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Method Article
Ce protocole décrit l’enrichissement des vésicules extracellulaires dérivées d’astrocytes (VEAD) à partir de plasma humain. Il est basé sur la séparation des VE par précipitation de polymère, suivie d’une immunocapture des VEDA basée sur l’ACSA-1. L’analyse des VEDA peut fournir des indices pour étudier les changements dans les voies inflammatoires de patients vivants, de manière non invasive par biopsie liquide.
Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules biologiques sécrétées par toutes les cellules pour la communication cellulaire et l’élimination des déchets. Ils participent à un large éventail de fonctions en agissant et en transférant leurs cargaisons à d’autres cellules dans des conditions physiologiques et pathologiques. Compte tenu de leur présence dans les biofluides, les VE représentent une excellente ressource pour l’étude des processus pathologiques et peuvent être considérées comme une biopsie liquide pour la découverte de biomarqueurs. Un aspect intéressant de l’analyse des VE est qu’ils peuvent être sélectionnés en fonction des marqueurs de leur cellule d’origine, reflétant ainsi l’environnement d’un tissu spécifique dans leur cargaison. Cependant, l’un des principaux handicaps liés aux méthodes d’isolement des VE est le manque de consensus méthodologique et de protocoles standardisés. Les astrocytes sont des cellules gliales qui jouent un rôle essentiel dans le cerveau. Dans les maladies neurodégénératives, la réactivité des astrocytes peut entraîner une altération de la cargaison EV et une communication cellulaire aberrante, facilitant / améliorant la progression de la maladie. Ainsi, l’analyse des VE des astrocytes peut conduire à la découverte de biomarqueurs et de cibles potentielles de maladies. Ce protocole décrit une méthode en 2 étapes d’enrichissement des VE dérivées d’astrocytes (VED) à partir de plasma humain. Tout d’abord, les VE sont enrichis à partir de plasma défibriné par précipitation à base de polymères. S’ensuit l’enrichissement des VEDA par immunocapture basée sur ACSA-1 avec des microbilles magnétiques, où les VE remis en suspension sont chargés sur une colonne placée dans un champ magnétique. Les véhicules électriques ACSA-1+ marqués magnétiquement sont conservés dans la colonne, tandis que les autres véhicules électriques circulent. Une fois la colonne retirée de l’aimant, les ADEV sont élués et sont prêts à être stockés et analysés. Pour valider l’enrichissement des marqueurs astrocytaires, la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), ou d’autres marqueurs astrocytaires spécifiques d’origine intracellulaire, peuvent être mesurés dans l’éluat et comparés à l’écoulement. Ce protocole propose une méthode simple et rapide pour enrichir les ADEV à partir de plasma qui peut être utilisée comme plate-forme pour examiner les marqueurs pertinents pour les astrocytes.
Les vésicules extracellulaires (VE) sont un groupe hétérogène de nanoparticules membraneuses sécrétées par tous les types de cellules, transportant des protéines, des lipides et des acides nucléiques1. Les microvésicules (100-1000 nm), les exosomes (30-100 nm) et les corps apoptotiques (1000-5000 nm) constituent les principaux types de VE, qui se distinguent par leur site d’origine 2,3. Les VE régulent des processus physiologiques importants, tels que la présentation de l’antigène et les réponses immunitaires4, le recyclage des récepteurs, l’élimination des métabolites5 et la communication cellulaire6. La régulation de ces processus peut se produire par liaison directe entre les protéines enrichies dans la membrane cellulaire EV et les cibles dans les cellules réceptrices, et/ou par l’internalisation et la libération de leur cargaison dans le cytoplasme de la cellule réceptrice7. Bien que les VE remplissent des fonctions cellulaires essentielles, elles suscitent un intérêt croissant d’un point de vue pathologique dans les domaines du cancer et de la neurologie. En effet, plusieurs études ont montré que les VE peuvent aider à favoriser la migration des cellules tumorales 8,9 ou les agrégats de protéines toxiques des graines dans les maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer10,11.
Les VE peuvent être sélectionnées et enrichies à partir de biofluides en fonction de marqueurs de surface cellulaire liés à leur cellule d’origine, reflétant ainsi l’environnement d’un tissu spécifique dans leur cargaison 12,13,14,15,16,17,18,19,20. De plus, compte tenu de leur présence dans le sang, le liquide céphalo-rachidien (LCR), la salive, l’urine et le lait maternel, les VE représentent un excellent outil non invasif de diagnostic et peuvent être considérées comme une biopsie liquide pour la découverte de biomarqueurs. Ceci est d’un intérêt particulier en neurologie, étant donné les difficultés d’étudier les analytes cérébraux dans des fluides accessibles autres que le LCR.
Les astrocytes suscitent un intérêt croissant, car ils se trouvent à l’intersection de la communication neurovasculaire21. Dans des conditions physiologiques, ils sont responsables de la préservation de la barrière hémato-encéphalique, du recyclage des neurotransmetteurs, de l’apport de nutriments et de facteurs de croissance aux neurones et autres cellules gliales 22,23,24 ainsi que de la défense neuro-immunitaire, compte tenu de leur plasticité métabolique des états pro-inflammatoires aux états anti-inflammatoires et vice versa 25,26,27. Un mécanisme important par lequel les astrocytes accomplissent leurs fonctions régulatrices est la communication par l’intermédiaire des VE28,29. L’astrocytose réactive est une caractéristique clé de plusieurs maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer30, l’atrophie multisystématisée (AMS), la paralysie supranucléaire progressive (PSP)31 et la sclérose latérale amyotrophique (SLA)32. La réactivité des astrocytes peut entraîner une altération de la cargaison EV, la libération de médiateurs inflammatoires et une communication cellulaire aberrante, facilitant ainsi la propagation de la pathologie et conduisant à la neurodégénérescence10,11. Par conséquent, l’étude des VE dérivées des astrocytes (ADEV) et des changements dans leur cargaison est une ressource intéressante pour examiner les processus neurodégénératifs de manière non invasive.
À l’heure actuelle, il existe plusieurs méthodologies pour l’isolement des VE, chacune avec ses avantages et ses inconvénientscorrespondants 33. Il est essentiel de déterminer quelle méthode est la plus adaptée à un usage spécifique, en fonction de l’application finale qui vous intéresse. Dans le domaine de la neurologie, et plus particulièrement dans les études sur les astrocytes, la précipitation à base de polymères suivie d’une immunocapture a été la méthode la plus utilisée 12,18,19,20,34. Cependant, même en appliquant la même approche, il reste une hétérogénéité entre les études dans les différentes étapes appliquées pour l’isolement des VE. Par conséquent, il est nécessaire de disposer d’une méthodologie claire, étape par étape, normalisée pour faciliter les études sur les VE des astrocytes et la reproductibilité des études. La précipitation à base de polymères facilite le criblage de biomarqueurs, car il s’agit d’une procédure simple et rapide qui ne nécessite pas d’équipement complexe, ce qui permet d’obtenir un rendement élevé de VE sans affecter leur activité biologique35.
Le présent protocole décrit une méthode simple, détaillée et détaillée en deux étapes pour l’enrichissement des VEDA à partir de plasma humain. Il est basé sur une précipitation à base de polymères de la fraction totale des VE, suivie d’une immunocapture des VE des astrocytes. Compte tenu de l’importance des fonctions des astrocytes, l’analyse des ADEV pourrait éclairer la découverte de biomarqueurs et de voies inflammatoires cérébrales qui peuvent être étudiés de manière non invasive.
La recherche décrite dans ce protocole a été menée avec des échantillons de plasma humain provenant de donneurs adultes en bonne santé des deux sexes (tranche d’âge 65,9-81,3 ans, 45,5 % de femmes), de la cohorte de l’Initiative de Sant Pau sur la neurodégénérescence (SPIN), Barcelone, Espagne36. Les participants ont donné leur consentement éclairé. L’étude a été menée conformément aux directives éthiques internationales pour la recherche médicale contenues dans la déclaration d’Helsinki et la loi espagnole. Le Comité d’éthique de la recherche de Sant Pau (CEIC) a examiné et approuvé le protocole de collecte et de stockage des échantillons de plasma humain de la cohorte SPIN (#16/2013).
1. Enrichissement des VE astrocytaires à partir de plasma humain
REMARQUE : Ce protocole implique l’utilisation d’échantillons de plasma humain. Tous les détails sur les réactifs et le matériel de laboratoire utilisés dans ce protocole sont inclus dans la table des matériaux. Aucun équipement spécial n’est requis pour cette procédure, cependant, veuillez examiner les considérations de sécurité de chaque réactif, comme spécifié individuellement par chaque fabricant.
Figure 1 : Représentation schématique de la procédure en deux étapes pour l’enrichissement des VE dérivées d’astrocytes. Dans un premier temps, les VE sont enrichis à partir de plasma humain défibriné par des étapes de précipitation et de centrifugation à base de polymères. Après la remise en suspension totale des VE, les VE des astrocytes sont ensuite sélectionnées par immunocapture avec des anticorps anti-GLAST biotinylés (ACSA-1) et des microbilles magnétiques anti-biotine. Abréviations : ACSA-1 = antigène de surface des cellules astrocytaires-1 ; ADEV = vésicules extracellulaires dérivées d’astrocytes ; DPBS = solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco ; EV = vésicules extracellulaires ; GLAST = transporteur de glutamate-aspartate ; Pas d’ADEV = vésicules extracellulaires non astrocytaires ; Pas de VEs = Pas de vésicules extracellulaires (plasma appauvri en EV) ; PIC = cocktail d’inhibiteurs de protéase ; RT = température ambiante. Figurine créée avec BioRender. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Validation du protocole
3. Analyse des données
L’isolement des VEDA à partir de plasma prélevé sur des donneurs sains a été réalisé avec succès. Une méthode de précipitation à base de polymères a été utilisée pour obtenir la fraction totale de VE, suivie d’une immunocapture avec des microbilles magnétiques pour obtenir des VED.
L’analyse par transfert Western de la fraction totale de VE avant l’étape d’immunocapture a indiqué l’absence de calnexine (marqueur de contamination c...
Les VE ont suscité un fort intérêt dans la recherche biomédicale en raison de leur potentiel diagnostique et thérapeutique. Actuellement, l’un des principaux handicaps liés aux méthodes d’isolement des VE est l’absence de consensus méthodologique et de protocoles standardisés. Cette étude fournit un protocole détaillé pour l’enrichissement des VE astrocytaires à partir du plasma humain par précipitation à base de polymères et immunocapture BLAST.
Le Dr Belbin a déclaré avoir reçu des honoraires personnels d’ADx NeuroSciences en dehors des travaux soumis. Le Dr Alcolea a déclaré avoir reçu des honoraires personnels pour des services au sein d’un conseil consultatif et/ou des honoraires de conférencier de Fujirebio-Europe, Roche, Nurtricia, Krka Farmacéutica, Zambon S.A.U. et Esteve en dehors du travail soumis. Le Dr Lleó a été consultant ou membre de conseils consultatifs pour Fujirebio-Europe, Roche, Biogen, Grifols et Nutricia en dehors des travaux soumis. Le Dr Fortea a déclaré avoir reçu des honoraires personnels pour ses services au sein des conseils consultatifs, des comités de sélection ou des honoraires de conférencier d’AC Immune, de Novartis, de Lundbeck, de Roche, de Fujirebio et de Biogen en dehors du travail soumis. Les Drs Alcolea, Belbin, LLeó et Fortea déclarent détenir un brevet pour des marqueurs de synaptopathie dans les maladies neurodégénératives (sous licence ADx, EPI8382175.0). Aucune autre divulgation n’a été signalée. Tous les autres auteurs n’ont rien d’autre à divulguer.
Les auteurs tiennent à remercier Soraya Torres, Shaimaa El Bounasri El Bennadi et Oriol Sanchez Lopez pour la manipulation et la préparation des échantillons. Nous tenons également à souligner la collaboration de José Amable Bernabé, de l’ICTS « NANBIOSIS », unité 6 (Unité de CIBER en Bioingénierie, Biomatériaux et Nanomédecine) de l’Institut de Science des Matériaux de Barcelone, Marti de Cabo Jaume de l’Unité de Microscopie Electronique de l’Universitat Autonoma de Barcelone, Dr. Marta Soler Castany et Lia Ros Blanco de la Plateforme de Cytométrie en Flux de l’Institut de Recherche Biomédicale de Sant Pau (IIB-Sant Pau), ainsi que le Dr Joan Carles Escolà-Gil du groupe de physiopathologie des maladies liées aux lipides de l’IIB-Sant Pau pour son aide dans les déterminations NTA, cryo-EM, Luminex et ApoB, respectivement.
Les auteurs remercient le soutien financier de la Fondation Jérôme Lejeune (Projet #1941 et #1913 à l’IMF et au MCI), de l’Instituto de Salud Carlos III (PI20/01473 à JF, PI20/01330 à AL, PI18/00435 à DA et INT19/00016 à DA), de l’Institut national de la santé (1R01AG056850-01A1, R21AG056974 et R01AG061566 à JF), de l’Alzheimer’s Association et du Global Brain Health Institute (GBHI_ALZ-18-543740 à MCI), l’Association pour la dégénérescence frontotemporale (bourse postdoctorale de recherche clinique, AFTD 2019-2021) à l’ODI, et la Societat Catalana de Neurologia (Premi Beca Fundació SCN 2020 au MCI). Ces travaux ont également été soutenus par le programme CIBERNED (Programme 1, Maladie d’Alzheimer à l’AL et étude SIGNAL. SS est récipiendaire d’une bourse postdoctorale « Juan de la Cierva-Incorporación » (IJC2019-038962-I) de l’Agencia Estatal de Investigación, Ministerio de Ciencia e Innovación (Gobierno de España).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anti-Alix primary antibody for Western blotting | EMD Millipore | ABC40 | |
µMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-602 | The µMACS Separator is used in combination with µ Columns and MACS MicroBeads. |
Anti-calnexin primary antibody for Western blotting | Genetex | GTX109669 | |
Anti-CD9 primary antibody for Western blotting | Cell Signaling | 13174 | |
Blocker BSA (10%) 200 mL | Thermo Fisher | 37525 | |
Bransonic 1510E-MT Ultrasonic bath | Branson | ||
COBAS 6000 autoanalyzer | Roche Diagnostics | Analyzer for immunoturbidimetric determination of ApoB; commercial autoanalyzer | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (EDTA-free) | Roche | 11873580001 | |
Digital Micrograph 1.8 | micrograph software | ||
Dulbecco's PBS Mg++, Ca++ free 500 mL | Thermo Fisher | 14190144 | |
EveryBlot Blocking Buffer | BioRad | 12010020 | |
Exoquick (exosome precipitation solution 5 mL) + Thrombin | System Bioscience | EXOQ5TM-1 | ExoQuick 20 mL can also be purchased (EXOQ20A-1) |
Gatan 895 USC 4000 | camera | ||
GeneGnome XRQ chemiluminiscence imaging system | Syngene | ||
Human CD81 antigen (CD81) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL004960HU | |
Human Programmed cell death 6-interacting protein (PDCD6IP) ELISA kit | Cusabio | CSB-EL017673HU | |
Immun-Blot PVDF Membrane | BioRad | 1620177 | |
JEOL 2011 transmission electron microscope | JEOL LTD | Equipped with a CCD Gatan 895 USC 4000 camera (Gatan 626, Gatan, Pleasanton, USA) | |
Lavender EDTA BD Vacutainer K2E tubes | Becton dickinson | 367525 | |
Leica EM GP | Leica Microsystem | commercial plunge freezer | |
Low binding microtubes 1,5 mL | Deltalab | 4092.3NS | |
MACS µ Columns with plungers | Miltenyi Biotec | 130-110-905 | µ Columns with plungers are especially designed for isolation of exosomes from body fluids |
MACS Multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MAGPIX plate reader | Luminex Corporation | 80-073 | Luminex's xMAP multiplexing unit (Luminex xPonent v 4.3 software) |
MicroBead Kit100 μL Anti-GLAST (ACSA-1)-Biotin, human, mouse, rat – small size; 100 μL Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-095- 825 | |
MILLIPLEX MAP Kit Human cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A magnetic bead panel | EMD Millipore | HCYTA-60K-25 | |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent 25 mL | Thermo Fisher | 78503 | For certain applications like Western blot, more aggressive lysis buffers can be used (e.g. RIPA) |
MultiSkan SkyHigh Microplate Spectrophotometer | Thermofisher | A51119500C | |
NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NTA; 3.4 version | |
Pierce Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher | 78441 | |
Polypropylene syringe (G29) | PeroxFarma | 1mL syringe; 0.33x12mm-G29x1/2" | |
Secondary anti-rabbit antibody | Thermo Fisher | 10794347 | |
Simoa GFAP Discovery Kit | Quanterix | 102336 | |
Simoa, SR-X instrument | Quanterix | SR-X Ultra-Sensitive Biomarker Detection System; commercial biomarker detection technology | |
Specific Protein Test Apolipoprotein B - APOB (100 det) COBAS C/CI | Roche Diagnostics | 3032574122 | |
SuperSignal West Femto | Thermo Fisher | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) HRP substrate |
Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | 1704150 |
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