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  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

ATAC-seq es un método de secuenciación de ADN que utiliza la transposasa mutante hiperactiva, Tn5, para mapear los cambios en la accesibilidad de la cromatina mediada por factores de transcripción. ATAC-seq permite el descubrimiento de los mecanismos moleculares subyacentes a las alteraciones fenotípicas en las células cancerosas. Este protocolo describe los procedimientos de optimización para ATAC-seq en tipos de células epiteliales, incluidas las células cancerosas.

Resumen

El ensayo para la cromatina accesible a transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) sondea la accesibilidad del ácido desoxirribonucleico (ADN) utilizando la transposasa Tn5 hiperactiva. Tn5 corta y liga adaptadores para secuenciación de alto rendimiento dentro de regiones de cromatina accesibles. En las células eucariotas, el ADN genómico se empaqueta en cromatina, un complejo de ADN, histonas y otras proteínas, que actúa como una barrera física para la maquinaria transcripcional. En respuesta a las señales extrínsecas, los factores de transcripción reclutan complejos de remodelación de la cromatina para permitir el acceso a la maquinaria transcripcional para la activación génica. Por lo tanto, la identificación de regiones abiertas de cromatina es útil cuando se monitorean las actividades potenciadoras y promotoras de genes durante eventos biológicos como la progresión del cáncer. Dado que este protocolo es fácil de usar y tiene un bajo requerimiento de entrada celular, ATAC-seq ha sido ampliamente adoptado para definir regiones abiertas de cromatina en varios tipos de células, incluidas las células cancerosas. Para una adquisición de datos exitosa, se deben considerar varios parámetros al preparar bibliotecas ATAC-seq. Entre ellos, la elección del tampón de lisis celular, la titulación de la enzima Tn5 y el volumen inicial de células son cruciales para la preparación de la biblioteca ATAC-seq en células cancerosas. La optimización es esencial para generar datos de alta calidad. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de los métodos de optimización ATAC-seq para tipos de células epiteliales.

Introducción

La accesibilidad a la cromatina es un requisito clave para la regulación de la expresión génica a escala de todo el genoma1. Los cambios en la accesibilidad a la cromatina se asocian frecuentemente con varios estados de enfermedad, incluyendo el cáncer 2,3,4. A lo largo de los años, se han desarrollado numerosas técnicas para permitir a los investigadores sondear el paisaje de la cromatina mediante el mapeo de regiones de accesibilidad a la cromatina. Algunos de ellos incluyen DNase-seq (DNase I hypersensitive sites sequencing)5, FAIRE-seq (formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements)6, MAPit (methyltransferase accessibility protocol for individual templates)7, y el foco de este trabajo, ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin)8. DNase-seq mapea regiones accesibles empleando una característica clave de DNasa, a saber, la digestión preferencial de ADN desnudo libre de histonas y otras proteínas como los factores de transcripción5. FAIRE-seq, similar a ChIP-seq, utiliza reticulación y sonicación de formaldehído, excepto que no hay inmunoprecipitación involucrada, y las regiones libres de nucleosomas se aíslan por extracción de fenol-cloroformo6. El método MAPit utiliza una metiltransferasa GC para sondear la estructura de la cromatina a una resolución de molécula única7. ATAC-seq se basa en la transposasa hiperactiva, Tn58. La transposasa Tn5 se une preferentemente a regiones de cromatina abiertas e inserta adaptadores de secuenciación en regiones accesibles. Tn5 opera a través de un mecanismo de "cortar y pegar" mediado por ADN, mediante el cual la transposasa precargada con adaptadores se une a sitios abiertos de cromatina, corta el ADN y liga los adaptadores8. Las regiones unidas a Tn5 se recuperan mediante amplificación por PCR utilizando cebadores que se unen a estos adaptadores. FAIRE-seq y DNase-seq requieren una gran cantidad de material de partida (~ 100,000 celdas a 225,000 células) y un paso separado de preparación de la biblioteca antes de la secuenciación9. Por otro lado, el protocolo ATAC-seq es relativamente simple y requiere un pequeño número de celdas (<50.000 células)10. A diferencia de las técnicas FAIRE-seq y DNase-seq, la preparación de la biblioteca de secuenciación de ATAC-seq es relativamente fácil, ya que la muestra de ADN aislada ya está siendo etiquetada con los adaptadores de secuenciación por Tn5. Por lo tanto, solo se necesita el paso de amplificación por PCR con cebadores apropiados para completar la preparación de la biblioteca, y no es necesario realizar los pasos de procesamiento previos, como la reparación final y la ligadura del adaptador, ahorrando así tiempo11. En segundo lugar, ATAC-seq evita la necesidad de conversión, clonación y amplificación de bisulfito con cebadores específicos de la región requeridos para MAPit7. Debido a estas ventajas, ATAC-seq se ha convertido en un método muy popular para definir regiones de cromatina abierta. Aunque el método ATAC-seq es simple, varios pasos requieren optimización para obtener datos de alta calidad y reproducibles. Este manuscrito discute los procedimientos de optimización para la preparación estándar de la biblioteca ATAC-seq, destacando especialmente tres parámetros: (1) composición del tampón de lisis, (2) concentración de transposasa Tn5 y (3) número de células. Además, este documento proporciona datos de ejemplo de las condiciones de optimización utilizando células epiteliales adherentes cancerosas y no cancerosas.

Protocolo

1. Preparativos antes de comenzar el experimento

  1. Preparar la reserva reguladora de lisis.
    NOTA: El tampón de aislamiento nuclear óptimo puede ser diferente para cada tipo de célula. Recomendamos probar tanto el tampón hipotónico utilizado en el artículo original8 como un tampón CSK12,13 para cada tipo de célula utilizando tinción de azul de tripano.
    1. Para preparar tampón hipotónico (tampón de hoja verde), mezclar 10 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 y 0.1% NP-40.
    2. Para preparar tampón CSK, mezcle 10 mM PIPES pH 6.8, 100 mM NaCl, 300 mM sacarosa, 3 mM MgCl2 y 0.1% Triton X-100.
  2. Asegurar que las condiciones de cultivo celular sean óptimas; Examine las células bajo un microscopio óptico para asegurarse de que no haya niveles elevados de apoptosis.
  3. Encienda la centrífuga para que alcance los 4 °C.

2. Recolección de células

  1. Aspirar medios de un cultivo de células a <80% de confluencia. Las células se cultivan típicamente en un plato de 35 mm o 60 mm, según el número de células necesarias, tratamientos, etc.
  2. Lave las células con 1 ml o 3 ml de PBS.
  3. Añadir 0,5 ml o 1 ml de tripsina e incubar durante 2-3 min (dependiendo de los tipos de células). Use cuidadosamente una pipeta de 1 ml para mezclar bien.
  4. Agregue 1 ml o 2 ml de medios al plato y mezcle bien. Transfiera a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar las células en un tubo de 15 ml durante 3 min a 300 x g.
    NOTA: Se recomienda un rotor de cangilón oscilante para minimizar la pérdida de celda.
  5. Aspirar el medio y resuspender las células en 1 mL o 2 mL de medio.
    NOTA: Es fundamental preparar una solución monocelular homogénea. Para los tejidos, se puede usar un homogeneizador Dounce para homogeneizar tejidos y minimizar grupos o agregados de células grandes. Algunos tejidos requieren filtración (por ejemplo, filtros celulares) y/o clasificación celular FACS para aislar células viables y obtener una solución de una sola célula.
  6. Cuente las celdas con un contador de celdas.
    NOTA: En este estudio, se utilizó un contador celular automatizado (Tabla de Materiales).
  7. Centrifugar el volumen celular requerido (por ejemplo, un volumen que contenga 1 x 106 células basado en el recuento de células) a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente (RT).
  8. Resuspender el pellet celular que contiene 1 x 106 células en 1 ml de PBS frío.
    NOTA: Si el número de células es inferior a 1 x 10 6 células, disminuya el volumen de PBS frío para preparar la solución celular a la misma concentración (1 x 106 células/ml).

3. Lisis celular

  1. Transfiera 25 μL (= 2,5 x 104 células) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C y desechar con cuidado el sobrenadante
    NOTA: Se recomienda un rotor de cangilón oscilante para minimizar la pérdida de celda. Deje aproximadamente 3 μL de sobrenadante para asegurarse de que las células no se descarten.
  2. Añadir 25 μL de tampón de lisis y resuspender las células pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar en hielo durante 5 min
  3. Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C y desechar con cuidado el sobrenadante.
    NOTA: Se recomienda un rotor de cangilón oscilante para minimizar la pérdida de celda. Deje aproximadamente 3 μL de sobrenadante para asegurarse de que las células no se descarten.

4. Etiquetado Tn5

  1. Resuspender inmediatamente el pellet en 25 μL de mezcla de reacción Tn5. La mezcla de reacción Tn5 es la siguiente: 12,5 μL de 2x tampón de ADN de etiquetado (tampón TD), 1,25-5 μL de transposasa Tn5 y 11,25-7,5 μL de agua libre de nucleasa.
    NOTA: La concentración estándar de Tn5 es de 2,5 μL para 2,5 x 104 células.
  2. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    NOTA: Mezcle la solución cada 10 min.

5. Purificación del ADN

NOTA: Se requiere purificación antes de la amplificación. La purificación del ADN se realiza utilizando el kit de purificación MinElute PCR (Tabla de materiales).

  1. Añadir 5 μL de acetato de sodio 3 M (pH 5.2).
  2. Añadir inmediatamente 125 μL de Buffer PB y mezclar bien.
  3. Siga el protocolo del kit de purificación de PCR a partir del paso 2.
    1. Coloque la columna de centrifugado en un tubo de recolección de 2 ml.
    2. Aplicar la muestra a la columna de centrifugado y centrifugar durante 1 min a 17.900 x g a RT.
    3. Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna de centrifugado en el mismo tubo de recolección.
    4. Agregue 750 μL de PE tampón a la columna de centrifugado y centrífugo durante 1 min a 17,900 x g a RT.
    5. Deseche el flujo y vuelva a colocar la columna de centrifugado en el mismo tubo de recolección.
    6. Centrifugar la columna de centrifugado durante 5 minutos para secar completamente la membrana.
    7. Deseche el flujo y coloque la columna de centrifugado en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,7 ml.
    8. Eluya los fragmentos de ADN con 10 μL de tampón EB.
    9. Deje que la columna repose durante 1 minuto en RT.
    10. Centrifugar durante 1 min a 17.900 x g a RT para eluyir el ADN.

6. Amplificación por PCR

NOTA: La amplificación por PCR de los ADN transpuestos (etiquetados) es necesaria para la secuenciación. En este ejemplo se utilizaron adaptadores de kit Nextera (Tabla de materiales). Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1.

  1. Configure la siguiente reacción de PCR en tubos de PCR de 200 μL (50 μL para cada muestra). La mezcla de reacción de PCR es la siguiente: 10 μL de ADN eluyido (paso 5.), 2,5 μL de 25 mM Adaptador 1, 2,5 μL de 25 mM Adaptador 2, 25 μL de 2x mezcla maestra de PCR y 10 μL de agua libre de nucleasa
  2. Realizar el programa de amplificación por PCR parte 1 (Tabla 2).
    NOTA: Para la amplificación inicial, se utilizan las mismas condiciones para todas las muestras que utilizan un termociclador estándar.
  3. QPCR en tiempo real (total de 14,5 μL por muestra)
    1. Utilizando 5 μL del producto de la parte 1 de la amplificación por PCR (paso 6.2.), configure la siguiente reacción, esta vez incluyendo oro SYBR y detección en una máquina de PCR en tiempo real.
    2. Prepare la mezcla de reacción de PCR de la siguiente manera: 5 μL de producto de PCR del paso 6.2., 0,75 μL de oro SYBR (1000x diluido), 5 μL de 2x mezcla maestra de PCR y 3,75 μL de agua libre de nucleasa.
      NOTA: Los números de ciclo precisos para la amplificación de la biblioteca antes de alcanzar la saturación para cada muestra se determinan mediante qPCR (Tabla 3) para reducir el GC y el sesgo de tamaño en la PCR10. SYBR Gold se diluyó con agua libre de nucleasas. Para hacer la solución diluida, se agregó 1 μL de SYBR Gold (concentración madre 10,000x) a 999 μL de agua libre de nucleasa. El tiempo de ejecución de la RT-qPCR mencionada en la Tabla 3 es de aproximadamente 60 min.
  4. Determine el número requerido de ciclos de PCR adicionales utilizando los parámetros de ejecución del paso 6.3.
    1. Número de ciclos = 1/4 de intensidad de fluorescencia máxima (saturada) (típicamente 3 o 4 ciclos de PCR)
  5. Programa de amplificación por PCR parte 2 (volumen = 45 μL; Tabla 4): Una vez que determine el número de ciclo, configure PCR con ciclos adicionales calculados en el paso 6.4.1. Por ejemplo, si el número de ciclo calculado es 3, configure 3 ciclos en el programa siguiente. El total de ciclos sería 8 (5 en el paso 6.2., más 3 ciclos adicionales en el paso 6.5).

7. Purificación de perlas

NOTA: Aquí se utilizaron cuentas AMPure XP (Tabla de materiales).

  1. A los productos de PCR amplificados en el paso anterior, agregue 150 μL de perlas en RT.
    NOTA: Las perlas caserasAMPure 14 se pueden utilizar en este proceso.
  2. Incubar durante 15 min en RT.
  3. Coloque los tubos en un soporte magnético durante 5 minutos.
  4. Retire con cuidado el sobrenadante.
  5. Lave las perlas con 200 μL de etanol al 80%.
    NOTA: El etanol al 80% debe prepararse fresco.
  6. Repita el paso 7.4.
  7. Retire el etanol por completo.
  8. Seque al aire las muestras durante 10 minutos en RT.
  9. Resuspender con 50 μL de tampón de elución (10 mM Tris-HCL pH 8.0).
  10. Repita la purificación de las perlas (pasos 7.1.-7.9.) para minimizar aún más la contaminación de la imprimación.

8. Concentración de ADN y control de calidad

  1. Mida la concentración de ADN utilizando un kit de cuantificación de ácidos nucleicos (Tabla de materiales).
  2. Verifique los fragmentos de ADN amplificados mediante electroforesis en gel utilizando SYBR Gold (0.5x TBE, gel de agarosa al 1.5%) o un sistema de electroforesis automatizado (por ejemplo, TapeStation, bioanalizador).

9. Secuenciación

  1. Realizar secuenciación de alto rendimiento utilizando las muestras de ADN amplificadas12,13.
    NOTA: Las muestras de ADN amplificadas están listas para la secuenciación de alto rendimiento. Para retener la información del fragmento de ADN nucleosomal, se recomienda la secuenciación de extremo pareado sobre la secuenciación de un solo extremo. Ambos extremos de los fragmentos de ADN indican dónde se une la transposasa. Para mapear regiones de cromatina abierta, 30 millones de lecturas/muestra suelen ser suficientes.

10. Análisis de datos

  1. Filtrado de datos basado en la calidad de llamada base: establezca la puntuación de calidad base promedio mínima en 20 (99% de precisión).
  2. Recorte del adaptador: extraiga las secuencias del adaptador con una herramienta adecuada.
    NOTA: La herramienta Trim Galore wrapper (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) se utilizó para quitar secuencias de adaptadores. Para las bibliotecas ATAC-seq preparadas por Illumina Tn5, se utiliza la siguiente secuencia como secuencia adaptadora: CTGTCTCTTATACACATCT. La longitud mínima de secuencia para reconocer la contaminación del adaptador se establece en 5.
  3. Mapeo del genoma: Asigne las lecturas al genoma apropiado con Bowtie usando los siguientes parámetros "-I 0 -X 2000 -m 1"15. A continuación se muestra un ejemplo de mapeo de la calidad de las células basales de cáncer de mama MDA-MB-231:
    Lecturas con al menos una alineación reportada: 52.79%
    Lecturas que no se alinearon: 13.10%
    Lecturas con alineaciones suprimidas debido a -m: 34.11%
  4. Deduplicación: Marque los duplicados de PCR con las herramientas Picard16.
  5. Generación de un archivo de cobertura del genoma para la visualización de datos: convierta las lecturas de extremo emparejado deduplicadas en fragmentos de lectura de un solo extremo. Las pistas de cobertura del genoma se obtienen utilizando genomeCoverageBed de bedtools17.

Resultados

Para obtener datos ATAC-seq exitosos y de alta calidad, es importante optimizar las condiciones experimentales. La preparación de la biblioteca ATAC-seq se puede separar en los cinco pasos principales (Figura 1), a saber, lisis celular, etiquetado (fragmentación e inserción del adaptador por Tn5), purificación genómica del ADN, amplificación por PCR y análisis de datos. Como proceso inicial, el tampón de lisis celular (aislamiento nuclear) debe optimizarse primero para cada tipo de c...

Discusión

ATAC-seq ha sido ampliamente utilizado para mapear regiones de cromatina abiertas y activas. La progresión de las células cancerosas es frecuentemente impulsada por alteraciones genéticas y reprogramación epigenética, lo que resulta en una alteración de la accesibilidad a la cromatina y la expresión génica. Un ejemplo de esta reprogramación se observa durante la transición epitelial-mesenquimal (EMT) y su proceso inverso, la transición mesenquimal a epitelial (MET), que se sabe que son procesos clave de reprog...

Divulgaciones

Los autores declaran que no hay intereses financieros relevantes o materiales que se relacionen con la investigación descrita en este documento.

Agradecimientos

Agradecemos a la instalación UND Genomics Core por su excelente asistencia técnica.

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud [P20GM104360 a M.T., P20 GM104360 a A.D.] y los fondos iniciales proporcionados por la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud de la Universidad de Dakota del Norte, Departamento de Ciencias Biomédicas [a M.T.].

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5500Natural
10 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-3810Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne RPT tipsUSA Scientific1182-1830Filtered and low-retention
100 µL XL TipOne tipsUSA Scientific1120-1840Filtered and low-retention. Beveled Grade
15 mL Conical Centrifuge TubesCorning352096
20 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1183-1810Filtered and low-retention
200 µL TipOne RPT tipsUSA Scientific1180-8810Filtered and low-retention
50 mL Centrifuge TubesFisherbrand06-443-19
AgaroseThermoFisher ScientificYBP136010Genetic Analysis Grade
All the cell lines used in this study are obtained from ATCCATCC
Allegra X-30R CentrifugeBeckman Coulter364658SX2415
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881Bead purification kit
CellDrop Cell CounterDeNovixCellDrop FLCell counter
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra, anhydrous, ≥99% (titration)
EGTAMilliporeSigmaE3889
Ethanol 100%ThermoFisher ScientificAC615100020Anhydrous; Fisher Scientific - Decon Labs Sterilization Products
Fetal Bovine Serum - TET TestedR&D SystemsS10350Triple 0.1 µm filtered
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4.5 g/L D-glucose; [+] L-Glutamine; [-] Sodium pyruvate
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0.25%), phenol red
GlycerolIBI Scientific56-81-5
GlycineMilliporeSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit FluorometerThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR Purification kitQiagen28004DNA purification kit
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHMilliporeSigmaS8045BioXtra, ≥98% (acidimetric), pellets (anhydrous)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-121-10302x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896for molecular biology
PCR Detection SystemBioRad1855484CFX384 Real-Time System. C1000 Touch Thermal Cycler
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kitThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen; Nucleic acid quantitation kit
Quibit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
Sodium AcetateHomemade-pH 5.2
SucroseIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR Green Supermix, 1.25 mLBioRad1708882
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-4700Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700Single notch. Natural polypropylene
Tris BaseMilliporeSigma648311ULTROL Grade
Triton x-100IBI Scientific9002-93-1
TrueSeq Dual Index Sequencing Primer KitIlluminaPE-121-1003paired-end
Trypan Blue StainThermoFisher ScientificQ32851
Tween-20MilliporeSigmaP7949BioXtra, viscous liquid
WaterMilliporeSigmaW3500sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture

Referencias

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