Optimisation ATAC-Seq pour la recherche en épigénétique du cancer

Résumé

ATAC-seq est une méthode de séquençage de l’ADN qui utilise la transposase mutante hyperactive, Tn5, pour cartographier les changements dans l’accessibilité de la chromatine médiés par des facteurs de transcription. ATAC-seq permet la découverte des mécanismes moléculaires sous-jacents aux altérations phénotypiques dans les cellules cancéreuses. Ce protocole décrit les procédures d’optimisation pour ATAC-seq dans les types de cellules épithéliales, y compris les cellules cancéreuses.

Résumé

Le test de chromatine accessible à la transposase avec séquençage à haut débit (ATAC-seq) sonde l’accessibilité de l’acide désoxyribonucléique (ADN) à l’aide de la transposase Tn5 hyperactive. Tn5 coupe et ligature les adaptateurs pour un séquençage à haut débit dans les régions de chromatine accessibles. Dans les cellules eucaryotes, l’ADN génomique est emballé dans la chromatine, un complexe d’ADN, d’histones et d’autres protéines, qui agit comme une barrière physique à la machinerie transcriptionnelle. En réponse aux signaux extrinsèques, les facteurs de transcription recrutent des complexes de remodelage de la chromatine pour permettre l’accès à la machinerie transcriptionnelle pour l’activation des gènes. Par conséquent, l’identification des régions ouvertes de la chromatine est utile lors de la surveillance des activités des amplificateurs et des promoteurs de gènes lors d’événements biologiques tels que la progression du cancer. Étant donné que ce protocole est facile à utiliser et nécessite peu d’entrée cellulaire, ATAC-seq a été largement adopté pour définir des régions de chromatine ouvertes dans divers types de cellules, y compris les cellules cancéreuses. Pour une acquisition de données réussie, plusieurs paramètres doivent être pris en compte lors de la préparation des bibliothèques ATAC-seq. Parmi eux, le choix du tampon de lyse cellulaire, le titrage de l’enzyme Tn5 et le volume de départ des cellules sont cruciaux pour la préparation de la bibliothèque ATAC-seq dans les cellules cancéreuses. L’optimisation est essentielle pour générer des données de haute qualité. Ici, nous fournissons une description détaillée des méthodes d’optimisation ATAC-seq pour les types de cellules épithéliales.

Introduction

L’accessibilité de la chromatine est une exigence clé pour la régulation de l’expression génique à l’échelle du génome¹. Les changements dans l’accessibilité de la chromatine sont fréquemment associés à plusieurs états pathologiques, y compris le cancer ^2,3,4. Au fil des ans, de nombreuses techniques ont été développées pour permettre aux chercheurs de sonder le paysage de la chromatine en cartographiant les régions d’accessibilité de la chromatine. Certains d’entre eux incluent DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)⁵, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)⁶, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)⁷, et l’objet de cet article, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)⁸. DNase-seq cartographie les régions accessibles en utilisant une caractéristique clé de DNase, à savoir la digestion préférentielle de l’ADN nu exempt d’histones et d’autres protéines telles que les facteurs de transcription⁵. FAIRE-seq, similaire à ChIP-seq, utilise la réticulation et la sonication du formaldéhyde, sauf qu’aucune immunoprécipitation n’est impliquée, et les régions exemptes de nucléosomes sont isolées par extraction phénol-chloroforme⁶. La méthode MAPit utilise une méthyltransférase GC pour sonder la structure de la chromatine à une résolution^de 7 molécule unique. ATAC-seq s’appuie sur la transposase hyperactive, Tn5⁸. La transposase Tn5 se lie préférentiellement aux régions de chromatine ouvertes et insère des adaptateurs de séquençage dans les régions accessibles. Tn5 fonctionne par un mécanisme de « copier-coller » médié par l’ADN, par lequel la transposase préchargée avec des adaptateurs se lie aux sites de chromatine ouverts, coupe l’ADN et ligature les adaptateurs⁸. Les régions liées à Tn5 sont récupérées par amplification PCR à l’aide d’amorces qui recuisent ces adaptateurs. FAIRE-seq et DNase-seq nécessitent une grande quantité de matériel de départ (~100 000 cellules à 225 000 cellules) et une étape de préparation de bibliothèque séparée avant le séquençage⁹. D’autre part, le protocole ATAC-seq est relativement simple et nécessite un petit nombre de cellules (<50 000 cellules)¹⁰. Contrairement aux techniques FAIRE-seq et DNase-seq, la préparation de la bibliothèque de séquençage d’ATAC-seq est relativement facile, car l’échantillon d’ADN isolé est déjà étiqueté avec les adaptateurs de séquençage par Tn5. Par conséquent, seule l’étape d’amplification PCR avec les amorces appropriées est nécessaire pour terminer la préparation de la bibliothèque, et les étapes de traitement préalables telles que la réparation finale et la ligature de l’adaptateur ne doivent pas être effectuées, ce qui permet de gagner du temps¹¹. Deuxièmement, ATAC-seq évite le besoin de conversion, de clonage et d’amplification du bisulfite avec des amorces spécifiques à la région requises pour MAPit⁷. En raison de ces avantages, ATAC-seq est devenu une méthode extrêmement populaire pour définir des régions de chromatine ouvertes. Bien que la méthode ATAC-seq soit simple, plusieurs étapes nécessitent une optimisation pour obtenir des données de haute qualité et reproductibles. Ce manuscrit traite des procédures d’optimisation pour la préparation de bibliothèques ATAC-seq standard, en mettant particulièrement l’accent sur trois paramètres: (1) la composition du tampon de lyse, (2) la concentration de la transposase Tn5 et (3) le nombre de cellules. En outre, cet article fournit des exemples de données sur les conditions d’optimisation utilisant des cellules épithéliales adhérentes cancéreuses et non cancéreuses.

Protocole

1. Préparatifs avant de commencer l’expérience

1. Préparer le stock tampon de lyse.
   REMARQUE: Le tampon d’isolation nucléaire optimal peut être différent pour chaque type de cellule. Nous recommandons de tester à la fois le tampon hypotonique utilisé dans l’article original⁸ et un tampon CSK^12,13 pour chaque type de cellule en utilisant une coloration au bleu trypan.
   1. Pour préparer un tampon hypotonique (tampon Greenleaf), mélanger 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 et 0,1% NP-40.
   2. Pour préparer le tampon CSK, mélanger 10 mM de PIPES pH 6,8, 100 mM de NaCl, 300 mM de saccharose, 3 mM de MgCl₂ et 0,1% de Triton X-100.
2. S’assurer que les conditions de culture cellulaire sont optimales; Examinez les cellules au microscope optique pour vous assurer qu’il n’y a pas de niveaux élevés d’apoptose.
3. Allumez la centrifugeuse pour la laisser atteindre 4 °C.

2. Récolte de cellules

1. Aspirer les milieux à partir d’une culture de cellules à <80% de confluence. Les cellules sont généralement cultivées dans une boîte de 35 mm ou 60 mm, en fonction du nombre de cellules nécessaires, des traitements, etc.
2. Lavez les cellules avec 1 mL ou 3 mL de PBS.
3. Ajouter 0,5 mL ou 1 mL de trypsine et incuber pendant 2-3 min (selon les types de cellules). Utilisez soigneusement une pipette de 1 mL pour bien mélanger.
4. Ajouter 1 mL ou 2 mL de média dans la plaque et bien mélanger. Transvaser dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger les cellules dans un tube de 15 mL pendant 3 min à 300 x g.
   REMARQUE: Un rotor de godet oscillant est recommandé pour minimiser la perte de cellule.
5. Aspirer le média et remettre les cellules en suspension dans 1 mL ou 2 mL de milieu.
   REMARQUE: Il est essentiel de préparer une solution unicellulaire homogène. Pour les tissus, un homogénéisateur Dounce peut être utilisé pour homogénéiser les tissus et minimiser les amas ou agrégats de grandes cellules. Certains tissus nécessitent une filtration (p. ex. crépines cellulaires) et/ou un tri cellulaire FACS pour isoler les cellules viables et obtenir une solution unicellulaire.
6. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
   REMARQUE : Dans cette étude, un compteur de cellules automatisé (Tableau des matériaux) a été utilisé.
7. Centrifuger le volume de cellules requis (p. ex., un volume contenant 1 x 10⁶ cellules en fonction du nombre de cellules) à 300 x g pendant 3 min à température ambiante (RT).
8. Remettez en suspension la pastille de cellule contenant 1 x 10⁶ cellules dans 1 mL de PBS froid.
   REMARQUE: Si le nombre de cellules est inférieur à 1 x 10 6 cellules, diminuer le volume de PBS froid pour préparer la solution cellulaire à la même concentration (1 x 10⁶ cellules / mL).

3. Lyse cellulaire

1. Transférer 25 μL (= 2,5 x 10⁴ cellules) dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 mL. Centrifuger pendant 5 min à 500 x g à 4 °C et jeter soigneusement le surnageant
   REMARQUE: Un rotor de godet oscillant est recommandé pour minimiser la perte de cellule. Laissez environ 3 μL de surnageant pour vous assurer que les cellules ne sont pas jetées.
2. Ajouter 25 μL de tampon de lyse et remettre les cellules en suspension en faisant un pipetage doux de haut en bas. Incuber sur glace pendant 5 min
3. Centrifuger pendant 5 min à 500 x g à 4 °C et jeter soigneusement le surnageant.
   REMARQUE: Un rotor de godet oscillant est recommandé pour minimiser la perte de cellule. Laissez environ 3 μL de surnageant pour vous assurer que les cellules ne sont pas jetées.

4. Étiquetage Tn5

1. Remettez immédiatement la pastille en suspension dans 25 μL de mélange réactionnel Tn5. Le mélange réactionnel Tn5 est le suivant : 12,5 μL de tampon ADN de tagmentation 2x (tampon TD), 1,25-5 μL de transposase Tn5 et 11,25-7,5 μL d’eau exempte de nucléase.
   NOTE: La concentration standard de Tn5 est de 2,5 μL pour 2,5 x 10⁴ cellules.
2. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
   REMARQUE: Mélanger la solution toutes les 10 minutes.

5. Purification de l’ADN

NOTE: Une purification est nécessaire avant l’amplification. La purification de l’ADN est effectuée à l’aide du kit de purification MinElute PCR (Table of Materials).

1. Ajouter 5 μL d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2).
2. Ajouter immédiatement 125 μL de Buffer PB et bien mélanger.
3. Suivez le protocole du kit de purification PCR à partir de l’étape 2.
   1. Placer la colonne d’essorage dans un tube de prélèvement de 2 mL.
   2. Appliquer l’échantillon sur la colonne de spin et centrifuger pendant 1 min à 17 900 x g à TA.
   3. Jetez l’écoulement continu et replacez la colonne de rotation dans le même tube de collecte.
   4. Ajouter 750 μL de Buffer PE à la colonne de spin et centrifuger pendant 1 min à 17 900 x g à TA.
   5. Jetez l’écoulement continu et replacez la colonne de rotation dans le même tube de collecte.
   6. Centrifuger la colonne de spin pendant 5 min pour sécher complètement la membrane.
   7. Jeter l’écoulement continu et placer la colonne d’essorage dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 mL.
   8. Éluer les fragments d’ADN avec 10 μL de Buffer EB.
   9. Laissez la colonne reposer pendant 1 min à RT.
   10. Centrifuger pendant 1 min à 17 900 x g à RT pour éluer l’ADN.

6. Amplification PCR

REMARQUE: L’amplification par PCR de l’ADN transposé (marqué) est nécessaire pour le séquençage. Les adaptateurs de kit Nextera (Table of Materials) ont été utilisés dans cet exemple. Les amorces utilisées dans cette étude sont énumérées au tableau 1.

1. Mettre en place la réaction PCR suivante dans des tubes PCR de 200 μL (50 μL pour chaque échantillon). Le mélange réactionnel PCR est le suivant : 10 μL d’ADN élué (étape 5.), 2,5 μL d’Adaptateur 25 mM 1, 2,5 μL d’Adaptateur 25 mM, 25 μL de 2x mélange maître PCR et 10 μL d’eau sans nucléase
2. Effectuer le programme d’amplification PCR partie 1 (Tableau 2).
   REMARQUE: Pour l’amplification initiale, les mêmes conditions sont utilisées pour tous les échantillons utilisant un cycleur thermique standard.
3. qPCR en temps réel (total de 14,5 μL par échantillon)
   1. En utilisant 5 μL du produit de la partie 1 de l’amplification PCR (étape 6.2.), configurez la réaction suivante, incluant cette fois l’or SYBR et la détection dans une machine de PCR en temps réel.
   2. Préparer le mélange réactionnel PCR comme suit : 5 μL de produit PCR de l’étape 6.2., 0,75 μL d’or SYBR (1000x dilué), 5 μL de 2x mélange maître PCR et 3,75 μL d’eau sans nucléase.
      REMARQUE : Les numéros de cycle précis pour l’amplification de la bibliothèque avant d’atteindre la saturation pour chaque échantillon sont déterminés par qPCR (tableau 3) afin de réduire le biais GC et de taille dans la PCR¹⁰. SYBR Gold a été dilué avec de l’eau sans nucléase. Pour fabriquer la solution diluée, 1 μL de SYBR Gold (concentration mère 10 000x) a été ajouté à 999 μL d’eau sans nucléase. La durée d’exécution de la RT-qPCR mentionnée dans le tableau 3 est d’environ 60 min.
4. Déterminez le nombre requis de cycles de PCR supplémentaires à l’aide des paramètres d’exécution de l’étape 6.3.
   1. Nombre de cycles = 1/4 d’intensité de fluorescence maximale (saturée) (généralement 3 ou 4 cycles de PCR)
5. Programme d’amplification par PCR partie 2 (volume = 45 μL; Tableau 4) : Une fois que vous avez déterminé le numéro de cycle, configurez les PCR avec des cycles supplémentaires calculés à l’étape 6.4.1. Par exemple, si le nombre de cycles calculé est 3, configurez 3 cycles dans le programme ci-dessous. Le nombre total de cycles serait de 8 (5 à l’étape 6.2., plus 3 cycles supplémentaires à l’étape 6.5).

7. Purification des perles

REMARQUE: Ici, des perles AMPure XP (Table of Materials) ont été utilisées.

1. Aux produits PCR amplifiés à l’étape précédente, ajouter 150 μL de billes à TA.
   REMARQUE: Les perles AMPure¹⁴ faites maison peuvent être utilisées dans ce processus.
2. Incuber pendant 15 min à TA.
3. Placez les tubes sur un support magnétique pendant 5 min.
4. Retirez délicatement le surnageant.
5. Lavez les billes avec 200 μL d’éthanol à 80 %.
   NOTE: L’éthanol à 80% doit être préparé frais.
6. Répétez l’étape 7.4.
7. Retirez complètement l’éthanol.
8. Sécher les échantillons à l’air libre pendant 10 min à TA.
9. Resuspendre avec 50 μL de tampon d’élution (10 mM Tris-HCL pH 8,0).
10. Répétez la purification des billes (étapes 7.1.-7.9.) pour minimiser davantage la contamination de l’apprêt.

8. Concentration de l’ADN et contrôle de la qualité

1. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un kit de quantification des acides nucléiques (Tableau des matériaux).
2. Vérifiez les fragments d’ADN amplifiés par électrophorèse sur gel à l’aide de SYBR Gold (0,5x TBE, gel d’agarose à 1,5%) ou d’un système d’électrophorèse automatisé (par exemple, TapeStation, bioanalyseur).

9. Séquençage

1. Effectuer un séquençage à haut débit à l’aide des échantillons d’ADN amplifiés^12,13.
   REMARQUE: Les échantillons d’ADN amplifiés sont prêts pour le séquençage à haut débit. Pour conserver les informations sur les fragments d’ADN nucléosomiques, le séquençage par paires est recommandé plutôt que le séquençage à une extrémité. Les deux extrémités des fragments d’ADN indiquent où la transposase se lie. Pour cartographier les régions de chromatine ouverte, 30 millions de lectures/échantillon sont généralement suffisantes.

10. Analyse des données

1. Filtrage des données basé sur la qualité des appels de base : définissez le score de qualité de base moyen minimum sur 20 (précision de 99 %).
2. Découpage de l’adaptateur : supprimez les séquences de l’adaptateur à l’aide d’un outil approprié.
   REMARQUE : L’outil wrapper Trim Galore (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) a été utilisé pour supprimer des séquences d’adaptateurs. Pour les bibliothèques ATAC-seq préparées par Illumina Tn5, la séquence suivante est utilisée comme séquence d’adaptateurs : CTGTCTCTTATACACATCT. La longueur de séquence minimale pour reconnaître la contamination de la carte est définie sur 5.
3. Cartographie du génome: Mappez les lectures au génome approprié avec Bowtie en utilisant les paramètres suivants « -I 0 -X 2000 -m 1"¹⁵. Voici un exemple de cartographie de la qualité des cellules cancéreuses basales du sein MDA-MB-231 :
   Lectures avec au moins un alignement signalé : 52,79 %
   Lectures qui n’ont pas réussi à s’aligner : 13,10 %
   Lectures avec alignements supprimés en raison de -m : 34,11 %
4. Déduplication : Marquez les doublons PCR par outils Picard¹⁶.
5. Génération d’un fichier de couverture génomique pour la visualisation des données : convertissez les lectures appariées dédupliquées en fragments de lecture à une extrémité. Les traces de couverture du génome sont obtenues à l’aide de genomeCoverageBed à partir d’outils de lit¹⁷.

Résultats

Pour obtenir des données ATAC-seq réussies et de haute qualité, il est important d’optimiser les conditions expérimentales. La préparation de la bibliothèque ATAC-seq peut être séparée en cinq étapes principales (Figure 1), à savoir la lyse cellulaire, le marquage (fragmentation et insertion de l’adaptateur par Tn5), la purification de l’ADN génomique, l’amplification par PCR et l’analyse des données. En tant que processus initial, le tampon de lyse cellulaire (isoleme...

Discussion

ATAC-seq a été largement utilisé pour cartographier les régions de chromatine ouvertes et actives. La progression des cellules cancéreuses est souvent provoquée par des altérations génétiques et une reprogrammation épigénétique, ce qui entraîne une altération de l’accessibilité de la chromatine et de l’expression des gènes. Un exemple de cette reprogrammation est observé au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et de son processus inverse, la transition mésenchymateuse-épithéli...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5500	Natural
10 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-3810	Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tips	USA Scientific	1182-1830	Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tips	USA Scientific	1120-1840	Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Corning	352096
20 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1183-1810	Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tips	USA Scientific	1180-8810	Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge Tubes	Fisherbrand	06-443-19
Agarose	ThermoFisher Scientific	YBP136010	Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCC	ATCC
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman Coulter	364658	SX2415
AMPure XP beads	Beckman Coulter	A63881	Bead purification kit
CellDrop Cell Counter	DeNovix	CellDrop FL	Cell counter
EDTA	MilliporeSigma	EDS	BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTA	MilliporeSigma	E3889
Ethanol 100%	ThermoFisher Scientific	AC615100020	Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET Tested	R&D Systems	S10350	Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1x	ThermoFisher Scientific	11965092	[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1x	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1x	ThermoFisher Scientific	25200056	(0.25%), phenol red
Glycerol	IBI Scientific	56-81-5
Glycine	MilliporeSigma	G8898
HCl	MilliporeSigma	H1758
HEPES	MilliporeSigma	H3375
Invitrogen Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q32857
MgCl2	MilliporeSigma	M3634
MinElute PCR Purification kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
NaCl	IBI Scientific	7647-14-5
NaOH	MilliporeSigma	S8045	BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	New England Biolabs	M0541
Nextera DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-121-1030	2x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)	MilliporeSigma	I8896	for molecular biology
PCR Detection System	BioRad	1855484	CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPES	MilliporeSigma	P1851	BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kit	ThermoFisher Scientific	Q32854	Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay Tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856	Invitrogen
SDS	MilliporeSigma	L3771
Sodium Acetate	Homemade	-	pH 5.2
Sucrose	IBI Scientific	57-50-1
SYBR Gold	ThermoFisher Scientific	S11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mL	BioRad	1708882
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube Strips	USA Scientific	1402-4700	Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATE	USA Scientific	1438-4700	Single notch. Natural polypropylene
Tris Base	MilliporeSigma	648311	ULTROL Grade
Triton x-100	IBI Scientific	9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer Kit	Illumina	PE-121-1003	paired-end
Trypan Blue Stain	ThermoFisher Scientific	Q32851
Tween-20	MilliporeSigma	P7949	BioXtra, viscous liquid
Water	MilliporeSigma	W3500	sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture