Otimização ATAC-Seq para Pesquisa em Epigenética do Câncer

Resumo

ATAC-seq é um método de sequenciamento de DNA que usa a transposase mutante hiperativa, Tn5, para mapear mudanças na acessibilidade da cromatina mediadas por fatores de transcrição. O ATAC-seq permite a descoberta dos mecanismos moleculares subjacentes às alterações fenotípicas nas células cancerígenas. Este protocolo descreve procedimentos de otimização para ATAC-seq em tipos de células epiteliais, incluindo células cancerígenas.

Resumo

O ensaio para cromatina acessível à transposase com sequenciamento de alto rendimento (ATAC-seq) sonda a acessibilidade do ácido desoxirribonucleico (DNA) usando a transposase hiperativa Tn5. Tn5 corta e ligadura adaptadores para sequenciamento de alto rendimento dentro de regiões de cromatina acessíveis. Nas células eucarióticas, o DNA genômico é embalado em cromatina, um complexo de DNA, histonas e outras proteínas, que atua como uma barreira física à maquinaria transcricional. Em resposta a sinais extrínsecos, os fatores de transcrição recrutam complexos de remodelação da cromatina para permitir o acesso à maquinaria transcricional para a ativação do gene. Portanto, a identificação de regiões abertas da cromatina é útil ao monitorar as atividades do potenciador e do promotor de genes durante eventos biológicos, como a progressão do câncer. Uma vez que este protocolo é fácil de usar e tem um baixo requisito de entrada celular, o ATAC-seq tem sido amplamente adotado para definir regiões abertas da cromatina em vários tipos de células, incluindo células cancerígenas. Para uma aquisição de dados bem-sucedida, vários parâmetros precisam ser considerados ao preparar bibliotecas ATAC-seq. Entre eles, a escolha do tampão de lise celular, a titulação da enzima Tn5 e o volume inicial de células são cruciais para a preparação da biblioteca ATAC-seq em células cancerígenas. A otimização é essencial para gerar dados de alta qualidade. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada dos métodos de otimização ATAC-seq para tipos de células epiteliais.

Introdução

A acessibilidade à cromatina é um requisito fundamental para a regulação da expressão gênica em larga escala^{genômica 1}. Alterações na acessibilidade à cromatina são frequentemente associadas a vários estados de doença, incluindo câncer ^2,3,4. Ao longo dos anos, inúmeras técnicas foram desenvolvidas para permitir que os pesquisadores sondem a paisagem da cromatina mapeando regiões de acessibilidade à cromatina. Alguns deles incluem DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)⁵, FAIRE-seq (isolamento assistido por formaldeído de elementos reguladores)⁶, MAPit (protocolo de acessibilidade à metiltransferase para modelos individuais)⁷ e o foco deste artigo, ATAC-seq (ensaio para cromatina acessível à transposase)⁸. O DNase-seq mapeia regiões acessíveis empregando uma característica fundamental da DNase, a saber, a digestão preferencial de DNA nu livre de histonas e outras proteínas, como fatores de transcrição⁵. O FAIRE-seq, semelhante ao ChIP-seq, utiliza reticulação e sonicação de formaldeído, exceto que não há imunoprecipitação envolvida, e as regiões livres de nucleossomos são isoladas por extração de fenol-clorofórmio⁶. O método MAPit utiliza uma metiltransferase GC para sondar a estrutura da cromatina na resolução de molécula única⁷. ATAC-seq baseia-se na transposase hiperativa, Tn5⁸. A transposase Tn5 liga-se preferencialmente a regiões de cromatina abertas e insere adaptadores de sequenciamento em regiões acessíveis. O Tn5 opera através de um mecanismo de "cortar e colar" mediado por DNA, pelo qual a transposase pré-carregada com adaptadores se liga a locais de cromatina abertos, corta o DNA e liga-se aos adaptadores⁸. As regiões ligadas a Tn5 são recuperadas por amplificação por PCR usando primers que recozidos para esses adaptadores. FAIRE-seq e DNase-seq requerem uma grande quantidade de material de partida (~100.000 células a 225.000 células) e uma etapa de preparação de biblioteca separada antes do sequenciamento⁹. Por outro lado, o protocolo ATAC-seq é relativamente simples e requer um pequeno número de células (<50.000 células)¹⁰. Ao contrário das técnicas FAIRE-seq e DNase-seq, a preparação da biblioteca de sequenciamento do ATAC-seq é relativamente fácil, pois a amostra de DNA isolada já está sendo marcada com os adaptadores de sequenciamento por Tn5. Portanto, apenas a etapa de amplificação por PCR com primers apropriados é necessária para concluir a preparação da biblioteca, e as etapas de processamento prévias, como reparo final e ligadura do adaptador, não precisam ser realizadas, economizando tempo¹¹. Em segundo lugar, o ATAC-seq evita a necessidade de conversão, clonagem e amplificação de bissulfito com primers específicos da região necessários para o MAPit⁷. Devido a essas vantagens, o ATAC-seq tornou-se um método extremamente popular para definir regiões abertas de cromatina. Embora o método ATAC-seq seja simples, várias etapas exigem otimização para obter dados de alta qualidade e reprodutíveis. Este manuscrito discute procedimentos de otimização para a preparação padrão da biblioteca ATAC-seq, destacando especialmente três parâmetros: (1) composição do tampão de lise, (2) concentração de transposase Tn5 e (3) número de células. Além disso, este artigo fornece dados de exemplo das condições de otimização usando células epiteliais aderentes cancerosas e não cancerosas.

Protocolo

1. Preparações antes do início da experiência

1. Preparar o depósito regulador de lise.
   NOTA: O buffer de isolamento nuclear ideal pode ser diferente para cada tipo de célula. Recomendamos testar tanto o tampão hipotônico utilizado no artigo original⁸ quanto um tampão CSK^12,13 para cada tipo de célula usando a coloração azul de tripano.
   1. Para preparar o tampão hipotônico (tampão Greenleaf), misture 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ e 0,1% NP-40.
   2. Para preparar o tampão CSK, misture 10 mM PIPES pH 6,8, 100 mM NaCl, 300 mM de sacarose, 3 mM MgCl₂ e 0,1% Triton X-100.
2. Garantir que as condições de cultura celular sejam ótimas; examinar as células sob um microscópio de luz para se certificar de que não há níveis elevados de apoptose.
3. Ligue a centrífuga para que atinja 4 °C.

2. Colheita de células

1. Aspirar meios de uma cultura de células com <80% de confluência. As células são tipicamente cultivadas em um prato de 35 mm ou 60 mm, com base no número de células necessárias, tratamentos, etc.
2. Lave as células com 1 mL ou 3 mL de PBS.
3. Adicione 0,5 mL ou 1 mL de tripsina e incube por 2-3 min (dependendo dos tipos de células). Use cuidadosamente uma pipeta de 1 mL para misturar bem.
4. Adicione 1 mL ou 2 mL de meio ao prato e misture bem. Transferir para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar as células em um tubo de 15 mL por 3 min a 300 x g.
   NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células.
5. Aspirar o meio e ressuspender as células em 1 mL ou 2 mL de meio.
   NOTA: É fundamental preparar uma solução homogênea de célula única. Para tecidos, um homogeneizador Dounce pode ser usado para homogeneizar tecidos e minimizar grandes aglomerados de células ou agregados. Alguns tecidos requerem filtração (por exemplo, filtros celulares) e/ou classificação celular FACS para isolar células viáveis e obter uma única solução celular.
6. Conte as células usando um contador de células.
   NOTA: Neste estudo, foi utilizado um contador de células automatizado (Tabela de Materiais).
7. Centrifugar o volume celular necessário (por exemplo, um volume contendo 1 x 10⁶ células com base na contagem de células) a 300 x g durante 3 min à temperatura ambiente (RT).
8. Ressuspeite o pellet celular contendo 1 x 10⁶ células em 1 mL de PBS frio.
   NOTA: Se o número de células for inferior a 1 x 10 6 células, diminua o volume PBS frio para preparar a solução celular na mesma concentração (1 x 10⁶ células/mL).

3. Lise celular

1. Transfira 25 μL (= 2,5 x 10⁴ células) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C e eliminar cuidadosamente o sobrenadante
   NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células. Deixe cerca de 3 μL de sobrenadante para garantir que as células não estão sendo descartadas.
2. Adicione 25 μL de tampão de lise e ressuspenda as células por pipetagem suave para cima e para baixo. Incubar no gelo por 5 min
3. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C e eliminar cuidadosamente o sobrenadante.
   NOTA: Recomenda-se um rotor de caçamba oscilante para minimizar a perda de células. Deixe cerca de 3 μL de sobrenadante para garantir que as células não estão sendo descartadas.

4. Marcação Tn5

1. Ressuspender imediatamente o pellet em 25 μL de mistura de reacção Tn5. A mistura de reação Tn5 é a seguinte: 12,5 μL de 2x tampão de DNA de tagmentação (tampão TD), 1,25-5 μL de transposase Tn5 e 11,25-7,5 μL de água livre de nuclease.
   NOTA: A concentração padrão de Tn5 é de 2,5 μL para 2,5 x 10⁴ células.
2. Incubar durante 30 min a 37 °C.
   NOTA: Misture a solução a cada 10 minutos.

5. Purificação do DNA

NOTA: A purificação é necessária antes da amplificação. A purificação do DNA é feita usando o kit de purificação MinElute PCR (Tabela de Materiais).

1. Adicionar 5 μL de acetato de sódio 3 M (pH 5,2).
2. Adicione imediatamente 125 μL de Buffer PB e misture bem.
3. Siga o protocolo do kit de purificação por PCR a partir da etapa 2.
   1. Coloque a coluna de rotação em um tubo de coleta de 2 mL.
   2. Aplicar a amostra na coluna de rotação e na centrífuga durante 1 min a 17.900 x g a RT.
   3. Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação de volta no mesmo tubo de coleta.
   4. Adicionar 750 μL de Buffer PE à coluna de rotação e centrifugar durante 1 min a 17.900 x g a RT.
   5. Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação de volta no mesmo tubo de coleta.
   6. Centrifugar a coluna de rotação por 5 minutos para secar completamente a membrana.
   7. Descarte o fluxo e coloque a coluna de rotação em um novo tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
   8. Eluir os fragmentos de DNA com 10 μL de tampão EB.
   9. Deixe a coluna repousar por 1 min em RT.
   10. Centrífuga por 1 min a 17.900 x g em RT para eluír o DNA.

6. Amplificação por PCR

NOTA: A amplificação por PCR de DNAs transpostos (marcados) é necessária para o sequenciamento. Os adaptadores de kit Nextera (Tabela de Materiais) foram usados neste exemplo. Os primers utilizados neste estudo estão listados na Tabela 1.

1. Configure a seguinte reação de PCR em tubos de PCR de 200 μL (50 μL para cada amostra). A mistura de reação de PCR é a seguinte: 10 μL de DNA eluído (etapa 5.), 2,5 μL de 25 mM Adapter 1, 2,5 μL de 25 mM Adapter 2, 25 μL de 2x PCR master mix e 10 μL de água livre de nuclease
2. Executar o programa de amplificação por PCR parte 1 (Tabela 2).
   NOTA: Para a amplificação inicial, as mesmas condições são usadas para todas as amostras que usam um termociclador padrão.
3. QPCR em tempo real (total de 14,5 μL por amostra)
   1. Usando 5 μL do produto da parte 1 de amplificação de PCR (etapa 6.2.), configure a seguinte reação, desta vez incluindo ouro SYBR e detecção em uma máquina de PCR em tempo real.
   2. Preparar a mistura de reação de PCR da seguinte forma: 5 μL de produto de PCR da etapa 6.2., 0,75 μL de ouro SYBR (diluído 1000x), 5 μL de mistura mestre de PCR 2x e 3,75 μL de água livre de nuclease.
      NOTA: Os números de ciclo precisos para amplificação de biblioteca antes de atingir a saturação para cada amostra são determinados por qPCR (Tabela 3) para reduzir o viés de GC e tamanho na PCR¹⁰. O SYBR Gold foi diluído com água isenta de nuclease. Para a confecção da solução diluída, 1 μL de SYBR Gold (concentração estoque de 10.000x) foi adicionado a 999 μL de água isenta de nuclease. O tempo de execução do RT-qPCR mencionado na Tabela 3 é de cerca de 60 min.
4. Determine o número necessário de ciclos de PCR adicionais usando os parâmetros de execução da etapa 6.3.
   1. Número de ciclos = 1/4 de intensidade máxima (saturada) de fluorescência (tipicamente 3 ou 4 ciclos de PCR)
5. Programa de amplificação por PCR parte 2 (volume = 45 μL; Tabela 4): Depois de determinar o número do ciclo, configure os PCRs com ciclos adicionais calculados na etapa 6.4.1. Por exemplo, se o número de ciclo calculado for 3, configure 3 ciclos no programa abaixo. O total de ciclos seria 8 (5 na etapa 6.2., mais 3 ciclos adicionais na etapa 6.5.)

7. Purificação de contas

NOTA: Aqui, foram utilizadas contas AMPure XP (Table of Materials).

1. Aos produtos de PCR amplificados na etapa anterior, adicione 150 μL de contas em RT.
   NOTA: As contas caseiras AMPure¹⁴ podem ser usadas neste processo.
2. Incubar por 15 min no RT.
3. Coloque os tubos em um suporte magnético por 5 min.
4. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
5. Lave as contas com 200 μL de etanol a 80%.
   NOTA: 80% de etanol deve ser preparado fresco.
6. Repita a etapa 7.4.
7. Remova o etanol completamente.
8. Secar as amostras ao ar por 10 min no RT.
9. Ressuspender com 50 μL de tampão de eluição (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
10. Repita a purificação das esferas (etapas 7.1.-7.9.) para minimizar ainda mais a contaminação do primer.

8. Concentração de DNA e verificação de qualidade

1. Meça a concentração de DNA usando um kit de quantificação de ácido nucleico (Tabela de Materiais).
2. Verifique os fragmentos de DNA amplificados por eletroforese em gel usando SYBR Gold (0,5x TBE, gel de agarose a 1,5%) ou um sistema de eletroforese automatizado (por exemplo, TapeStation, bioanalisador).

9. Sequenciamento

1. Realizar o sequenciamento de alto rendimento utilizando as amostras de DNA amplificado^12,13.
   NOTA: As amostras de DNA amplificado estão prontas para sequenciamento de alto rendimento. Para reter informações de fragmentos de DNA nucleossomal, recomenda-se o sequenciamento de extremidade emparelhada sobre o sequenciamento de extremidade única. Ambas as extremidades dos fragmentos de DNA indicam onde a transposase se liga. Para mapear regiões abertas de cromatina, 30 milhões de leituras/amostra são normalmente suficientes.

10. Análise dos dados

1. Filtragem de dados com base na qualidade da chamada base: Defina a pontuação média mínima de qualidade da base para 20 (99% de precisão).
2. Aparamento do adaptador: remova as sequências do adaptador usando uma ferramenta apropriada.
   Observação : A ferramenta wrapper Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) foi usada para remover sequências de adaptador. Para bibliotecas ATAC-seq preparadas pelo Illumina Tn5, a seguinte sequência é usada como uma sequência adaptadora: CTGTCTCTTATACACATCT. O comprimento mínimo da sequência para reconhecer a contaminação do adaptador é definido como 5.
3. Mapeamento do genoma: Mapeie as leituras para o genoma apropriado com Bowtie usando os seguintes parâmetros "-I 0 -X 2000 -m 1"¹⁵. Um exemplo de mapeamento da qualidade das células basais de câncer de mama MDA-MB-231 está abaixo:
   Leituras com pelo menos um alinhamento relatado: 52,79%
   Leituras que não conseguiram alinhar: 13,10%
   Leituras com alinhamentos suprimidos devido a -m: 34,11%
4. Eliminação de duplicação: Marque as duplicatas de PCR pelas ferramentas Picard¹⁶.
5. Gerando um arquivo de cobertura de genoma para visualização de dados: converta as leituras de extremidade emparelhadas desduplicadas em fragmentos de leitura de extremidade única. Os rastros de cobertura do genoma são obtidos utilizando-se o genomeCoverageBed from bedtools¹⁷.

Resultados

Para obter dados ATAC-seq bem-sucedidos e de alta qualidade, é importante otimizar as condições experimentais. A preparação da biblioteca ATAC-seq pode ser separada em cinco etapas principais (Figura 1), a saber, lise celular, tagmentação (fragmentação e inserção do adaptador por Tn5), purificação do DNA genômico, amplificação por PCR e análise de dados. Como um processo inicial, o tampão de lise celular (isolamento nuclear) deve ser primeiro otimizado para cada tipo de cé...

Discussão

ATAC-seq tem sido amplamente utilizado para mapear regiões de cromatina abertas e ativas. A progressão das células cancerígenas é frequentemente impulsionada por alterações genéticas e reprogramação epigenética, resultando em acessibilidade alterada da cromatina e expressão gênica. Um exemplo dessa reprogramação é visto durante a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e seu processo reverso, a transição mesenquimal-epitélica (MET), que são conhecidos por serem os principais processos de reprogramaç?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500	Natural
10 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-3810	Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tips	USA Scientific	1182-1830	Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-1840	Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352096
20 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1183-1810	Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1180-8810	Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge Tubes	Fisherbrand	06-443-19
Agarose	ThermoFisher Scientific	YBP136010	Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCC	ATCC
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman Coulter	364658	SX2415
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	Bead purification kit
CellDrop Cell Counter	DeNovix	CellDrop FL	Cell counter
EDTA	MilliporeSigma	EDS	BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTA	MilliporeSigma	E3889
Ethanol 100%	ThermoFisher Scientific	AC615100020	Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET Tested	R&D Systems	S10350	Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1x	ThermoFisher Scientific	11965092	[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1x	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1x	ThermoFisher Scientific	25200056	(0.25%), phenol red
Glycerol	IBI Scientific	56-81-5
Glycine	MilliporeSigma	G8898
HCl	MilliporeSigma	H1758
HEPES	MilliporeSigma	H3375
Invitrogen Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q32857
MgCl2	MilliporeSigma	M3634
MinElute PCR Purification kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
NaCl	IBI Scientific	7647-14-5
NaOH	MilliporeSigma	S8045	BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541
Nextera DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-121-1030	2x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)	MilliporeSigma	I8896	for molecular biology
PCR Detection System	BioRad	1855484	CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPES	MilliporeSigma	P1851	BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kit	ThermoFisher Scientific	Q32854	Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay Tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856	Invitrogen
SDS	MilliporeSigma	L3771
Sodium Acetate	Homemade	-	pH 5.2
Sucrose	IBI Scientific	57-50-1
SYBR Gold	ThermoFisher Scientific	S11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mL	BioRad	1708882
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips	USA Scientific	1402-4700	Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATE	USA Scientific	1438-4700	Single notch. Natural polypropylene
Tris Base	MilliporeSigma	648311	ULTROL Grade
Triton x-100	IBI Scientific	9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit	Illumina	PE-121-1003	paired-end
Trypan Blue Stain	ThermoFisher Scientific	Q32851
Tween-20	MilliporeSigma	P7949	BioXtra, viscous liquid
Water	MilliporeSigma	W3500	sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture