ATAC-Seq Optimierung für die Krebsepigenetikforschung

Zusammenfassung

ATAC-seq ist eine DNA-Sequenzierungsmethode, die die hyperaktive mutierte Transposase Tn5 verwendet, um Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit abzubilden, die durch Transkriptionsfaktoren vermittelt werden. ATAC-seq ermöglicht die Entdeckung der molekularen Mechanismen, die phänotypischen Veränderungen in Krebszellen zugrunde liegen. Dieses Protokoll beschreibt Optimierungsverfahren für ATAC-seq in Epithelzelltypen, einschließlich Krebszellen.

Zusammenfassung

Der Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (ATAC-seq) untersucht die Zugänglichkeit von Desoxyribonukleinsäure (DNA) unter Verwendung der hyperaktiven Tn5-Transposase. Tn5 schneidet und ligiert Adapter für Hochdurchsatzsequenzierung innerhalb zugänglicher Chromatinregionen. In eukaryotischen Zellen wird genomische DNA in Chromatin verpackt, einen Komplex aus DNA, Histone und anderen Proteinen, der als physikalische Barriere für die Transkriptionsmaschinerie wirkt. Als Reaktion auf extrinsische Signale rekrutieren Transkriptionsfaktoren Chromatin-Remodeling-Komplexe, um den Zugang zur Transkriptionsmaschinerie für die Genaktivierung zu ermöglichen. Daher ist die Identifizierung offener Chromatinregionen nützlich, wenn die Aktivitäten von Enhancern und Genpromotoren während biologischer Ereignisse wie dem Fortschreiten von Krebs überwacht werden. Da dieses Protokoll einfach zu bedienen ist und einen geringen Zelleingangsbedarf hat, wurde ATAC-seq weit verbreitet, um offene Chromatinregionen in verschiedenen Zelltypen, einschließlich Krebszellen, zu definieren. Für eine erfolgreiche Datenerfassung müssen bei der Vorbereitung von ATAC-seq-Bibliotheken mehrere Parameter berücksichtigt werden. Unter ihnen sind die Wahl des Zelllysepuffers, die Titration des Enzyms Tn5 und das Startvolumen der Zellen entscheidend für die Vorbereitung der ATAC-seq-Bibliothek in Krebszellen. Optimierung ist unerlässlich, um qualitativ hochwertige Daten zu generieren. Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung der ATAC-seq-Optimierungsmethoden für Epithelzelltypen.

Einleitung

Die Zugänglichkeit von Chromatin ist eine Schlüsselvoraussetzung für die Regulation der Genexpression auf einer genomweiten Skala¹. Veränderungen der Chromatinzugänglichkeit sind häufig mit mehreren Krankheitszuständen verbunden, einschließlich Krebs ^2,3,4. Im Laufe der Jahre wurden zahlreiche Techniken entwickelt, die es Forschern ermöglichen, die Chromatinlandschaft zu untersuchen, indem sie Regionen mit Chromatinzugänglichkeit kartieren. Einige von ihnen umfassen DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)⁵, FAIRE-seq....

Protokoll

1. Vorbereitungen vor Beginn des Experiments

1. Lysepufferlager vorbereiten.
   HINWEIS: Der optimale nukleare Isolationspuffer kann für jeden Zelltyp unterschiedlich sein. Wir empfehlen, sowohl den im Originalpapier⁸ verwendeten hypotonischen Puffer als auch einen CSK-Puffer^12,13 für jeden Zelltyp unter Verwendung von Trypanblau-Färbung zu testen.
   1. Zur Herstellung des hypotonischen Puffers (Greenleaf-Puffer) mischen Sie 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ und 0,1% NP-40.
   2. Zur Herstellung des CSK-Puffers mischen Sie 10 mM PIPE....

Ergebnisse

Um erfolgreiche und qualitativ hochwertige ATAC-seq-Daten zu erhalten, ist es wichtig, die experimentellen Bedingungen zu optimieren. Die ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung kann in die fünf Hauptschritte unterteilt werden (Abbildung 1), nämlich Zelllyse, Tagmentation (Fragmentierung und Adapterinsertion durch Tn5), genomische DNA-Aufreinigung, PCR-Amplifikation und Datenanalyse. Als ersten Prozess muss zunächst der Zelllysepuffer (Kernisolierung) für jeden Zelltyp optimiert werden. Zur Lys.......

Diskussion

ATAC-seq wurde häufig für die Kartierung offener und aktiver Chromatinregionen verwendet. Die Progression von Krebszellen wird häufig durch genetische Veränderungen und epigenetische Reprogrammierung vorangetrieben, was zu einer veränderten Chromatinzugänglichkeit und Genexpression führt. Ein Beispiel für diese Reprogrammierung ist während des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs (EMT) und seines umgekehrten Prozesses, des mesenchymalen zu epithelialen Übergangs (MET), die als wichtige zelluläre Reprogramm.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500	Natural
10 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-3810	Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tips	USA Scientific	1182-1830	Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-1840	Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352096
20 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1183-1810	Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1180-8810	Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge Tubes	Fisherbrand	06-443-19
Agarose	ThermoFisher Scientific	YBP136010	Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCC	ATCC
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman Coulter	364658	SX2415
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	Bead purification kit
CellDrop Cell Counter	DeNovix	CellDrop FL	Cell counter
EDTA	MilliporeSigma	EDS	BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTA	MilliporeSigma	E3889
Ethanol 100%	ThermoFisher Scientific	AC615100020	Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET Tested	R&D Systems	S10350	Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1x	ThermoFisher Scientific	11965092	[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1x	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1x	ThermoFisher Scientific	25200056	(0.25%), phenol red
Glycerol	IBI Scientific	56-81-5
Glycine	MilliporeSigma	G8898
HCl	MilliporeSigma	H1758
HEPES	MilliporeSigma	H3375
Invitrogen Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q32857
MgCl2	MilliporeSigma	M3634
MinElute PCR Purification kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
NaCl	IBI Scientific	7647-14-5
NaOH	MilliporeSigma	S8045	BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541
Nextera DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-121-1030	2x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)	MilliporeSigma	I8896	for molecular biology
PCR Detection System	BioRad	1855484	CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPES	MilliporeSigma	P1851	BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kit	ThermoFisher Scientific	Q32854	Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay Tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856	Invitrogen
SDS	MilliporeSigma	L3771
Sodium Acetate	Homemade	-	pH 5.2
Sucrose	IBI Scientific	57-50-1
SYBR Gold	ThermoFisher Scientific	S11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mL	BioRad	1708882
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips	USA Scientific	1402-4700	Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATE	USA Scientific	1438-4700	Single notch. Natural polypropylene
Tris Base	MilliporeSigma	648311	ULTROL Grade
Triton x-100	IBI Scientific	9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit	Illumina	PE-121-1003	paired-end
Trypan Blue Stain	ThermoFisher Scientific	Q32851
Tween-20	MilliporeSigma	P7949	BioXtra, viscous liquid
Water	MilliporeSigma	W3500	sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture