JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

ATAC-seq - это метод секвенирования ДНК, который использует гиперактивную мутантную транспозазу Tn5 для отображения изменений доступности хроматина, опосредованных факторами транскрипции. ATAC-seq позволяет обнаружить молекулярные механизмы, лежащие в основе фенотипических изменений в раковых клетках. Этот протокол описывает процедуры оптимизации для ATAC-seq в типах эпителиальных клеток, включая раковые клетки.

Аннотация

Анализ на транспозаз-доступный хроматин с высокопроизводительным секвенированием (ATAC-seq) проверяет доступность дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с использованием гиперактивной транспозазы Tn5. Адаптеры Tn5 для резки и лигата для высокопроизводительного секвенирования в доступных областях хроматина. В эукариотических клетках геномная ДНК упакована в хроматин, комплекс ДНК, гистонов и других белков, который действует как физический барьер для транскрипционного механизма. В ответ на внешние сигналы транскрипционные факторы рекрутируют комплексы ремоделирования хроматина, чтобы обеспечить доступ к транскрипционному механизму активации генов. Поэтому идентификация открытых областей хроматина полезна при мониторинге активности энхансера и генного промотора во время биологических событий, таких как прогрессирование рака. Поскольку этот протокол прост в использовании и имеет низкую потребность во входе клеток, ATAC-seq был широко принят для определения открытых областей хроматина в различных типах клеток, включая раковые клетки. Для успешного сбора данных при подготовке библиотек ATAC-seq необходимо учитывать несколько параметров. Среди них выбор буфера лизиса клеток, титрование фермента Tn5 и начальный объем клеток имеют решающее значение для подготовки библиотеки ATAC-seq в раковых клетках. Оптимизация необходима для получения высококачественных данных. Здесь мы приводим подробное описание методов оптимизации ATAC-seq для типов эпителиальных клеток.

Введение

Доступность хроматина является ключевым требованием для регуляции экспрессии генов по общегеномной шкале1. Изменения доступности хроматина часто связаны с несколькими болезненными состояниями, включая рак 2,3,4. На протяжении многих лет были разработаны многочисленные методы, позволяющие исследователям исследовать ландшафт хроматина путем картирования областей доступности хроматина. Некоторые из них включают DNase-seq (секвенирование гиперчувствительных сайтов DNase I)5, FAIRE-seq (формальдегидная изоляция регуляторных элементов)6, MAPit (протокол доступности метилтрансферазы для отдельных шаблонов)7 и фокус данной статьи, ATAC-seq (анализ для транспозаз-доступного хроматина)8. DNase-seq отображает доступные области, используя ключевую особенность ДНКазы, а именно предпочтительное переваривание голой ДНК, свободной от гистонов и других белков, таких как факторы транскрипции5. FAIRE-seq, подобно ChIP-seq, использует сшивание формальдегида и обработку ультразвуком, за исключением того, что иммунопреципитация не участвует, а области, свободные от нуклеосом, выделяются экстракцией фенол-хлороформа6. Метод MAPit использует GC метилтрансферазу для исследования структуры хроматина с одномолекулярным разрешением7. ATAC-seq полагается на гиперактивную транспозазу, Tn58. Транспозаза Tn5 предпочтительно связывается с открытыми областями хроматина и вставляет адаптеры секвенирования в доступные области. Tn5 работает через ДНК-опосредованный механизм «вырезать и вставить», в результате чего транспозаза, предварительно загруженная адаптерами, связывается с открытыми участками хроматина, разрезает ДНК и лицензирует адаптеры8. Связанные с Tn5 области восстанавливаются путем амплификации ПЦР с использованием праймеров, которые отжигают эти адаптеры. FAIRE-seq и DNase-seq требуют большого количества исходного материала (~ 100 000 клеток до 225 000 клеток) и отдельного этапа подготовки библиотеки перед секвенированием9. С другой стороны, протокол ATAC-seq относительно прост и требует небольшого количества ячеек (<50 000 ячеек)10. В отличие от методов FAIRE-seq и DNase-seq, подготовка библиотеки секвенирования ATAC-seq относительно проста, так как изолированный образец ДНК уже помечен адаптерами секвенирования Tn5. Таким образом, для завершения подготовки библиотеки требуется только этап амплификации ПЦР с соответствующими праймерами, а предварительные этапы обработки, такие как конечный ремонт и лигирование адаптера, не должны выполняться, что экономит время11. Во-вторых, ATAC-seq позволяет избежать необходимости конверсии, клонирования и усиления бисульфита с помощью региональных праймеров, необходимых для MAPit7. Благодаря этим преимуществам ATAC-seq стал чрезвычайно популярным методом определения открытых областей хроматина. Хотя метод ATAC-seq прост, несколько шагов требуют оптимизации для получения высококачественных и воспроизводимых данных. В этой рукописи обсуждаются процедуры оптимизации для подготовки стандартной библиотеки ATAC-seq, особенно выделяются три параметра: (1) состав буфера лизиса, (2) концентрация транспозазы Tn5 и (3) номер клетки. Кроме того, в данной работе приведены примеры данных из условий оптимизации с использованием как раковых, так и нераковых адгезивных эпителиальных клеток.

протокол

1. Подготовка перед началом эксперимента

  1. Подготовьте буферный запас лизиса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный буфер ядерной изоляции может быть различным для каждого типа клеток. Мы рекомендуем тестировать как гипотонический буфер, используемый в оригинальной статье8, так и буфер CSK12,13 для каждого типа клеток с использованием окрашивания трипан-синим цветом.
    1. Для получения гипотонического буфера (зеленолистного буфера) смешайте 10 мМ Tris-HCl pH 7,4, 10 мМ NaCl, 3 мМMgCl2 и 0,1% NP-40.
    2. Для приготовления буфера ЦСК смешайте 10 мМ PIPES pH 6,8, 100 мМ NaCl, 300 мМ сахарозы, 3 мМ MgCl2 и 0,1% тритона X-100.
  2. Убедитесь, что условия культивирования клеток являются оптимальными; исследуйте клетки под световым микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии повышенных уровней апоптоза.
  3. Включите центрифугу, чтобы она достигла 4 °C.

2. Сбор клеток

  1. Аспиратные среды из культуры клеток при слиянии <80%. Клетки обычно выращиваются в чашке диаметром 35 мм или 60 мм в зависимости от количества необходимых клеток, лечения и т. Д.
  2. Промыть ячейки 1 мл или 3 мл PBS.
  3. Добавляют 0,5 мл или 1 мл трипсина и инкубируют в течение 2-3 мин (в зависимости от типов клеток). Осторожно используйте пипетку 1 мл, чтобы хорошо перемешать.
  4. Добавьте в тарелку 1 мл или 2 мл среды и хорошо перемешайте. Переложить в коническую трубку объемом 15 мл. Центрифугирование клеток в пробирке 15 мл в течение 3 мин при 300 х г.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации потерь ячеек рекомендуется использовать качающийся ротор ковша.
  5. Аспирировать среду и повторно суспендировать клетки в 1 мл или 2 мл среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно приготовить однородный одноклеточный раствор. Для тканей гомогенизатор Dounce может использоваться для гомогенизации тканей и минимизации крупных клеточных сгустков или агрегатов. Некоторые ткани требуют фильтрации (например, клеточных сетчатых фильтров) и/или сортировки клеток FACS для выделения жизнеспособных клеток и получения одного клеточного раствора.
  6. Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании использовался автоматизированный счетчик ячеек (Таблица материалов).
  7. Центрифугировать требуемый объем ячейки (например, объем, содержащий 1 х 106 ячеек в зависимости от количества ячеек) при 300 х г в течение 3 мин при комнатной температуре (RT).
  8. Повторно суспендируют ячейку гранулы, содержащие 1 х 106 клеток в 1 мл холодного PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество клеток меньше 1 х 106 клеток, уменьшите объем холодного PBS, чтобы приготовить клеточный раствор в той же концентрации (1 х 106 клеток/мл).

3. Лизис клеток

  1. Перенесите 25 мкл (= 2,5 х 104 ячейки) в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,7 мл. Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г при 4 °C и осторожно выбросьте супернатант
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации потерь ячеек рекомендуется использовать качающийся ротор ковша. Оставьте около 3 мкл супернатанта, чтобы убедиться, что клетки не выбрасываются.
  2. Добавьте 25 мкл буфера лизиса и повторно суспендируйте клетки путем мягкой пипетки вверх и вниз. Инкубировать на льду в течение 5 мин
  3. Центрифугу в течение 5 мин при 500 х г при 4 °С и осторожно выбрасывайте супернатант.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации потерь ячеек рекомендуется использовать качающийся ротор ковша. Оставьте около 3 мкл супернатанта, чтобы убедиться, что клетки не выбрасываются.

4. Тегментация Tn5

  1. Немедленно повторно суспендировать гранулу в 25 мкл реакционной смеси Tn5. Реакционная смесь Tn5 выглядит следующим образом: 12,5 мкл 2-кратного буфера тагментационной ДНК (буфер TD), 1,25-5 мкл транспозазы Tn5 и 11,25-7,5 мкл воды без нуклеазы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная концентрация Tn5 составляет 2,5 мкл для 2,5 х 104 клеток.
  2. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перемешивать раствор каждые 10 мин.

5. Очистка ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка требуется перед усилением. Очистка ДНК осуществляется с помощью набора для очистки MinElute PCR (Таблица материалов).

  1. Добавьте 5 мкл 3 М ацетата натрия (рН 5,2).
  2. Сразу же добавьте 125 мкл буферного ПБ и хорошо перемешайте.
  3. Следуйте протоколу набора для очистки ПЦР, начиная с шага 2.
    1. Поместите отжимную колонну в трубку для сбора 2 мл.
    2. Нанесите образец на спиновую колонну и центрифугу в течение 1 мин при 17 900 х г при РТ.
    3. Отбросьте проточную трубу и поместите отжимную колонну обратно в ту же коллекторную трубку.
    4. Добавьте 750 мкл буферного ПЭ в спиновую колонну и центрифугу в течение 1 мин при 17 900 х г при RT.
    5. Отбросьте проточную трубу и поместите отжимную колонну обратно в ту же коллекторную трубку.
    6. Центрифугируйте спиновую колонну в течение 5 мин, чтобы полностью высушить мембрану.
    7. Отбросьте проточную колонну и поместите спиновую колонну в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,7 мл.
    8. Элюируют фрагменты ДНК 10 мкл буфера EB.
    9. Дайте колонке постоять 1 минуту на RT.
    10. Центрифуга в течение 1 мин при 17 900 х г при RT для элюирования ДНК.

6. ПЦР-амплификация

ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР-амплификация транспонированных (помеченных) ДНК необходима для секвенирования. В этом примере использовались адаптеры комплекта Nextera (Таблица материалов). Грунтовки, используемые в данном исследовании, перечислены в таблице 1.

  1. Настройте следующую реакцию ПЦР в 200 мкл ПЦР-пробирках (50 мкл для каждого образца). Реакционная смесь ПЦР выглядит следующим образом: 10 мкл элюированной ДНК (стадия 5.), 2,5 мкл адаптера 25 мМ 1, 2,5 мкл адаптера 25 мМ, 25 мкл 2x ПЦР-мастер-смеси и 10 мкл воды без нуклеазы
  2. Выполнение программы ПЦР-амплификации часть 1 (табл. 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для начального усиления используются одинаковые условия для всех образцов с использованием стандартного теплового циклера.
  3. qPCR в реальном времени (всего 14,5 мкл на образец)
    1. Используя 5 мкл продукта из части 1 амплификации ПЦР (шаг 6.2.), настройте следующую реакцию, на этот раз включающую золото SYBR и обнаружение в аппарате ПЦР в режиме реального времени.
    2. Приготовьте реакционную смесь ПЦР следующим образом: 5 мкл продукта ПЦР со стадии 6.2., 0,75 мкл золота SYBR (1000x разбавленного), 5 мкл 2x ПЦР-мастер-смеси и 3,75 мкл воды без нуклеазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точные номера циклов для библиотечного амплификации до достижения насыщения для каждого образца определяются с помощью qPCR (таблица 3) для уменьшения смещения GC и размера вPCR 10. SYBR Gold разбавляли водой без нуклеаз. Для получения разбавленного раствора 1 мкл золота SYBR (концентрация запаса 10 000x) добавляли к 999 мкл воды без нуклеазы. Время работы RT-qPCR, упомянутое в таблице 3 , составляет около 60 минут.
  4. Определите необходимое количество дополнительных циклов ПЦР, используя параметры запуска из шага 6.3.
    1. Количество циклов = 1/4 максимальной (насыщенной) интенсивности флуоресценции (обычно 3 или 4 цикла ПЦР)
  5. Программа амплификации ПЦР часть 2 (объем = 45 мкл; Таблица 4): После определения числа циклов настройте ПЦР с дополнительными циклами, рассчитанными на этапе 6.4.1. Например, если вычисляемое число циклов равно 3, настройте 3 цикла в программе ниже. Общее число циклов составит 8 (5 на этапе 6.2., плюс 3 дополнительных цикла на этапе 6.5).

7. Очистка бисера

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались бусины AMPure XP (Таблица материалов).

  1. К продуктам ПЦР, усиленным на предыдущем этапе, добавляют 150 мкл бусин при РТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Самодельные бусины AMPure14 могут быть использованы в этом процессе.
  2. Инкубировать в течение 15 мин на RT.
  3. Поместите трубки на магнитную подставку на 5 мин.
  4. Осторожно удалите супернатант.
  5. Вымойте шарики 200 мкл 80% этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 80% этанола следует готовить в свежем виде.
  6. Повторите шаг 7.4.
  7. Полностью удалите этанол.
  8. Высушите образцы на воздухе в течение 10 мин на RT.
  9. Ресуспенд с 50 мкл буфера элюирования (10 мМ Tris-HCL pH 8,0).
  10. Повторите очистку шариков (этапы 7.1.-7.9.), чтобы еще больше свести к минимуму загрязнение грунтовки.

8. Проверка концентрации и качества ДНК

  1. Измерьте концентрацию ДНК с помощью набора для количественной оценки нуклеиновых кислот (Таблица материалов).
  2. Проверьте амплифицированные фрагменты ДНК с помощью гелевого электрофореза с помощью SYBR Gold (0,5x TBE, 1,5% агарозного геля) или автоматизированной системы электрофореза (например, TapeStation, биоанализатор).

9. Секвенирование

  1. Выполняйте высокопроизводительное секвенирование с использованием амплифицированных образцов ДНК12,13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Амплифицированные образцы ДНК готовы к высокопроизводительному секвенированию. Чтобы сохранить информацию о фрагменте нуклеосомной ДНК, рекомендуется парное секвенирование над односторонним секвенированием. Оба конца фрагментов ДНК указывают, где транспозаз связывается. Для картирования открытых областей хроматина обычно достаточно 30 миллионов считываний на образец.

10. Анализ данных

  1. Фильтрация данных на основе качества базового вызова: установите минимальный средний базовый показатель качества равным 20 (точность 99%).
  2. Обрезка адаптера: удалите последовательности адаптеров с помощью соответствующего инструмента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент-оболочка Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) использовался для удаления последовательностей адаптеров. Для библиотек ATAC-seq, подготовленных Illumina Tn5, в качестве последовательности адаптера используется следующая последовательность: CTGTCTCTTATACACATCT. Минимальная длина последовательности для распознавания загрязнения адаптера установлена равной 5.
  3. Картирование генома: Сопоставьте показания с соответствующим геномом с помощью Bowtie, используя следующие параметры "-I 0 -X 2000 -m 1"15. Пример качества картирования базальных клеток рака молочной железы MDA-MB-231 приведен ниже:
    Считывает по крайней мере с одним заявленным выравниванием: 52,79%
    Показания, которые не удалось выровнять: 13,10%
    Считывает данные с выравниванием, подавленным из-за -m: 34,11%
  4. Дедупликация: пометьте дубликаты ПЦР инструментами Пикара16.
  5. Создание файла покрытия генома для визуализации данных: преобразование дедуплицированных парных считываний в односторонние фрагменты чтения. Треки покрытия генома получены с помощью genomeCoverageBed из надкроватных стульев17.

Результаты

Для получения успешных и качественных данных ATAC-seq важно оптимизировать условия эксперимента. Подготовка библиотеки ATAC-seq может быть разделена на пять основных этапов (рисунок 1), а именно лизис клеток, тегментация (фрагментация и вставка адаптера Tn5), геномная очистка ДН?...

Обсуждение

ATAC-seq широко используется для картирования открытых и активных областей хроматина. Прогрессирование раковых клеток часто обусловлено генетическими изменениями и эпигенетическим перепрограммированием, что приводит к изменению доступности хроматина и экспрессии генов. Пример такого ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что нет никаких релевантных или материальных финансовых интересов, которые относятся к исследованию, описанному в данной статье.

Благодарности

Мы с признательностью выражаем признательность механизму UND Genomics Core за выдающуюся техническую помощь.

Эта работа финансировалась Национальными институтами здравоохранения [P20GM104360 to M.T., P20 GM104360 to A.D.] и стартовыми фондами, предоставленными Школой медицины и наук о здоровье Университета Северной Дакоты, Департамент биомедицинских наук [до M.T.].

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5500Natural
10 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-3810Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tipsUSA Scientific1182-1830Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-1840Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge TubesCorning352096
20 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1183-1810Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1180-8810Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge TubesFisherbrand06-443-19
AgaroseThermoFisher ScientificYBP136010Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCCATCC
Allegra X-30R CentrifugeBeckman Coulter364658SX2415
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881Bead purification kit
CellDrop Cell CounterDeNovixCellDrop FLCell counter
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTAMilliporeSigmaE3889
Ethanol 100%ThermoFisher ScientificAC615100020Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET TestedR&D SystemsS10350Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0.25%), phenol red
GlycerolIBI Scientific56-81-5
GlycineMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR Purification kitQiagen28004DNA purification kit
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-121-10302x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896for molecular biology
PCR Detection SystemBioRad1855484CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kitThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
Sodium AcetateHomemade-pH 5.2
SucroseIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mLBioRad1708882
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-4700Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700Single notch. Natural polypropylene
Tris BaseMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer KitIlluminaPE-121-1003paired-end
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, viscous liquid
WaterMilliporeSigmaW3500sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture

Ссылки

  1. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nature Reviews Genetics. 20 (4), 207-220 (2019).
  2. Liu, Y. Clinical implications of chromatin accessibility in human cancers. Oncotarget. 11 (18), 1666-1678 (2020).
  3. Sanghi, A., et al. Chromatin accessibility associates with protein-RNA correlation in human cancer. Nature Communications. 12 (1), 5732 (2021).
  4. Corces, M. R., et al. The chromatin accessibility landscape of primary human cancers. Science. 362 (6413), (2018).
  5. Boyle, A. P., et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome. Cell. 132 (2), 311-322 (2008).
  6. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).
  7. Pardo, C. E., Nabilsi, N. H., Darst, R. P., Kladde, M. P. Integrated DNA methylation and chromatin structural analysis at single-molecule resolution. Methods in Molecular Biology. 1288, 123-141 (2015).
  8. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  9. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  10. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. , 1 (2015).
  11. Mehrmohamadi, M., Sepehri, M. H., Nazer, N., Norouzi, M. R. A comparative overview of epigenomic profiling methods. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 714687 (2021).
  12. Fujiwara, S., Baek, S., Varticovski, L., Kim, S., Hager, G. L. High quality ATAC-Seq data recovered from cryopreserved breast cell lines and tissue. Scientific Reports. 9 (1), 516 (2019).
  13. Takaku, M., et al. GATA3-dependent cellular reprogramming requires activation-domain dependent recruitment of a chromatin remodeler. Genome Biology. 17, 36 (2016).
  14. Rohland, N., Reich, D. C. o. s. t. -. e. f. f. e. c. t. i. v. e. high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Research. 22 (5), 939-946 (2012).
  15. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10 (3), 25 (2009).
  16. . Picard Toolkit Broad Institute, GitHub Repository Available from: https://broadinstitute.github.io/picard/ (2022)
  17. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  18. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  19. Zhou, B., et al. INO80 governs superenhancer-mediated oncogenic transcription and tumor growth in melanoma. Genes & Development. 30 (12), 1440-1453 (2016).
  20. Takaku, M., et al. GATA3 zinc finger 2 mutations reprogram the breast cancer transcriptional network. Nature Communications. 9 (1), 1059 (2018).
  21. Oldfield, A. J., et al. NF-Y controls fidelity of transcription initiation at gene promoters through maintenance of the nucleosome-depleted region. Nature Communications. 10 (1), 3072 (2019).
  22. Langer, L. F., Ward, J. M., Archer, T. K. Tumor suppressor SMARCB1 suppresses super-enhancers to govern hESC lineage determination. Elife. 8, 45672 (2019).
  23. Elrod, N. D., et al. The integrator complex attenuates promoter-proximal transcription at protein-coding genes. Molecular Cell. 76 (5), 738-752 (2019).
  24. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  25. Porter, J. R., et al. Global inhibition with specific activation: How p53 and MYC redistribute the transcriptome in the DNA double-strand break response. Molecular Cell. 67 (6), 1013-1025 (2017).
  26. Dhasarathy, A., Kajita, M., Wade, P. A. The transcription factor snail mediates epithelial to mesenchymal transitions by repression of estrogen receptor-alpha. Molecular Endocrinology. 21 (12), 2907-2918 (2007).
  27. McCarthy, M. T., O'Callaghan, C. A. PeaKDEck: A kernel density estimator-based peak calling program for DNaseI-seq data. Bioinformatics. 30 (9), 1302-1304 (2014).
  28. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nature Protocols. 7 (6), 1518-1552 (2022).
  29. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  30. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  31. Garcia-Martinez, L., Zhang, Y., Nakata, Y., Chan, H. L., Morey, L. Epigenetic mechanisms in breast cancer therapy and resistance. Nature Communications. 12 (1), 1786 (2021).
  32. Bhattacharya, A., et al. The calcium channel proteins ORAI3 and STIM1 mediate TGF-β induced Snai1 expression. Oncotarget. 9 (50), 29468-29483 (2018).
  33. Schep, A. N., et al. Structured nucleosome fingerprints enable high-resolution mapping of chromatin architecture within regulatory regions. Genome Research. 25 (11), 1757-1770 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены