Cell Signaling | 13174 | |
Blocker BSA (10%) 200 mL | Thermo Fisher | 37525 | |
Bransonic 1510E-MT Ultrasonic bath | Branson | ||
COBAS 6000 autoanalyzer | Roche Diagnostics | Analyzer for immunoturbidimetric determination of ApoB; commercial autoanalyzer | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
Digital Micrograph 1.8 | micrograph software | ||
Dulbecco's PBS Mg++, Ca++ free 500 mL | Thermo Fisher | 14190144 | |
EveryBlot Blocking Buffer | BioRad | 12010020 | |
Exoquick (exosome precipitation solution 5 mL) + Thrombin | System Bioscience | EXOQ5TM-1 | ExoQuick 20 mL can also be purchased (EXOQ20A-1) |
Gatan 895 USC 4000 | camera | ||
GeneGnome XRQ chemiluminiscence imaging system | Syngene | ||
Human CD81 antigen (CD81) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL004960HU | |
Human Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL017673HU | |
Immun-Blot PVDF Membrane | BioRad | 1620177 | |
JEOL 2011 transmission electron microscope | JEOL LTD | Equipped with a CCD Gatan 895 USC 4000 camera (Gatan 626, Gatan, Pleasanton, USA) | |
Lavender EDTA BD Vacutainer K2E tubes | Becton dickinson | 367525 | |
Leica EM GP | Leica Microsystem | commercial plunge freezer | |
Low binding microtubes 1,5 mL | Deltalab | 4092.3NS | |
MACS µ Columns with plungers | Miltenyi Biotec | 130-110-905 | µ Columns with plungers are especially designed for isolation of exosomes from body fluids |
MACS Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MAGPIX plate reader | Luminex Corporation | 80-073 | Luminex's xMAP multiplexing unit (Luminex xPonent v 4.3 software) |
MicroBead Kit100 μL Anti-GLAST (ACSA-1)-Biotin, human, mouse, rat – small size; 100 μL Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-095- 825 | |
MILLIPLEX MAP Kit Human cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A magnetic bead panel | EMD Millipore | HCYTA-60K-25 | |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 25 mL | Thermo Fisher | 78503 | For certain applications like Western blot, more aggressive lysis buffers can be used (e.g. RIPA) |
MultiSkan SkyHigh Microplate Spectrophotometer | Thermofisher | A51119500C | |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NTA; 3.4 version | |
Pierce Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher | 78441 | |
Polypropylene syringe (G29) | PeroxFarma | 1mL syringe; 0.33x12mm-G29x1/2" | |
Secondary anti-rabbit antibody | Thermo Fisher | 10794347 | |
Simoa GFAP Discovery Kit | Quanterix | 102336 | |
Simoa, SR-X instrument | Quanterix | SR-X Ultra-Sensitive Biomarker Detection System; commercial biomarker detection technology | |
Specific Protein Test Apolipoprotein B - APOB (100 det) COBAS C/CI | Roche Diagnostics | 3032574122 | |
SuperSignal West Femto | Thermo Fisher | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) HRP substrate |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 |
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