Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

ATAC-seq, transkripsiyon faktörlerinin aracılık ettiği kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikleri haritalamak için hiperaktif mutant transpozaz Tn5'i kullanan bir DNA dizileme yöntemidir. ATAC-seq, kanser hücrelerinde fenotipik değişikliklerin altında yatan moleküler mekanizmaların keşfedilmesini sağlar. Bu protokol, kanser hücreleri de dahil olmak üzere epitel hücre tiplerinde ATAC-seq için optimizasyon prosedürlerini özetlemektedir.

Özet

Yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişimli kromatin testi, hiperaktif Tn5 transpozaz kullanılarak deoksiribonükleik asit (DNA) erişilebilirliğini araştırır. Tn5, erişilebilir kromatin bölgelerinde yüksek verimli dizileme için adaptörleri keser ve bağlar. Ökaryotik hücrelerde, genomik DNA, transkripsiyonel makineye fiziksel bir bariyer görevi gören DNA, histonlar ve diğer proteinlerden oluşan bir kompleks olan kromatine paketlenir. Dışsal sinyallere yanıt olarak, transkripsiyon faktörleri, gen aktivasyonu için transkripsiyonel makinelere erişimi sağlamak için kromatin yeniden şekillendirme komplekslerini işe alır. Bu nedenle, açık kromatin bölgelerinin tanımlanması, kanser progresyonu gibi biyolojik olaylar sırasında arttırıcı ve gen promotör aktivitelerini izlerken yararlıdır. Bu protokolün kullanımı kolay olduğundan ve düşük hücre girişi gereksinimine sahip olduğundan, ATAC-seq, kanser hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde açık kromatin bölgelerini tanımlamak için yaygın olarak benimsenmiştir. Başarılı veri toplama için, ATAC-seq kütüphaneleri hazırlanırken birkaç parametrenin dikkate alınması gerekir. Bunlar arasında, hücre lizis tamponunun seçimi, Tn5 enziminin titrasyonu ve hücrelerin başlangıç hacmi, kanser hücrelerinde ATAC-seq kütüphanesinin hazırlanması için çok önemlidir. Optimizasyon, yüksek kaliteli veriler oluşturmak için gereklidir. Burada, epitel hücre tipleri için ATAC-seq optimizasyon yöntemlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz.

Giriş

Kromatin erişilebilirliği, genom çapında bir ölçekte gen ekspresyonunun düzenlenmesi için anahtar bir gerekliliktir1. Kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikler sıklıkla kanser 2,3,4 dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarıyla ilişkilidir. Yıllar geçtikçe, araştırmacıların kromatin erişilebilirliğinin bölgelerini haritalayarak kromatin manzarasını araştırmalarını sağlamak için çok sayıda teknik geliştirilmiştir. Bunlardan bazıları DNase-seq (DNase I aşırı duyarlı bölgeler dizilimi)5, FAIRE-seq (düzenleyici elemanların form....

Protokol

1. Deneye başlamadan önce hazırlıklar

  1. Lizis tampon stoğu hazırlayın.
    NOT: Optimum nükleer izolasyon tamponu her hücre tipi için farklı olabilir. Hem orijinal kağıt8'de kullanılan hipotonik tamponu hem de her hücre tipi için CSK tamponu12,13'ü tripan mavisi boyama kullanarak test etmenizi öneririz.
    1. Hipotonik tampon (Greenleaf tamponu) hazırlamak için 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 ve% 0.1 NP-40 karıştırın.
    2. CSK tamponu hazırlamak için 10 mM BORULAR pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM sakaroz, 3 mM MgCl2 ve %0.1 T....

Sonuçlar

Başarılı ve yüksek kaliteli ATAC-seq verileri elde etmek için, deneysel koşulları optimize etmek önemlidir. ATAC-seq kütüphanesi hazırlığı beş ana adıma ayrılabilir (Şekil 1), yani hücre lizisi, tagmentasyon (Tn5 ile parçalanma ve adaptör yerleştirme), genomik DNA saflaştırma, PCR amplifikasyonu ve veri analizi. İlk işlem olarak, hücre lizisi (nükleer izolasyon) tamponu önce her hücre tipi için optimize edilmelidir. Meme kanseri hücrelerini lize etmek için or.......

Tartışmalar

ATAC-seq, açık ve aktif kromatin bölgelerini haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kanser hücresi ilerlemesi sıklıkla genetik değişiklikler ve epigenetik yeniden programlama tarafından yönlendirilir, bu da kromatin erişilebilirliğinin ve gen ekspresyonunun değişmesine neden olur. Bu yeniden programlamanın bir örneği, tümör metastazı30 sırasında anahtar hücresel yeniden programlama süreçleri olduğu bilinen epitel-mezenkimal geçiş (EMT) ve ters süreci olan.......

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalede açıklanan araştırmalarla ilgili ilgili veya maddi finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

UND Genomics Core tesisine olağanüstü teknik yardım için minnettarız.

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri [P20GM104360 - M.T., P20 GM104360 - AD] ve Kuzey Dakota Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi, Biyomedikal Bilimler Bölümü [MT'ye] tarafından sağlanan başlangıç fonları tarafından finanse edildi.

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5500Natural
10 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-3810Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tipsUSA Scientific1182-1830Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-1840Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge TubesCorning352096
20 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1183-1810Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1180-8810Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge TubesFisherbrand06-443-19
AgaroseThermoFisher ScientificYBP136010Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCCATCC
Allegra X-30R CentrifugeBeckman Coulter364658SX2415
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881Bead purification kit
CellDrop Cell CounterDeNovixCellDrop FLCell counter
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTAMilliporeSigmaE3889
Ethanol 100%ThermoFisher ScientificAC615100020Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET TestedR&D SystemsS10350Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0.25%), phenol red
GlycerolIBI Scientific56-81-5
GlycineMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR Purification kitQiagen28004DNA purification kit
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-121-10302x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896for molecular biology
PCR Detection SystemBioRad1855484CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kitThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
Sodium AcetateHomemade-pH 5.2
SucroseIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mLBioRad1708882
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-4700Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700Single notch. Natural polypropylene
Tris BaseMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer KitIlluminaPE-121-1003paired-end
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, viscous liquid
WaterMilliporeSigmaW3500sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture

Referanslar

  1. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  2. Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 184Kromatin eri ilebilirli itranspozazd zenleyici unsurlargen ekspresyonukanser epigeneti i

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır