Kanser Epigenetiği Araştırmaları için ATAC-Seq Optimizasyonu

Özet

ATAC-seq, transkripsiyon faktörlerinin aracılık ettiği kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikleri haritalamak için hiperaktif mutant transpozaz Tn5'i kullanan bir DNA dizileme yöntemidir. ATAC-seq, kanser hücrelerinde fenotipik değişikliklerin altında yatan moleküler mekanizmaların keşfedilmesini sağlar. Bu protokol, kanser hücreleri de dahil olmak üzere epitel hücre tiplerinde ATAC-seq için optimizasyon prosedürlerini özetlemektedir.

Özet

Yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişimli kromatin testi, hiperaktif Tn5 transpozaz kullanılarak deoksiribonükleik asit (DNA) erişilebilirliğini araştırır. Tn5, erişilebilir kromatin bölgelerinde yüksek verimli dizileme için adaptörleri keser ve bağlar. Ökaryotik hücrelerde, genomik DNA, transkripsiyonel makineye fiziksel bir bariyer görevi gören DNA, histonlar ve diğer proteinlerden oluşan bir kompleks olan kromatine paketlenir. Dışsal sinyallere yanıt olarak, transkripsiyon faktörleri, gen aktivasyonu için transkripsiyonel makinelere erişimi sağlamak için kromatin yeniden şekillendirme komplekslerini işe alır. Bu nedenle, açık kromatin bölgelerinin tanımlanması, kanser progresyonu gibi biyolojik olaylar sırasında arttırıcı ve gen promotör aktivitelerini izlerken yararlıdır. Bu protokolün kullanımı kolay olduğundan ve düşük hücre girişi gereksinimine sahip olduğundan, ATAC-seq, kanser hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde açık kromatin bölgelerini tanımlamak için yaygın olarak benimsenmiştir. Başarılı veri toplama için, ATAC-seq kütüphaneleri hazırlanırken birkaç parametrenin dikkate alınması gerekir. Bunlar arasında, hücre lizis tamponunun seçimi, Tn5 enziminin titrasyonu ve hücrelerin başlangıç hacmi, kanser hücrelerinde ATAC-seq kütüphanesinin hazırlanması için çok önemlidir. Optimizasyon, yüksek kaliteli veriler oluşturmak için gereklidir. Burada, epitel hücre tipleri için ATAC-seq optimizasyon yöntemlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz.

Giriş

Kromatin erişilebilirliği, genom çapında bir ölçekte gen ekspresyonunun düzenlenmesi için anahtar bir gerekliliktir¹. Kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikler sıklıkla kanser ^2,3,4 dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarıyla ilişkilidir. Yıllar geçtikçe, araştırmacıların kromatin erişilebilirliğinin bölgelerini haritalayarak kromatin manzarasını araştırmalarını sağlamak için çok sayıda teknik geliştirilmiştir. Bunlardan bazıları DNase-seq (DNase I aşırı duyarlı bölgeler dizilimi)⁵, FAIRE-seq (düzenleyici elemanların form....

Protokol

1. Deneye başlamadan önce hazırlıklar

1. Lizis tampon stoğu hazırlayın.
   NOT: Optimum nükleer izolasyon tamponu her hücre tipi için farklı olabilir. Hem orijinal kağıt^8'de kullanılan hipotonik tamponu hem de her hücre tipi için CSK tamponu^12,13'ü tripan mavisi boyama kullanarak test etmenizi öneririz.
   1. Hipotonik tampon (Greenleaf tamponu) hazırlamak için 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ ve% 0.1 NP-40 karıştırın.
   2. CSK tamponu hazırlamak için 10 mM BORULAR pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM sakaroz, 3 mM MgCl₂ ve %0.1 T....

Sonuçlar

Başarılı ve yüksek kaliteli ATAC-seq verileri elde etmek için, deneysel koşulları optimize etmek önemlidir. ATAC-seq kütüphanesi hazırlığı beş ana adıma ayrılabilir (Şekil 1), yani hücre lizisi, tagmentasyon (Tn5 ile parçalanma ve adaptör yerleştirme), genomik DNA saflaştırma, PCR amplifikasyonu ve veri analizi. İlk işlem olarak, hücre lizisi (nükleer izolasyon) tamponu önce her hücre tipi için optimize edilmelidir. Meme kanseri hücrelerini lize etmek için or.......

Tartışmalar

ATAC-seq, açık ve aktif kromatin bölgelerini haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kanser hücresi ilerlemesi sıklıkla genetik değişiklikler ve epigenetik yeniden programlama tarafından yönlendirilir, bu da kromatin erişilebilirliğinin ve gen ekspresyonunun değişmesine neden olur. Bu yeniden programlamanın bir örneği, tümör metastazı³⁰ sırasında anahtar hücresel yeniden programlama süreçleri olduğu bilinen epitel-mezenkimal geçiş (EMT) ve ters süreci olan.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500	Natural
10 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-3810	Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tips	USA Scientific	1182-1830	Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-1840	Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352096
20 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1183-1810	Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1180-8810	Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge Tubes	Fisherbrand	06-443-19
Agarose	ThermoFisher Scientific	YBP136010	Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCC	ATCC
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman Coulter	364658	SX2415
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	Bead purification kit
CellDrop Cell Counter	DeNovix	CellDrop FL	Cell counter
EDTA	MilliporeSigma	EDS	BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTA	MilliporeSigma	E3889
Ethanol 100%	ThermoFisher Scientific	AC615100020	Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET Tested	R&D Systems	S10350	Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1x	ThermoFisher Scientific	11965092	[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1x	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1x	ThermoFisher Scientific	25200056	(0.25%), phenol red
Glycerol	IBI Scientific	56-81-5
Glycine	MilliporeSigma	G8898
HCl	MilliporeSigma	H1758
HEPES	MilliporeSigma	H3375
Invitrogen Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q32857
MgCl2	MilliporeSigma	M3634
MinElute PCR Purification kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
NaCl	IBI Scientific	7647-14-5
NaOH	MilliporeSigma	S8045	BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541
Nextera DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-121-1030	2x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)	MilliporeSigma	I8896	for molecular biology
PCR Detection System	BioRad	1855484	CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPES	MilliporeSigma	P1851	BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kit	ThermoFisher Scientific	Q32854	Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay Tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856	Invitrogen
SDS	MilliporeSigma	L3771
Sodium Acetate	Homemade	-	pH 5.2
Sucrose	IBI Scientific	57-50-1
SYBR Gold	ThermoFisher Scientific	S11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mL	BioRad	1708882
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips	USA Scientific	1402-4700	Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATE	USA Scientific	1438-4700	Single notch. Natural polypropylene
Tris Base	MilliporeSigma	648311	ULTROL Grade
Triton x-100	IBI Scientific	9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit	Illumina	PE-121-1003	paired-end
Trypan Blue Stain	ThermoFisher Scientific	Q32851
Tween-20	MilliporeSigma	P7949	BioXtra, viscous liquid
Water	MilliporeSigma	W3500	sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture