Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

ATAC-seq, transkripsiyon faktörlerinin aracılık ettiği kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikleri haritalamak için hiperaktif mutant transpozaz Tn5'i kullanan bir DNA dizileme yöntemidir. ATAC-seq, kanser hücrelerinde fenotipik değişikliklerin altında yatan moleküler mekanizmaların keşfedilmesini sağlar. Bu protokol, kanser hücreleri de dahil olmak üzere epitel hücre tiplerinde ATAC-seq için optimizasyon prosedürlerini özetlemektedir.

Özet

Yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişimli kromatin testi, hiperaktif Tn5 transpozaz kullanılarak deoksiribonükleik asit (DNA) erişilebilirliğini araştırır. Tn5, erişilebilir kromatin bölgelerinde yüksek verimli dizileme için adaptörleri keser ve bağlar. Ökaryotik hücrelerde, genomik DNA, transkripsiyonel makineye fiziksel bir bariyer görevi gören DNA, histonlar ve diğer proteinlerden oluşan bir kompleks olan kromatine paketlenir. Dışsal sinyallere yanıt olarak, transkripsiyon faktörleri, gen aktivasyonu için transkripsiyonel makinelere erişimi sağlamak için kromatin yeniden şekillendirme komplekslerini işe alır. Bu nedenle, açık kromatin bölgelerinin tanımlanması, kanser progresyonu gibi biyolojik olaylar sırasında arttırıcı ve gen promotör aktivitelerini izlerken yararlıdır. Bu protokolün kullanımı kolay olduğundan ve düşük hücre girişi gereksinimine sahip olduğundan, ATAC-seq, kanser hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde açık kromatin bölgelerini tanımlamak için yaygın olarak benimsenmiştir. Başarılı veri toplama için, ATAC-seq kütüphaneleri hazırlanırken birkaç parametrenin dikkate alınması gerekir. Bunlar arasında, hücre lizis tamponunun seçimi, Tn5 enziminin titrasyonu ve hücrelerin başlangıç hacmi, kanser hücrelerinde ATAC-seq kütüphanesinin hazırlanması için çok önemlidir. Optimizasyon, yüksek kaliteli veriler oluşturmak için gereklidir. Burada, epitel hücre tipleri için ATAC-seq optimizasyon yöntemlerinin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz.

Giriş

Kromatin erişilebilirliği, genom çapında bir ölçekte gen ekspresyonunun düzenlenmesi için anahtar bir gerekliliktir1. Kromatin erişilebilirliğindeki değişiklikler sıklıkla kanser 2,3,4 dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarıyla ilişkilidir. Yıllar geçtikçe, araştırmacıların kromatin erişilebilirliğinin bölgelerini haritalayarak kromatin manzarasını araştırmalarını sağlamak için çok sayıda teknik geliştirilmiştir. Bunlardan bazıları DNase-seq (DNase I aşırı duyarlı bölgeler dizilimi)5, FAIRE-seq (düzenleyici elemanların formaldehit destekli izolasyonu)6, MAPit (bireysel şablonlar için metiltransferaz erişilebilirlik protokolü)7 ve bu makalenin odak noktası, ATAC-seq (transpozaz erişilebilir kromatin için tahlil)8'i içerir. DNase-seq, DNaz'ın temel bir özelliğini, yani histonlardan ve transkripsiyonfaktörleri 5 gibi diğer proteinlerden arındırılmış çıplak DNA'nın tercihli sindirimini kullanarak erişilebilir bölgeleri haritalandırır. ChIP-seq'e benzer şekilde FAIRE-seq, immünopresipitasyon söz konusu olmadığı sürece formaldehit çapraz bağlama ve sonikasyon kullanır ve nükleozomsuz bölgeler fenol-kloroform ekstraksiyonu6 ile izole edilir. MAPit yöntemi, tek moleküllü çözünürlük7'de kromatin yapısını araştırmak için bir GC metiltransferaz kullanır. ATAC-seq, hiperaktif transpozaz, Tn58'e dayanır. Tn5 transpozaz, tercihen açık kromatin bölgelerine bağlanır ve sıralama adaptörlerini erişilebilir bölgelere yerleştirir. Tn5, DNA aracılı bir "kes ve yapıştır" mekanizması ile çalışır, böylece adaptörlerle önceden yüklenmiş transpozaz kromatin bölgelerini açmaya bağlanır, DNA'yı keser ve adaptörleribağlar 8. Tn5'e bağlı bölgeler, bu adaptörleri besleyen primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu ile geri kazanılır. FAIRE-seq ve DNase-seq,9'u sıralamadan önce büyük miktarda başlangıç malzemesi (~ 100.000 hücre ila 225.000 hücre) ve ayrı bir kütüphane hazırlama adımı gerektirir. Öte yandan, ATAC-seq protokolü nispeten basittir ve az sayıda hücre gerektirir (<50.000 hücre)10. FAIRE-seq ve DNase-seq tekniklerinin aksine, ATAC-seq'in dizileme kütüphanesi hazırlığı nispeten kolaydır, çünkü izole DNA örneği zaten Tn5 tarafından dizileme adaptörleri ile etiketlenmiştir. Bu nedenle, kütüphane hazırlığını tamamlamak için sadece uygun primerlere sahip PCR amplifikasyon adımına ihtiyaç vardır ve son onarım ve adaptör ligasyonu gibi önceki işlem adımlarının gerçekleştirilmesine gerek yoktur, böylece zamandan tasarruf edilir11. İkincisi, ATAC-seq, MAPit7 için gerekli olan bölgeye özgü primerlerle bisülfit dönüşümü, klonlama ve amplifikasyon ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu avantajlardan dolayı, ATAC-seq açık kromatin bölgelerini tanımlamak için oldukça popüler bir yöntem haline gelmiştir. ATAC-seq yöntemi basit olmasına rağmen, yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir veriler elde etmek için birden fazla adım optimizasyon gerektirir. Bu makalede, standart ATAC-seq kütüphanesi hazırlığı için optimizasyon prosedürleri tartışılmakta ve özellikle üç parametre vurgulanmaktadır: (1) lizis tampon bileşimi, (2) Tn5 transpozaz konsantrasyonu ve (3) hücre sayısı. Ek olarak, bu makale hem kanserli hem de kanserli olmayan yapışkan epitel hücrelerini kullanan optimizasyon koşullarından örnek veriler sunmaktadır.

Protokol

1. Deneye başlamadan önce hazırlıklar

  1. Lizis tampon stoğu hazırlayın.
    NOT: Optimum nükleer izolasyon tamponu her hücre tipi için farklı olabilir. Hem orijinal kağıt8'de kullanılan hipotonik tamponu hem de her hücre tipi için CSK tamponu12,13'ü tripan mavisi boyama kullanarak test etmenizi öneririz.
    1. Hipotonik tampon (Greenleaf tamponu) hazırlamak için 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 ve% 0.1 NP-40 karıştırın.
    2. CSK tamponu hazırlamak için 10 mM BORULAR pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM sakaroz, 3 mM MgCl2 ve %0.1 Triton X-100'ü karıştırın.
  2. Hücre kültürü koşullarının optimal olduğundan emin olun; Yüksek apoptoz seviyeleri olmadığından emin olmak için hücreleri bir ışık mikroskobu altında inceleyin.
  3. Santrifüjü 4 ° C'ye ulaşması için açın.

2. Hücre hasadı

  1. Ortamları% <80 oranında bir hücre kültüründen aspire edin. Hücreler tipik olarak, ihtiyaç duyulan hücre sayısına, tedavilere vb. bağlı olarak 35 mm veya 60 mm'lik bir tabakta yetiştirilir.
  2. Hücreleri 1 mL veya 3 mL PBS ile yıkayın.
  3. 0,5 mL veya 1 mL Tripsin ekleyin ve 2-3 dakika kuluçkaya yatırın (hücre tiplerine bağlı olarak). İyice karıştırmak için 1 mL'lik bir pipeti dikkatlice kullanın.
  4. Plakaya 1 mL veya 2 mL ortam ekleyin ve iyice karıştırın. 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpte 300 x g'da 3 dakika boyunca santrifüj edin.
    NOT: Hücre kaybını en aza indirmek için sallanan bir kova rotoru önerilir.
  5. Medyayı aspire edin ve hücreleri 1 mL veya 2 mL ortamda yeniden askıya alın.
    NOT: Homojen tek hücreli bir çözelti hazırlamak çok önemlidir. Dokular için, dokuları homojenize etmek ve büyük hücre kümelerini veya agregalarını en aza indirmek için bir Dounce homojenizatörü kullanılabilir. Bazı dokular, canlı hücreleri izole etmek ve tek bir hücre çözeltisi elde etmek için filtrasyon (örneğin, hücre süzgeçleri) ve / veya FACS hücre sıralama gerektirir.
  6. Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın.
    NOT: Bu çalışmada otomatik hücre sayacı (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.
  7. Gerekli hücre hacmini (örneğin, hücre sayısına göre 1 x 106 hücre içeren bir hacim) oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
  8. 1 mL soğuk PBS'de 1 x 106 hücre içeren hücre peletini yeniden askıya alın.
    NOT: Hücre sayıları 1 x 10 6 hücreden azsa, hücre çözeltisini aynı konsantrasyonda (1 x 106 hücre/mL) hazırlamak için soğuk PBS hacmini azaltın.

3. Hücre lizisi

  1. 25 μL (= 2,5 x 104 hücre) yeni bir 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 4 °C'de 500 x g'de 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı dikkatlice atın
    NOT: Hücre kaybını en aza indirmek için sallanan bir kova rotoru önerilir. Hücrelerin atılmadığından emin olmak için yaklaşık 3 μL süpernatant bırakın.
  2. 25 μL lizis tamponu ekleyin ve yukarı ve aşağı hafifçe pipetleme yaparak hücreleri yeniden askıya alın. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatın
  3. 4 ° C'de 500 x g'de 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatanı dikkatlice atın.
    NOT: Hücre kaybını en aza indirmek için sallanan bir kova rotoru önerilir. Hücrelerin atılmadığından emin olmak için yaklaşık 3 μL süpernatant bırakın.

4. Tn5 etiketleme

  1. Peleti derhal 25 μL Tn5 reaksiyon karışımında yeniden askıya alın. Tn5 reaksiyon karışımı aşağıdaki gibidir: 12.5 μL 2x Tagmentasyon DNA tamponu (TD tamponu), 1.25-5 μL Tn5 transpozaz ve 11.25-7.5 μL nükleaz içermeyen su.
    NOT: Tn5'in standart konsantrasyonu, 2,5 x 10 4 hücre için 2,5μL'dir .
  2. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    NOT: Çözeltiyi her 10 dakikada bir karıştırın.

5. DNA saflaştırma

NOT: Amplifikasyondan önce saflaştırma gereklidir. DNA saflaştırma, MinElute PCR saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) kullanılarak yapılır.

  1. 5 μL 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ekleyin.
  2. Hemen 125 μL Tampon PB ekleyin ve iyice karıştırın.
  3. 2. adımdan itibaren PCR saflaştırma kiti protokolünü takip edin.
    1. Döndürme kolonunu 2 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin.
    2. Numuneyi döndürme kolonuna uygulayın ve RT'de 17.900 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
    3. Akışı atın ve sıkma kolonunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin.
    4. Döndürme kolonuna 750 μL Tampon PE ekleyin ve RT'de 17.900 x g'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
    5. Akışı atın ve sıkma kolonunu aynı toplama tüpüne geri yerleştirin.
    6. Membranı tamamen kurutmak için sıkma kolonunu 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    7. Akışı atın ve sıkma kolonunu yeni bir 1,7 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
    8. DNA fragmanlarını 10 μL Tampon EB ile etkisiz hale getirin.
    9. Kolonun RT'de 1 dakika beklemesine izin verin.
    10. DNA'yı sulandırmak için RT'de 17.900 x g'da 1 dakika santrifüj yapın.

6. PCR amplifikasyonu

NOT: Transpoze (etiketli) DNA'ların PCR amplifikasyonu dizileme için gereklidir. Bu örnekte Nextera kit adaptörleri (Malzeme Tablosu) kullanılmıştır. Bu çalışmada kullanılan primerler Tablo 1'de listelenmiştir.

  1. 200 μL PCR tüplerinde aşağıdaki PCR reaksiyonunu ayarlayın (her numune için 50 μL). PCR reaksiyon karışımı aşağıdaki gibidir: 10 μL salınımlı DNA (adım 5.), 2,5 μL 25 mM Adaptör 1, 2,5 μL 25 mM Adaptör 2, 25 μL 2x PCR ana karışımı ve 10 μL nükleaz içermeyen su
  2. PCR amplifikasyon programı bölüm 1 (Tablo 2) gerçekleştirin.
    NOT: İlk amplifikasyon için, standart bir termal döngüleyici kullanan tüm numuneler için aynı koşullar kullanılır.
  3. Gerçek zamanlı qPCR (numune başına toplam 14,5 μL)
    1. PCR amplifikasyon bölümü 1'deki (adım 6.2.) ürünün 5 μL'sini kullanarak, bu kez SYBR altını ve gerçek zamanlı bir PCR makinesinde algılama dahil olmak üzere aşağıdaki reaksiyonu ayarlayın.
    2. PCR reaksiyon karışımını aşağıdaki gibi hazırlayın: Adım 6.2.'den 5 μL PCR ürünü, 0.75 μL SYBR altın (1000x seyreltilmiş), 5 μL 2x PCR ana karışımı ve 3.75 μL nükleaz içermeyen su.
      NOT: Her numune için doygunluğa ulaşmadan önce kütüphane amplifikasyonu için kesin döngü numaraları, PCR10'daki GC ve boyut yanlılığını azaltmak için qPCR (Tablo 3) ile belirlenir. SYBR Gold, nükleaz içermeyen su ile seyreltildi. Seyreltilmiş çözeltiyi yapmak için, 999 μL nükleaz içermeyen suya 1 μL SYBR Gold (stok konsantrasyonu 10.000x) ilave edildi. Tablo 3'te belirtilen RT-qPCR ürününün çalışma süresi yaklaşık 60 dakikadır.
  4. Adım 6.3'teki çalıştırma parametrelerini kullanarak gerekli ek PCR döngüsü sayısını belirleyin.
    1. Döngü sayısı = 1/4 maksimum (doymuş) floresan yoğunluğu (tipik olarak 3 veya 4 PCR döngüsü)
  5. PCR amplifikasyon programı bölüm 2 (hacim = 45 μL; Tablo 4): Döngü numarasını belirledikten sonra, adım 6.4.1'de hesaplanan ek döngülerle PCR'leri ayarlayın. Örneğin, hesaplanan döngü sayısı 3 ise, aşağıdaki programda 3 döngü ayarlayın. Toplam döngü 8 olacaktır (adım 6.2'de 5, artı adım 6.5'te 3 ek döngü.)

7. Boncuk saflaştırma

NOT: Burada AMPure XP (Malzeme Tablosu) boncukları kullanılmıştır.

  1. Önceki adımda güçlendirilmiş PCR ürünlerine, RT'de 150 μL boncuk ekleyin.
    NOT: Bu işlemde ev yapımı AMPure boncuklar14 kullanılabilir.
  2. RT'de 15 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
  3. Tüpleri 5 dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin.
  4. Süper natantı dikkatlice çıkarın.
  5. Boncukları 200 μL% 80 etanol ile yıkayın.
    NOT: %80 etanol taze hazırlanmalıdır.
  6. 7.4 adımını yineleyin.
  7. Etanol tamamen çıkarın.
  8. RT'de numuneleri 10 dakika boyunca hava ile kurutun.
  9. 50 μL elüsyon tamponu (10 mM Tris-HCL pH 8.0) ile yeniden askıya alın.
  10. Astar kontaminasyonunu daha da azaltmak için boncuk saflaştırmayı tekrarlayın (adım 7.1.-7.9.)

8. DNA konsantrasyonu ve kalite kontrolü

  1. DNA konsantrasyonunu bir nükleik asit niceleme kiti kullanarak ölçün (Malzeme Tablosu).
  2. SYBR Gold (0.5x TBE,% 1.5 agaroz jeli) veya otomatik bir elektroforez sistemi (örneğin, TapeStation, biyoanalizör) kullanarak jel elektroforezi ile güçlendirilmiş DNA fragmanlarını kontrol edin.

9. Sıralama

  1. Güçlendirilmiş DNA örnekleri12,13'ü kullanarak yüksek verimli dizileme gerçekleştirin.
    NOT: Güçlendirilmiş DNA örnekleri, yüksek verimli dizileme için hazırdır. Nükleozomal DNA fragmanı bilgisini korumak için, tek uçlu dizileme yerine çift uçlu dizileme önerilir. DNA fragmanlarının her iki ucu da transpozazın nereye bağlandığını gösterir. Açık kromatin bölgelerini haritalamak için genellikle 30 milyon okuma/örnek yeterlidir.

10. Veri analizi

  1. Temel çağrı kalitesine dayalı veri filtreleme: Minimum ortalama temel kalite puanını 20 olarak ayarlayın (%99 doğruluk).
  2. Adaptör kırpma: Uygun bir alet kullanarak adaptör dizilerini çıkarın.
    NOT: Adaptör dizilerini kaldırmak için Trim Galore sarmalayıcı aracı (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) kullanılmıştır. Illumina Tn5 tarafından hazırlanan ATAC-seq kütüphaneleri için, adaptör dizisi olarak aşağıdaki sıra kullanılır: CTGTCTCTTATACACATCT. Adaptör kontaminasyonunu tanımak için minimum sıra uzunluğu 5 olarak ayarlanır.
  3. Genom haritalama: Aşağıdaki parametreleri kullanarak okumaları Bowtie ile uygun genoma eşleyin "-I 0 -X 2000 -m 1"15. MDA-MB-231 bazal meme kanseri hücrelerinden haritalama kalitesine bir örnek aşağıdadır:
    Bildirilen en az bir hizalamayla okumalar: %52,79
    Hizalanamayan okumalar: %13,10
    -m nedeniyle hizalamaları bastırılmış okumalar: %34,11
  4. Tekilleştirme: Picard araçları16 ile PCR kopyalarını işaretleyin.
  5. Veri görselleştirme için bir genom kapsama dosyası oluşturma: Tekkilleştirilmiş çift uçlu okumaları tek uçlu okuma parçalarına dönüştürün. Genom kapsama izleri, genomeCoverageBed kullanılarak yatak aletlerinden elde edilir17.

Sonuçlar

Başarılı ve yüksek kaliteli ATAC-seq verileri elde etmek için, deneysel koşulları optimize etmek önemlidir. ATAC-seq kütüphanesi hazırlığı beş ana adıma ayrılabilir (Şekil 1), yani hücre lizisi, tagmentasyon (Tn5 ile parçalanma ve adaptör yerleştirme), genomik DNA saflaştırma, PCR amplifikasyonu ve veri analizi. İlk işlem olarak, hücre lizisi (nükleer izolasyon) tamponu önce her hücre tipi için optimize edilmelidir. Meme kanseri hücrelerini lize etmek için or...

Tartışmalar

ATAC-seq, açık ve aktif kromatin bölgelerini haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Kanser hücresi ilerlemesi sıklıkla genetik değişiklikler ve epigenetik yeniden programlama tarafından yönlendirilir, bu da kromatin erişilebilirliğinin ve gen ekspresyonunun değişmesine neden olur. Bu yeniden programlamanın bir örneği, tümör metastazı30 sırasında anahtar hücresel yeniden programlama süreçleri olduğu bilinen epitel-mezenkimal geçiş (EMT) ve ters süreci olan...

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalede açıklanan araştırmalarla ilgili ilgili veya maddi finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

UND Genomics Core tesisine olağanüstü teknik yardım için minnettarız.

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri [P20GM104360 - M.T., P20 GM104360 - AD] ve Kuzey Dakota Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi, Biyomedikal Bilimler Bölümü [MT'ye] tarafından sağlanan başlangıç fonları tarafından finanse edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5500Natural
10 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-3810Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tipsUSA Scientific1182-1830Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-1840Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge TubesCorning352096
20 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1183-1810Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1180-8810Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge TubesFisherbrand06-443-19
AgaroseThermoFisher ScientificYBP136010Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCCATCC
Allegra X-30R CentrifugeBeckman Coulter364658SX2415
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881Bead purification kit
CellDrop Cell CounterDeNovixCellDrop FLCell counter
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTAMilliporeSigmaE3889
Ethanol 100%ThermoFisher ScientificAC615100020Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET TestedR&D SystemsS10350Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0.25%), phenol red
GlycerolIBI Scientific56-81-5
GlycineMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR Purification kitQiagen28004DNA purification kit
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-121-10302x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896for molecular biology
PCR Detection SystemBioRad1855484CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kitThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
Sodium AcetateHomemade-pH 5.2
SucroseIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mLBioRad1708882
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-4700Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700Single notch. Natural polypropylene
Tris BaseMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer KitIlluminaPE-121-1003paired-end
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, viscous liquid
WaterMilliporeSigmaW3500sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture

Referanslar

  1. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  2. Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
  3. Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
  4. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
  5. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  6. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  7. Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
  8. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  9. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
  11. Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
  12. Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
  13. Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
  14. Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  15. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
  16. . Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022)
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  19. Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
  20. Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
  21. Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
  22. Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
  23. Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
  24. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  25. Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
  26. Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
  27. McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
  28. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
  29. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  30. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  31. Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
  32. Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
  33. Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarSay 184Kromatin eri ilebilirli itranspozazd zenleyici unsurlargen ekspresyonukanser epigeneti i

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır